本发明涉及淫羊藿来源半乳糖基转移酶及其在制备金丝桃苷中的应用，属于基因工程及生物医药技术领域。
背景技术：
金丝桃苷(槲皮素-3-o-半乳糖苷，hyperoside)是一种黄酮醇苷类化合物，最早从茱萸中分离获得，是一种重要的植物天然产物。其广泛存在于唇形科、金丝桃科、蔷薇科、桔梗科、豆科等多种植物中，但是单株植物的相对含量较低。金丝桃苷具有优异的生物学功能，发挥多种药理活性，包括抗炎症、抗抑郁、减少脑缺血损伤、抑制肿瘤、保护心肌等作用。金丝桃苷是多种中药材制剂的重要成分，例如通脉刺五加胶囊、心安胶囊、心血宁滴丸、郁可欣胶囊等多种单味或复方中药制剂中，均有测得相对含量较高的金丝桃苷。传统的金丝桃苷的提取方式多为植物抽提法，受到季节、产地、气候等诸多因素影响，具有药材产量不稳定，品质不均一等缺陷。此外，在抽提过程中，需要消耗大量的水以及酒精，同时也会产生生物废水废渣，对环境产生巨大的压力。
随着合成生物学的不断发展，越来越多的天然产物能够通过微生物进行合成，或者通过微生物进行关键步骤的催化，将廉价易得的天然产物转化成不易获得的高附加值产品。金丝桃苷可以看做是利用槲皮素作为底物，进行3位的o-半乳糖基化修饰获得。市场上，98％纯度的槲皮素价格约每千克300元，而同样98％纯度的金丝桃苷价格高达每千克约2500元，是槲皮素价格的8倍多，并且槲皮素提取手段更环保，产量巨大。此外，与槲皮素相比，金丝桃苷具有更优异的生物活性以及更好的水溶性。因此，利用微生物活性表达关键酶，进行全细胞催化生产金丝桃苷，具有极高的经济价值以及技术可行性。
半乳糖苷转移酶是一种特异性催化udp-半乳糖转移至特定糖基受体的糖基转移酶。半乳糖苷转移酶具有很强的受体分子选择性以及催化位点特异性。淫羊藿的提取物中，有较大含量的半乳糖基化修饰的黄酮类天然产物，表明淫羊藿中存在活性较好的黄酮半乳糖苷转移酶。但是，淫羊藿来源的催化黄酮3位进行o-半乳糖基化的糖基转移酶尚未有报道，也没有利用相关酶进行酶法催化合成金丝桃苷的文章。
综上，将淫羊藿中挖掘获得的具有高度专一性以及强催化效率的半乳糖基转移酶，利用酿酒酵母表达，进行全细胞催化槲皮素转化生成金丝桃苷，是一种高效环保的金丝桃苷制备方法，具有巨大的生产应用潜力。
技术实现要素：
本发明筛选了植物来源的新的糖基转移酶，将其在酿酒酵母中进行表达，构建获得重组酿酒酵母，并将筛选的糖基转移酶及表达该酶的酿酒酵母用于黄酮类化合物的制备，有助于实现食品级黄酮类化合物的工业化生产。
本发明的第一个目的是提供植物来源的糖基转移酶，其具有如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由seqidno.1～3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
在一种实施方式中，所述糖基转移酶为半乳糖苷转移酶，来源于朝鲜淫羊藿，其氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述糖基转移酶的基因。
在一种实施方式中，所述基因如(a)或(b)：
(a)如seqidno.4～6任一所示的dna分子；
(b)在严格条件下与(a)限定的dna序列杂交且编码具有糖基转移酶活性的蛋白质的dan分子。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于py13系列载体，例如py14、py15、py16，或py26、prs423、prs424、prs425、prs426、pyes2等载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述糖基转移酶的微生物。
在一种实施方式中，所述微生物为重组酿酒酵母。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母c800为宿主。
本发明的第五个目的是提供上述重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从淫羊藿转录组样本扩增半乳糖基转移酶基因序列；
(2)将步骤(1)获得的半乳糖基转移酶基因序列与表达载体连接，获得重组质粒py13-galt；
(3)将步骤(2)构建的重组质粒py13-galt转化至酿酒酵母中。
本发明的第六个目的是提供所述糖基转移酶或所述重组酿酒酵母在催化合成黄酮类化合物方面的应用。
在一种实施方式中，所述黄酮类化合物包括但不限于金丝桃苷、三叶豆苷、异鼠李素3-o-半乳糖苷、杨梅素-3-o-半乳糖苷、飞燕草素-3-o-半乳糖苷、矮牵牛素-3-o-半乳糖苷、芍药素-3-o-半乳糖苷、锦葵色素-3-o-半乳糖苷以及丁香亭-3-o-半乳糖苷。
在一种实施方式中，所述应用是催化槲皮素合成金丝桃苷。
在一种实施方式中，所述应用是催化山奈酚合成三叶豆苷。
本发明的第六个目的是提供所述半乳糖苷转移酶或所述重组酿酒酵母在催化杨梅素半乳糖基化、催化杨梅素半乳糖基化、催化二氢槲皮素半乳糖基化、催化二氢山奈酚半乳糖基化、催化二氢杨梅素半乳糖基化、催化非瑟酮半乳糖基化、催化桑色素半乳糖基化或催化淫羊藿素半乳糖基化中的应用。
在一种实施方式中，所述催化是将所述半乳糖基转移酶以0.5～1.5u/g底物的剂量对底物进行酶解，酶解在28～35℃进行。
在一种实施方式中，所述催化是将所述半乳糖基转移酶以1.3u/g底物的剂量对底物进行酶解。
在一种实施方式中，所述催化是将所述重组酿酒酵母以0.1～1.2g湿菌体/g底物的剂量对底物进行酶解，酶解28～35℃进行。
在一种实施方式中，所述催化是将所述重组酿酒酵母以1.16g湿菌体/g底物的剂量对底物进行酶解。
本发明还要求保护所述糖基转移酶及其酶制剂，或所述重组酿酒酵母及其微生物制剂在食品、生物、医药领域制备黄酮类化合物方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过将编码半乳糖苷转移酶的基因序列连接至酿酒酵母表达载体py13，在tef1启动子的作用下，在酿酒酵母c800中进行表达，获得的重组酿酒酵母用于黄酮类黄酮类化合物的合成，能够在不添加udp糖基供体的情况下，全细胞转化100mg/l槲皮素生成125.6mg/l金丝桃苷，摩尔转化率为81.7％，重组酿酒酵母转化100mg/l山奈酚生成130.9mg/l三叶豆苷，摩尔转化率为83.5％。
附图说明
图1：淫羊藿半乳糖基转移酶挖掘及其催化槲皮素合成金丝桃苷。
图2：重组半乳糖基转移酶表达酿酒酵母催化槲皮素合成金丝桃苷hplc结果。
图3：重组半乳糖基转移酶表达酿酒酵母催化山奈酚合成三叶豆苷。
图4：重组半乳糖基转移酶催化9种黄酮底物相对活性。
图5：重组葡萄糖基转移酶表达酿酒酵母催化山奈酚合成紫云英苷。
图6：重组鼠李糖基转移酶表达酿酒酵母催化山奈酚合成阿福豆苷。
具体实施方式
(一)培养基
lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。加入20g/l琼脂条，以配制lb固体培养基。
ypd培养基：蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，葡萄糖20g/l。
sd培养基：ynb酵母氮碱6.74g/l，葡萄糖20g/l，组氨酸5g/l，色氨酸5g/l，亮氨酸5g/l，尿嘧啶5g/l。对应缺陷型筛选时，缺失相应的氨基酸。
(二)槲皮素、山奈酚、三叶豆苷以及金丝桃苷测定：采用shimadzu高效液相色谱进行测定。lc条件：色谱柱，thermohypersilods-2column；流动相a，含有1‰甲酸的超纯水；流动相b，含有1‰甲酸的乙腈；流动相比例条件，0-10min，10-40％b，10-30min，40-80％b，30-35min，80-80％b，35-37min，80-10％b，37-40min，10-10％b；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；检测器：紫外检测器a290。
实施例1朝鲜淫羊藿来源半乳糖基转移酶基因克隆
采摘新鲜朝鲜淫羊藿植株，用去离子水冲洗两遍，去除附着泥土及微生物。按照根、茎、叶、花将各不同组织进行分离，液氮速冻存于液氮罐。按照trizol法，对不同组织进行总rna提取，使用快速cdna反转录试剂盒进行cdna的合成。将cdna稀释至合适的浓度(50-100ng/μl)，以稀释的cdna作为模板，使用上游引物galt-f：atgggaaccaaccaacaa，下游引物galt-r：tcagcagctagtgattatc，pcr扩增目的序列，获得如seqidno.4所示的基因序列。将获得的片段与t载体连接，转化大肠杆菌jm109，挑取阳性克隆送测序。
实施例2重组半乳糖基转移酶表达载体及重组酿酒酵母的构建
挑取测序正确的阳性克隆，以其作为模板，使用上游引物py13-galt-f：cccccgggctgcaggaattcatgggaaccaaccaacaa，下游py13-galt-r：tacatgactcgaggtcgactcagcagctagtgattatc，对半乳糖基转移酶进行扩增，将载体py13进行spei以及sali双酶切，分别对扩增产物和酶切载体进行产物纯化，利用一步克隆试剂盒构建载体py13-galt，转化大肠杆菌jm109。挑取阳性克隆，测序正确后，提取质粒。按照酵母遗传学方法实验指南，将质粒py13-galt转化至酿酒酵母c800，涂布于sd-his进行阳性克隆筛选，构建酿酒酵母y-galt。对重组酵母的酶活进行测定，结果显示，酶活为1.12u/g湿菌体。
实施例3重组酿酒酵母催化合成金丝桃苷
将实施例2构建的重组半乳糖苷转移酶表达酿酒酵母y-galt在sd-his培养基上划线，挑取单菌落转接入ypd培养基，30℃220rpm培养18h。转接入新鲜的25mlypd培养基，控制初始od600值为2.0，于30℃220rpm的条件下进行培养。24h后，培养物od600值约为50.0，向培养物中加入槲皮素，使培养体系中的槲皮素终浓度为100mg/l，继续培养。发酵培养120h后，收集培养物，通过hpcl测定金丝桃苷含量为125.6mg/l(图2)。
实施例4重组酿酒酵母催化合成三叶豆苷
将实施例2构建的重组酿酒酵母y-galt在sd-his培养基上划线，挑取单菌落转接入ypd培养基，30℃220rpm培养18h。分别等量转接入2组新鲜的25mlypd培养基中，控制初始od600值为2.0，于30℃220rpm的条件下进行培养。其中一组于24h后，向培养物中加入山奈酚，使山奈酚在培养体系下的终浓度为100mg/l，继续培养。另一组参照终浓度100mg/l的山奈酚添加量，将山奈酚母液添加体积平均分成四份，按每24h加入一份。120h后，收集培养物，分别用hplc测定其中三叶豆苷含量，计算转化率。结果表明，在不需要额外添加udp糖基供体的情况下，分批添加山奈酚培养144h后的重组菌能够将100mg/l的山奈酚转化为130.9mg/l的三叶豆苷，摩尔转化率为83.5％，另一组的产量为71.4mg/l，转化率为45.6％(图3)。
实施例5重组淫羊藿半乳糖基转移酶催化不同底物
将实施例2构建的重组酿酒酵母y-galt在sd-his培养基上划线，挑取单菌落转接入ypd培养基，30℃220rpm培养18h。分为九组，分别等量转接入9组新鲜的25mlypd培养基中，控制初始od600值为2.0，于30℃220rpm的条件下进行培养。24h后，分别加入山奈酚、槲皮素、杨梅素、二氢山奈酚、圣草酚、二氢杨梅素、非瑟酮、桑色素以及脱水淫羊藿素，使各物质在培养体系中的终浓度均为100mg/l。培养至96h，收集培养物，测定加入底物剩余，以山奈酚为100％，计算不同底物的相对催化活性，山奈酚、槲皮素、杨梅素、二氢山奈酚、圣草酚、二氢杨梅素、非瑟酮、桑色素以及脱水淫羊藿素的相对催化活性分别为100％、120.1％、122.7％、77.9％、116.0％、125.3％、96.4％、129.6％以及58.2％(图4)。
实施例6淫羊藿来源的葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达载体及重组酿酒酵母的构建
按照实施例1的方法扩增淫羊藿转录组的另一个葡萄糖基转移酶基因，其核苷酸序列如seqidno.5所示。按照实施例2相同的方法在酿酒酵母中表达该基因，将构建的重组酿酒酵母菌株命名为y-glut。
将重组酿酒酵母菌株y-glut按照实施例4的方法进行发酵培养，将其与半乳糖基转移酶进行对比，培养144h的重组酿酒酵母y-glut催化效率为8.6％，产量为13.5mg/l(图5)。
实施例7重组鼠李糖基转移酶基因表达载体及重组酿酒酵母的构建
按照实施例1的方法扩增淫羊藿转录组的另一个鼠李糖基转移酶基因，其核苷酸序列如seqidno.6所示，按照实施例2相同的方法在酿酒酵母中表达该基因，将构建的重组酿酒酵母菌株命名为y-rhat。
将重组酿酒酵母菌株y-rhat按照实施例4的方法进行发酵培养，将其与半乳糖基转移酶进行对比，培养144h的酵母菌株y-rhat催化效率为3.7％，产量为5.6mg/l(图6)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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