一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用的制作方法

本发明涉及生物农药技术领域，特别是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。

背景技术：

贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)是一种革兰氏阳性菌，存在于植物根际、土壤、植物内部、河流等各种生态环境，该菌对促进植物生长、抑制病原菌、提高其抗病虫和诱导植物产生抗病性等方面都有重要作用。它能抑制多种植物病原菌，防治多种病害，如棉花黄萎病、棉花枯萎病、番茄灰斑病、烟草黑胫病、水稻纹枯病等，产生抗菌蛋白、脂肽类等多种抗生素来抵制病原菌，分泌iaa等物质促进植物根部系统发育和营养物质的摄取，促进植物生长，提高植物抗性。芽孢杆菌对人畜无不良影响，无致病性，且对环境无害，是一种新型的生防菌。

目前，对玉米穗腐病的研究报道很多，病原菌主要是禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)和轮枝镰孢菌(fusariumverticillioides)等引起。穗腐病主要发生在玉米生长后期，不仅导致玉米减产，其病原菌产生的伏马毒素(fumonisins)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,don)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)、黄曲霉毒素(aflatoxin，aft)等严重影响玉米质量，引发人畜的多种严重疾病，严重者甚至导致死亡。

麦类赤霉病在我国主要发生在长江中下游冬麦区、东北春麦区东部及华南冬麦区，近年来随着气候和耕作制度的变化，流行区域不断扩大，目前已经扩大到黄淮海麦区。我国麦类赤霉病(fusariumscab)主要是由禾谷镰孢菌和亚洲镰孢菌(f.asiaticum)引起的，是影响小麦产量的一个主要因素，其中，黄淮流域及以北地区以禾谷镰孢菌为主，长江中下游地区以亚洲镰孢菌为主(中国冬小麦主产区小麦赤霉病菌种群组成及其致病力[j]，胡迎春等，江苏农业学报，2010，26(5)：954-960)。感病后的麦穗不仅籽粒皱缩，品质下降，而且病菌产生的包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇在内的多种单端孢霉烯族毒素可破坏人和动物的免疫系统，还有致癌、致畸的作用，严重威胁人畜的健康安全。

由此可见，以上两种病害中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主要致病毒素，如何降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇成为减少毒素对人体危害的关键。

目前有关于降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的发明专利申请，比如一种降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法(cn102406100a)、枯草芽孢杆菌在降解真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用(cn101412976a)和枯草芽孢杆菌zdy1982在降解真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用(cn102178128a)，分别介绍了地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的降解效果。有研究报道假单胞杆菌、德沃斯氏菌、绿脓杆菌、阴沟肠杆菌、塔宾曲霉能不同程度地降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的筛选与鉴定[j]，程亮等，粮油食品科技，2013，21(5)：95-97；脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的分离和鉴定[j]，徐剑宏等，中国农业科学，2010，43(22)：4635-4641；降解don毒素的绿脓杆菌的分离、鉴定及其在玉米脱毒中的应用[j]，付苗苗等，河南工业大学学报(自然科学版)，2019，40(1)：38-43；生物降解呕吐毒素的肠杆菌筛选与鉴定[j]，李晓凤等，现代食品科技，2017，33(6)：125-132；一株降解don毒素真菌的鉴定及其生理特性研究[j]，张爱华等，微生物学杂志，2008，28(5)：16-20)。但目前还没有贝莱斯芽孢杆菌兼具防治禾谷镰孢菌引起的玉米穗腐病和小麦赤霉病并能高效降解禾谷镰孢菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的生物农药制剂用于防治禾谷镰孢菌侵染引起的玉米穗腐病和小麦赤霉病。可用于玉米大喇叭口期、抽丝期、乳熟期针对玉米穗部或小麦扬花期针对小麦穗部喷施，可操作性强，制剂的性质和稳定性好。

本发明的一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用技术方案为，所述的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis),保藏编号为：cgmccno：18935，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期：2019年11月11日，分类命名是贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensis，参据微生物(株)：tp。

所述的贝莱斯芽孢杆菌在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。

所述的贝莱斯芽孢杆菌在防治镰孢菌引起的玉米穗腐病和小麦赤霉病中的应用。

所述的镰孢菌是禾谷镰孢菌。

在植物生长过程中即玉米大喇叭口期、抽丝期、乳熟期或小麦扬花期采用喷雾处理；所述喷雾为所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的生物农药制剂。

一种生物农药制剂，含有所述的贝莱斯芽孢杆菌，剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

所述的生物农药制剂中含有所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液。

所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液制备方法为，将贝莱斯芽孢杆菌tp接种到培养液中，30℃180rpm培养72h，得到发酵液。

将所述发酵液，用无菌水稀释至浓度为2.00×10⁹cfu/ml，加入10％载体硅藻土，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，24h后室温干燥，加入4％稳定剂羧甲基纤维素钠、7％分散剂聚乙烯醇、3.5％湿润剂吐温80、0.5％黄原胶混合，气流粉碎机粉碎，过325目筛，获得tp可湿性粉剂，以上百分含量均为质量百分含量。

所述硅藻土中含质量百分含量0.5％的葡萄糖。

本发明的有益效果为：

本发明的贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的生物农药制剂用于防治禾谷镰孢菌侵染引起的玉米穗腐病和小麦赤霉病。可用于玉米大喇叭口期、抽丝期、乳熟期针对玉米穗部或小麦扬花期针对小麦穗部喷施，可操作性强，制剂的性质和稳定性好，活菌数量高达2.00×10⁹cfu/g。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌不仅在平板培养时可高效抑制禾谷镰孢菌，而且在盆栽实验中对玉米穗腐病和小麦赤霉病防治效果高达76.92％、75.71％。作为禾谷镰孢菌的高效拮抗菌，该菌具有很好的应用前景。

附图说明

图1为禾谷镰孢菌f18纯培养对照图；

图2所示为本发明的贝莱斯芽孢杆菌tp对禾谷镰孢菌f18的抑菌培养图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1：菌的分离与鉴定

1.1菌的分离

(1)在超净工作台中，将新采集的小麦、玉米病穗放在100ml的无菌水中震荡冲洗30min，充分悬浮，制成菌悬液。

(2)将菌悬液用无菌水梯度稀释后，从每个浓度的菌悬液稀释液中取100ul涂布到lb培养基平板上，放于30℃恒温培养48h，然后挑取平板上形态、大小、颜色不同的单菌落到lb平板上划线纯化，编号。

(3)取纯化的不同编号的菌株在lb液体培养基中30℃180rpm培养24h后，分别取2ml发酵液混合到15mlpda培养基中，倒平板，凝固后，在平板的中心位置接种禾谷镰孢菌进行抑制共培养，将得到的对禾谷镰孢菌拮抗能力强的一株菌命名为tp。

1.2菌株鉴定

(1)16srdna测序

提取tp的基因组dna，以其为模板，利用细菌16srdna通用引物进行pcr扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物，将其回收并进行测序，得到的序列如序列表所示，具体见序列表1。

将测序得到的序列提交到gen-bank，进行同源性比较，菌株tp与bacillusvelezensis同源性为99％，初步判定该菌为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。

(2)gyrb基因测序

提取tp的基因组dna，以其为模板，利用细菌gyrb通用引物进行pcr扩增，得到长度约为1.1kb的扩增产物，将其回收并进行测序，得到的序列如序列表所示，具体见序列表2。

将测序得到的序列提交到gen-bank，进行同源性比较，菌株tp与bacillusvelezensis同源性为99％，因此将菌株tp鉴定为贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensis。该菌株已于2019年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmccno：18935，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；分类命名是贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensis，参据生物材料(株)：tp。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌tp对禾谷镰孢菌的拮抗作用(共培养法)

(1)取纯化tp菌株在lb液体培养基中30℃180rpm培养48h后，取1ml发酵液均匀混合到15mlpda培养基中，倒平板，凝固，备用。

(2)用直径为0.5cm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰孢菌f18菌落边缘打孔获得菌片，备用。

(3)用无菌挑针将上述f18菌片挑入(1)中的pda平板中心位置，同时设只接种禾谷镰孢菌f18菌片的pda平板为对照组，30℃培养4-6天，观察f18的生长菌落速度和菌落半径大小。各设3个重复，结果如表1所示。

表1培养6天tp对禾谷镰孢菌f18的抑制作用

参见说明书附图图1和图2，tp对禾谷镰孢菌f18的抑菌培养试验的对照效果展示，其中图1是禾谷镰孢菌f18的pda平板纯培养对照，图2是将tp的发酵液混合到pda培养基中，倒平板，凝固后在pda平板中心位置接种f18，30℃恒温培养6d。

通过表1和图1、图2，说明贝莱斯芽孢杆菌tp对禾谷镰孢菌f18有很好的抑制效果。

实施例3：tp发酵液对盆栽玉米穗腐病的防治效果检测

(1)将tp接种到lb培养液中，30℃180rpm培养72h，得到发酵液，生物量达1.20×10¹⁰cfu/ml；用自来水调整菌液浓度至10⁹cfu/ml，备用；

(2)玉米盆栽试验于2018年夏至秋季在山东省科学院东院区完成。试验采用直径为33cm、深度28cm的塑料花盆，土壤采自大田耕作层，过筛并掺入适量有机肥，每盆装土14kg，浇透水后于6月20日手工点播郑单958玉米种，上覆1.5cm厚细土。出苗后21天每盆定苗2株，全生育期内定量浇水，正常管理。设4个处理：ck对照、病原菌f18+5％井冈霉素药剂对照、病原菌f18+tp发酵液、病原菌f18+tp菌体，每处理设8个重复，每盆为1个重复。在玉米大喇叭口期、玉米抽丝期喷施生防菌tp菌液，于玉米乳熟期苞叶内注射病原菌f18孢子悬浮液2ml，并于2天后喷施生防菌tp菌液。

于玉米成熟期调查病情，将各处理接种的玉米果穗剥去苞叶，调查记录果穗病级，计算病情指数和防效。玉米穗腐病分级标准：0级，不发病；1级，发病面积占果穗面积的0～1％；3级，发病面积占果穗面积的2～10％；5级，发病面积占果穗面积的11～25％；7级，发病面积占果穗面积的26～50％；9级，发病面积占果穗面积的51～100％。

病情指数＝∑(发病穗数×病级)×100/(调查总穗数×最高级代表值)

防效＝(ck病指-处理病指)×100/ck病指

表2玉米成熟期各处理病情指数和防效

注：同一列中小写字母分别表示在0.05水平上的差异显著性，字母相同则表示差异不显著。

结果如表2所示，贝莱斯芽孢杆菌tp在盆栽条件下能很好防治禾谷镰孢菌引起的玉米穗腐病。

实施例4：tp发酵液对盆栽小麦赤霉病的防治效果检测

(1)将tp接种到lb培养液中，30℃180rpm培养16h，得到种子液，浓度约为10⁹cfu/ml；

(2)用60升的机械搅拌不锈钢发酵罐六连罐对菌株tp进行发酵：发酵培养基为糖蜜培养基(1l)：100ml糖蜜、1g氯化钠、3g尿素。装液量为40l，接种量为6％，温度30℃，搅拌速度为300rpm，通气量3l/min，发酵时间2天，生物量达1.20×10¹⁰cfu/ml，得到发酵液；用自来水调整菌液浓度至10⁹cfu/ml，备用；

(3)小麦盆栽试验于2017年至2018年在山东省科学院东院区完成。试验采用直径为33cm、深度28cm的塑料花盆，土壤采自大田耕作层，过筛并掺入适量有机肥，每盆装土14kg，浇透水后于11月20日手工点播济麦22小麦种，上覆1cm厚细土。出苗后每盆定苗13株，全生育期内定量浇水，正常管理。设4个处理：ck对照、病原菌f18+25％氰烯菌酯药剂对照、病原菌f18+tp发酵液、病原菌f18+tp菌体，每处理设3个重复，每盆为1个重复。第一次在小麦扬花初期进行喷施病原菌f18孢子悬浮液，并于48h后和小麦扬花盛期喷施生防菌tp菌液。

于第2次施药后14d、21d分别调查病情，记录病穗数和病级，并计算防治效果。

小麦赤霉病分5级：0级，不发病；1级，病小穗占全穗的1/4以下；2级，病小穗占全穗的1/4～1/2；3级，病小穗占全穗的1/2～3/4；4级，病小穗占全穗的3/4以上。

病情指数＝∑(病穗数×病级)×100/调查总穗数×4

病指防效＝(ck病指-处理病指)×100/ck病指

病穗率＝病穗数×100/调查总穗数

病穗防效＝(对照病穗率-处理病穗率)×100/对照病穗率

表3小麦药后14天、21天各处理防效

注：同一列中小写字母分别表示在0.05水平的差异显著性，字母相同则表示差异不显著。

结果如表3所示，贝莱斯芽孢杆菌tp在盆栽条件下能很好防治禾谷镰孢菌引起的小麦赤霉病。

实施例5：tp对禾谷镰孢菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)的降解效果检测

(1)将tp接种到lb培养液中，30℃180rpm培养24h，得到种子液，5℃4000rpm离心获得菌体，菌体用无机盐培养液(1l：nh4no31g，k2hp04·3h2o1.5g，kh2p040.5g，nacl0.5g，mgso4·7h2o0.2g，ph7.0)洗涤两次，以清除残留的lb培养液，最后用无机盐培养液重悬菌体，使得菌体浓度约为10¹¹cfu/ml；

(2)在无菌试管中加入3ml无机盐培养液，加入10mg/ml的don溶液6.1μl，制成don终浓度为20mg/l，加入3μltp菌悬液，使其菌体浓度约为10⁸cfu/ml，同时设不加菌按同比例加入don毒素的无机盐培养液作为对照，在30℃180rpm摇床培养4d、6d、8d、10d后，取1ml培养液加入等体积的色谱纯乙腈，超声混匀后过0.22um微孔滤膜后，用高效液相色谱检测其中don含量，检测条件：安捷伦c18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-水(20：80，v/v)；柱温：30℃；流速：1.0ml/min，紫外检测波长：220nm；进样量10μl。

(3)结果见表4，接种后，随着培养时间的延长，don浓度呈现不断下降的趋势，表明tp对don有降解能力。hplc检测结果显示，以不含don的无机盐培养液作为阴性对照，该色谱条件下，don的出峰时间约为3.772min，共培养至10d时，tp对don的降解率达98.97％。

表4共培养4d、6d、8d、10d后tp对don的降解率

序列表

<110>山东省科学院生态研究所

<120>一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1433

<212>dna

<213>贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)

<400>1

ggcggctgctatactgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcgg60

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<213>贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)

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