识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具的制作方法

本发明涉及生物检测领域，特别涉及识别2019-ncov抗体的np蛋白及检测工具。
背景技术：
：2019新型冠状病毒,又称之为covid-19，是2019年在人体中发现的新型冠状病毒，目前已经在全球范围内爆发。该病毒存在人传人的特点，感染该病毒的患者主要表现为全身酸痛、四肢无力、发烧、干咳、呕恶感、腹泻；症状比较重一些则表现为胸闷、气紧、呼吸困难；有少数病毒携带者没有表现出任何症状。因此，将出现症状的疑似病例以及接触确诊病例的人群进行检测十分必要。现有检测方法或试剂盒存在耗时长，所需费用昂贵，不方便，操作较繁琐等问题，因此，提供检测新冠病毒抗体的胶体金试剂盒的方法，为进一步治疗进行人群筛查，从而有效遏制新冠病毒传播具有重要的现实意义。免疫层析(immunochromatography,ic)是一种起源于20世纪80年代初的检测方法。免疫胶体金层析技术以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标志物，待检溶液通过毛细作用在纤维膜上涌动(层析)，通过抗原抗体特异性结合，标记物不断被(或不被)固定浓缩在检测线上并呈现颜色(红色)反应，最后通过检测线的信号来判断待检物的有或无。对比elisa检测方法，该方法不仅简便、快速、经济，而且不需要复杂仪器，结果直接判断等特点。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了识别2019-ncov抗体的np蛋白及检测工具。该检测工具包括能够识别2019-ncov抗体的np蛋白，具有特异性好、灵敏度高、准确度高、方便快捷、易于操作、经济实惠的特点。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了识别2019-ncov抗体的np蛋白，其具有：(ⅰ)、如seqidno.1所示的氨基酸序列；或(ⅱ)、如(ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(iii)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。在上述研究的基础上，本发明提供了编码所述np蛋白的核苷酸，具有(ⅰ)、如seqidno.2所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、如seqid2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(v)、与(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅳ)所述核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。本发明还提供了表达载体，包括所述的核苷酸。此外，本发明还提供了转化有所述表达载体的宿主。在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的np蛋白、所述的载体或所述的宿主在制备2019-ncov的检测试剂或检测工具中的应用。本发明还提供了2019-ncov的检测试剂，包括所述的np蛋白、所述的载体或所述的宿主。更重要的是，2019-ncov的检测工具，其为胶体金检测试剂盒，包括所述的np蛋白、所述的载体或所述的宿主。在本发明的一些具体实施方案中，所述的np蛋白的标计量为18μg/ml，标记ph值为8.0。在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具包括pvc底板，滤纸、样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜、吸水纸依次固定于所述pvc底板；所述检测工具以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标志物，还包括封闭液和重悬液。此外，本发明还提供了所述的检测工具的制备方法，包括如步骤：步骤1：制备获得胶体金溶液；步骤2：调节ph值至8.0，与如权利要求1所述的np蛋白、封闭液(优选peg20000)混合，离心，经重悬液重悬，点样于结合垫，干燥。在本发明的一些具体实施方案中，所述重悬液包括：0.5％(w/w)～3％(w/w)蔗糖和0.5％(w/w)～3％(w/w)bsa。在本发明的一些具体实施方案中，所述离心的时间为20～60min。本发明提供的胶体金检测试剂盒，包括能够识别2019-ncov抗体的np蛋白，具有特异性好、灵敏度高、准确度高、方便快捷、易于操作、经济实惠的特点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示本发明实施例1构建的质粒谱图；其中，图1(a)示pet-41a(+)-gst-6his-n质粒谱图；图1(b)示pgex-4t-2-gst-n-6his质粒谱图；图2示识别2019-ncov抗体的np蛋白；其中，泳道1示gst-2019-ncov-n-6his；泳道2示gst-6his-2019-ncov-n；图3示胶体金溶液；图4示标记ph值的结果；图5示np蛋白最佳标记量结果；图6示胶体金检测效果，阴性(左)；阳性(右)。具体实施方式本发明公开了识别2019-ncov抗体的np蛋白及检测工具，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的识别2019-ncovnp蛋白的抗体及检测工具中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1本申请构建表达的2019-ncov抗体np(nucleocapsidphosphoprotein)蛋白序列，如seqidno.1所示：msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa本申请构建表达的2019-ncov抗体np(nucleocapsidphosphoprotein)核苷酸序列，如seqidno.2所示：atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaagaaggctgatgaaactcaagccttaccgcagagacagaagaaacagcaaactgtgactcttcttcctgctgcagatttggatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctaa质粒构建及表达情况：通过体外基因合成，通过同源重组法进行质粒构建，获得pet-41a(+)-gst-6his-n及pgex-4t-2-gst-n-6his两种质粒(图1)，通过转化bl21(de3)，1mmiptg30℃诱导蛋白表达表达4小时，经gst-琼脂糖珠纯化，最终成功表达并获得了能够识别2019-ncov抗体的np蛋白(图2)。实施例2胶体金制备胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法。将100ml0.01％haucl4溶液加热煮沸，然后立即加入1ml1％柠檬酸三钠溶液搅拌，溶液的颜色由浅黄→灰色→蓝色→深蓝→红色，当溶液的颜色完全变为透明的红色时(图3)，继续回8-10min后停止加热，冷却至室温，定容至100ml，4℃保存。实施例3标记ph的确定取8个1.5ml离心管，分别加入1ml胶体金溶液，用0.2mol/lk2co3溶液将ph值分别调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。上述不同ph值的胶体金各取100μl，每孔加入5μl2mg/ml表达的2019-ncovnp蛋白，混匀，室温静置5min左右，每孔加入20μl100g/lnacl溶液，混匀，室温条件放置10min观察胶体金颜色变化，通过观察可以发现,ph在7.5-8.5，胶体金保持红色(图4)，本实验选用8.0为标记ph。实施例4蛋白最佳标记量的的确定在孔板中，每个孔加入100μlph8.0胶体金，将待标记的2019-ncovnp蛋白稀释后，摇匀室温放置5min后，分别加入10μl100g/lnacl，依次按表1进行。混匀静置1-2h观察结果。保持红色的离心管中，所含最低蛋白量为6号管的15μg/ml(图5)，120％即为实际用量，即18μg/ml。表1.蛋白最佳标记量的确定管号12345678胶体金用量μl100100100100100100100100np蛋白/胶体金质量浓度(μg/ml)036912151821100g/lnacl用量1010101010101010实施例5胶体金检测效果取10ml胶体金溶液，用0.2mol/lk2co3溶液调节ph至8.0，加入1ml18μg/ml2019-ncovnp蛋白，搅拌30min，随后分两次加入100μl10g/lpeg20000，每次混匀10min。4℃、8000r/min离心30min左右，沉淀用重悬液(1％蔗糖+1％bsa)重悬。将重悬液按适当的1:50-1：200比例稀释后，点样于结合垫上(8μl/cm)，干燥1-2h，将1mg/mlnp蛋白抗体(够买于义翘神州生物技术有限公司)和山羊抗人的igg二抗分别点样于硝酸纤维素上(1μl/cm)的c线和t线，37℃干燥3-4h。将滤纸、样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜、吸水纸固定于pvc底板上。实验检测结果：t线标记1.0mg/ml山羊抗人igg抗体，c线标记识别np蛋白的单克隆抗体。t线红色表示胶体金标记抗原-待检测igg抗体-包被山羊抗人igg抗体的免疫复合物，c线红色表示胶体金标记抗原-np蛋白的单克隆抗体，如果只出现c线则为阴性，若c线和t线均出现则为阳性，如图6所示。实施例6本试剂盒已经通过30例样本检测，检测中无假阳性，准确性较高，灵敏度较强，可在2分钟内出结果。表2.检测样本信息以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>苏州大学<120>识别2019-ncov抗体的np蛋白及检测工具<130>mp2008231<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>419<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metseraspasnglyproglnasnglnargasnalaproargilethr151015pheglyglyproseraspserthrglyserasnglnasnglygluarg202530serglyalaargserlysglnargargproglnglyleuproasnasn354045thralasertrpphethralaleuthrglnhisglylysgluaspleu505560lyspheproargglyglnglyvalproileasnthrasnserserpro65707580aspaspglnileglytyrtyrargargalathrargargilearggly859095glyaspglylysmetlysaspleuserproargtrptyrphetyrtyr100105110leuglythrglyproglualaglyleuprotyrglyalaasnlysasp115120125glyileiletrpvalalathrgluglyalaleuasnthrprolysasp130135140hisileglythrargasnproalaasnasnalaalailevalleugln145150155160leuproglnglythrthrleuprolysglyphetyralagluglyser165170175argglyglyserglnalaserserargserserserargserargasn180185190serserargasnserthrproglyserserargglythrserproala195200205argmetalaglyasnglyglyaspalaalaleualaleuleuleuleu210215220aspargleuasnglnleugluserlysmetserglylysglyglngln225230235240glnglnglyglnthrvalthrlyslysseralaalaglualaserlys245250255lysproargglnlysargthralathrlysalatyrasnvalthrgln260265270alapheglyargargglyprogluglnthrglnglyasnpheglyasp275280285glngluleuileargglnglythrasptyrlyshistrpproglnile290295300alaglnphealaproseralaseralaphepheglymetserargile305310315320glymetgluvalthrproserglythrtrpleuthrtyrthrglyala325330335ilelysleuaspasplysaspproasnphelysaspglnvalileleu340345350leuasnlyshisileaspalatyrlysthrpheproprothrglupro355360365lyslysasplyslyslyslysalaaspgluthrglnalaleuprogln370375380argglnlyslysglnglnthrvalthrleuleuproalaalaaspleu385390395400aspasppheserlysglnleuglnglnsermetserseralaaspser405410415thrglnala<210>2<211>1260<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccc60tcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgt120cggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggc180aaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtcca240gatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaa300atgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctgga360cttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaat420acaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaa480cttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagt540caagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggc600agcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgct660ttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaa720caacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaa780aaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaa840caaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacat900tggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcatt960ggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggat1020gacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatac1080aaaacattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaagaaggctgatgaaactcaa1140gccttaccgcagagacagaagaaacagcaaactgtgactcttcttcctgctgcagatttg1200gatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctaa1260当前第1页12