一种用于PCR扩增的大豆DNA快速获得方法以及PCR扩增方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于pcr扩增的大豆dna快速获得方法以及pcr扩增方法。

背景技术：

随着分子生物学技术的发展，基于pcr(聚合酶链式反应)的分子标记技术因为其相对简便快捷的特点，目前已经被广泛用于基因组dna的分析，从而大大促进了遗传育种、遗传进化、种质资源分类和基因克隆、基因定位等方面的研究发展。随着多种基于pcr的分子标记技术应用，dna模板的获取是这一切的基础。根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等不同，提取基因组dna所应用的方法也不同。其中，随着作物分子辅助育种的广泛应用与推广，基因型鉴定是最主要的工作，基因组dna的提取则是最繁重、最耗时的工作之一。

针对大豆分子辅助育种方面，面对田间大量材料的基因型鉴定，dna提取是影响鉴定工作的重要之处。常规的提取方法主要包括：ctab提取法、试剂盒提取法、sds提取法以及尿素提取法等。这些方法在提取过程中需要使用液氮、氯仿、试剂盒等试剂，同时要进行研磨、离心等方法。提取步骤繁杂、配制化学试剂种类众多、提取过程刺激味大，操作步骤多或者成本较高，均不利于进行高通量的分子辅助育种(见表1)。

表1几种dna提取方法比较

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术所存在的问题，旨在提供一种用于pcr扩增的大豆dna快速获得方法以及pcr扩增方法，创造性地应用碱处理大豆叶柄组织直接作为pcr反应模板，能够快速、有效、简便地进行大豆dna提取并扩增。

本发明用于pcr扩增的大豆dna快速获得方法，包括如下步骤：

步骤1：材料处理

取某一大豆品种的叶柄1cm，剪碎备用；

步骤2：试剂准备

配制试剂a，所述试剂a为浓度4g/l的naoh溶液；

配制试剂b，每500ml试剂b配方如下：1mol/lph值8.0的tris-hcl5ml，0.5mol/l的edta1ml，加入蒸馏水定容至500ml；

步骤3：大豆dna的提取

将步骤1剪碎后的叶柄组织加入60ml试剂a中，放置pcr仪中，于95-100℃下煮3min，再加入60ml试剂b，搅拌均匀，即可获得大豆组织的dna模板。

利用上述获得的大豆组织的dna模板进行pcr扩增的方法，是利用ssr标准引物，以步骤3获得的dna模板进行pcr扩增。

pcr反应体系为：5×buffer2μl，2.5mmol/lmg²⁺1μl，0.25mmol/ldntps1μl，0.2μmol/l引物1μl，1.0utaqdna聚合酶0.1μl，20ng-40ng步骤3获得的dna模板2μl，ddh2o2.9μl，总体积10μl。

所述引物为ny/t2595-2014标准规定的引物。

反应程序为：94℃5min，94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次，72℃7min，得到扩增产物，12℃保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明用碱处理待测大豆叶柄提取dna作为pcr反应模板，相对于常规的dna提取方法具有操作简单、无需研磨、无需液氮、氯仿等试剂耗材、成本低、环保等特点，且提取效果与试剂盒提取扩增效果一致。

2、本发明用大豆叶柄提取dna，在样品制备中pcr板装样效率高，相对于采用叶片具有明显的快捷性，能够满足大量样品的制备工作。

3、本发明用碱处理待测大豆叶柄提取dna作为pcr反应模板，进行品种真实性检测的结果显示，碱处理法与试剂盒法检测结果完全一致，能够用于大豆品种高通量检测工作。

附图说明

图1为实施例1-3大豆叶柄碱煮法不同时间提取dna后pcr反应扩增结果。

图2为试剂盒提取dna进行品种真实性检测的pcr反应扩增结果。

图3为大豆叶柄碱煮法提取dna进行品种真实性检测的pcr反应扩增结果。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

实施例1：大豆dna的提取

1、材料处理

取某一大豆品种的叶柄1cm，将其剪碎，备用；

2、试剂准备

配制试剂a，所述试剂a为浓度4g/l的naoh溶液；

配制试剂b，每500ml试剂b配方如下：1mol/lph值8.0的tris-hcl5ml，0.5mol/l的edta1ml，加入蒸馏水定容至500ml；

3、大豆dna的提取

将步骤1剪碎后的叶柄组织加入60ml试剂a中，放置pcr仪中，于95-100℃下煮3min，再加入60ml试剂b，搅拌均匀，即可获得大豆组织的dna模板。

实施例2：

本实施例的提取过程同实施例1，区别在于步骤3中，95℃下煮6min。

实施例3：

本实施例的提取过程同实施例1，区别在于步骤3中，97℃下煮9min。

经检测，实施例1-3中，实施例1的dna得出率最高，为100％，且时间最短，确定实施例1为最优方案。

实施例4：pcr扩增方法

选用实施例1提取的大豆dna模板，利用ssr标准引物satt197(ny/t2595-2014，由上海生工合成)，正向引物cactgctttttcccctctct，反向引物aagatacccccaacattatttgtaa。

反应体系为：5×buffer2μl，2.5mmol/lmg²⁺1μl，0.25mmol/ldntps1μl，0.2μmol/l引物1μl，1.0utaqdna聚合酶0.1μl，20ng-40ngdna模板2μl，ddh2o2.9μl，总体积10μl；

反应程序为，94℃5min，94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次，72℃7min，得到扩增产物，12℃保存。

对比例1：试剂盒法提取大豆叶柄的dna及pcr扩增

s1、取两个不同大豆品种叶柄组织各5g放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取80mg-100mg磨碎的样品转入2.0ml的eppendorf管中；

s2、视材料量的多少，加入600ul已预热的buffera，轻轻混匀后，65℃水浴保温10min；

s3、在eppendorf管管中加入600ul酚/氯仿，上下颠倒充分混匀，抽提2min；

s4、12000×g离心5分钟，吸取上清液到一新的eppendorf管中；

s5、加入与上清液等体积的bufferb混匀，常温放置10min后，12000×g离心5min，去上清，保留沉淀；

s6、在沉淀中加入60ulbufferc，37℃(常温)放置2min后用枪头将其充分混匀后，于37℃溶解沉淀，5分钟后加入300ulbufferd，上下颠倒充分混匀10次后，取出离心柱，将离心柱放置在一个2ml的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；

s7、将离心柱和2ml套管一起用8000×g离心，30秒后，弃去2m1套管中溶液，在离心柱中加入200u1washbufferi，8000×g离心，30秒后，弃去溶液；

s8、在离心柱中加入200u1washbufferi，8000×g离心，30秒后，弃去溶液；

s9、在离心柱中加200u1washbufferii，8000×g离心，30秒后，弃去溶液；

s10、在离心柱中加入200u1washbufferii，8000×g离心，30秒后，弃去溶液；11、12000×g离心30秒，以除去离心柱中痕量残余溶液；室温放置10min；

s12、将离心柱放置在一个新的1.5m1离心管中，在离心柱底部中央小心加入130u1elutionbuffer，37℃放置10min后，12000×g离心1分钟；13.-20℃保存。

s13、pcr扩增

选用ny/t2595-2014中的ssr引物(由上海生工合成)，反应体系为：5×buffer2μl，2.5mmol/lmg²⁺1μl，0.25mmol/ldntps1μl，0.2μmol/l引物1μl，1.0utaqdna聚合酶0.1μl，20ng-40ngdna模板2μl，ddh2o2.9μl，总体积10μl；反应程序为，94℃5min，94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次，72℃7min，得到扩增产物，12℃保存。

对比例2：叶柄碱煮法提取大豆dna模板及pcr扩增

s1、材料处理

取2个不同大豆品种叶柄，剪成若干段，待用。

s2、试剂准备

试剂a：试剂a：浓度4g/l的naoh溶液；

每500ml的试剂b配方如下：1mol/ltris-hcl(ph8.0)5ml，0.5mol/ledta1ml，加入蒸馏水定容至500ml；

s3、模板dna的制备

按照实施例1中dna提取步骤获取两个不同大豆品种的dna，吸取2.0μl作为pcr反应模板直接用于pcr反应。

s4、pcr扩增

选用ny/t2595-2014中的ssr引物(由上海生工合成))，反应体系为：5×buffer2μl，2.5mmol/lmg²⁺1μl，0.25mmol/ldntps1μl，0.2μmol/l引物1μl，1.0utaqdna聚合酶0.1μl，20ng-40ngdna模板2μl，ddh2o2.9μl，总体积10μl；反应程序为，94℃5min，94℃45s、47℃45s、72℃45s下循环37次，72℃7min，得到扩增产物，12℃保存。

利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

分别取10μl实施例4、对比例1和对比例2扩增得到的产物，加入等体积加样缓冲液，充分混匀后在pcr仪上运行变性程序，95℃变性5min，4℃冷却10min以上，在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒压预电泳(100v恒压，10～30min)，然后恒压电泳(200～250v恒压，1～2h)，凝胶浸入固定液中，置于摇床上摇动固定5min(固定液的量可根据胶板数量和大小调整，以没过胶面为准)，用ddh2o进行快速漂洗一次，在新配制的染色液中摇动染色10min，用ddh2o(含0.2％体积的0.1％硫代硫酸钠)快速漂洗，时间不超过10s，在新配制的显影液中摇动直至显出清晰的条带，在固定液中定影5min，在胶片观察灯上直接记录结果或用数码相机照相。

实验结果

1、大豆叶柄不同碱煮时间后pcr扩增结果比较

实施例1-3的扩增结果如图1所示，其中1-8为碱煮3min后pcr结果，9-16为碱煮6min后pcr结果，9-16为碱煮9min后pcr结果，3个碱煮时间均可获取pcr扩增效果较好的dna模板，能够满足检测需求，因此在相同效果情况下，优先选择时间短的处理方案，为实施例1。

2、大豆叶柄快速提取dna与试剂盒提dna的扩增结果比较

对比例1和对比例2的扩增结果如图2和图3所示，对两个大豆品种分别使用试剂盒提取和实施例1方法提取dna，采用标准ny/t2595-2014中12对应物进行检测，并验证实施例1的效果。其中图2为试剂盒提取dna进行pcr扩增的产物，图3为实施例1提取dna进行pcr扩增的产物。检测结果一致，对比两个图，图3中扩增条带清晰明亮，无拖尾，判读效果更好。因此实施例1获取大豆dna能够满足大豆分子检测需求。

以上的仅为本发明的一个实施例，但是本发明实施例并非仅限于此，任何本领域能思之的变化都应落在本发明的保护范围之内。