一株地衣芽孢杆菌的筛选及其在食品生产中的应用的制作方法

本发明涉及一株地衣芽孢杆菌的筛选及其在食品生产中的应用，属于酒类酿造以及食品安全领域。

背景技术：

传统发酵食品在发酵过程中会不可避免的产生一种代谢副产物——氰化物。氰化物作为植物自身的防御机制而存在。

氰化物是指含有cn^－基团的化合物，蒸馏酒中的氰化物一部分来自酿酒原料中的生氰糖苷。食品安全国家标准gb2757—2012要求：蒸馏酒及其配制酒中氰化物含量不得超过8.0mg/l(以hcn计，按照100％vol酒精度折算)。氰化物还是致癌物-氨基甲酸乙酯形成的重要前体物质。

目前已有的用于白酒中氰化物的控制的方法主要是原料处理，早在1991年，潘伟就研究了液态法木薯白酒生产中氰化物的消除方法，主要对木薯原料在入库前，进行曝晒并通风，使一部分氢氰酸自行挥发，该方法同样适用于白酒原料的处理；tokpohozinse等人发现合理的糖化方案，如高粱醪预热和醪生物酸化，在高粱啤酒加工过程中对高粱麦芽汁有显著解毒效果(降低氰化物含量)并改善蛋白质水解。但过多的处理及排气等措施可能造成营养及风味物质流失等问题。

目前关于氰化物的降解的研究主要是土壤或水中的氰化物的降解，工业上处理含氰废水大多采用化学方法。通过生物法降解氰化物目前在土壤或废水处理中研究较为广泛，常见的氰化物降解途径主要有水解、氧化、还原和置换/转移。关于白酒体系中直接降解氰化物的菌株的筛选及利用暂无相关报道，目前的氰化物降解菌多为致病菌株，而这些菌株不能在发酵食品中应用。

因此，获取降解氰化物并能适应多种食品生产环境的菌株，对于发酵食品的生产及食品安全具有重要作用。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，已于2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.19041，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供了一种降解氰化物的方法，所述方法为在含有氰化物的体系中接种所述地衣芽孢杆菌jyh-1。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为20～55℃，ph为3.5～7.0。

本发明提供了一种所述地衣芽孢杆菌jyh-1的培养方法，所述方法是将地衣芽孢杆菌jyh-1接种至培养体系中培养。

在本发明的一种实施方式中，培养体系中乙醇浓度不高于30mg/100ml。

在本发明的一种实施方式中，培养温度为20～55℃。

在本发明的一种实施方式中，培养体系中ph为3.5～7.0。

在本发明的一种实施方式中，nacl浓度不高于16％。

本发明提供了一种含有地衣芽孢杆菌jyh-1的组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有地衣芽孢杆菌jyh-1和食品学上可接受的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是地衣芽孢杆菌固/液态菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂含有所述的地衣芽孢杆菌活细胞和细胞保护剂。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有菌浓≥1×10⁵cfu/g，或菌浓≥1×10⁵cfu/ml的地衣芽孢杆菌jyh-1。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是含有地衣芽孢杆菌jyh-1的酒曲。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是含有菌浓≥1×10⁵cfu/g地衣芽孢杆菌jyh-1的酒醅。

在本发明的一种实施方式中，所述酒曲中含有小麦、大麦、豌豆、小豆中一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述液态菌剂中含有a或者b。

在本发明的一种实施方式中，

所述培养基a：以g/l计，含有酵母粉4～6、蛋白胨9～11、nacl9～11、其余为水。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基b：将高粱经粉碎后，按原料与水的比例为1:(3～5)w/v的比例混合，100～110℃蒸煮40～50min，冷却后加入糖化酶45～55单位/g原料，于55～65℃保持2～10h，过滤，离心所得滤液调节糖度为95～105bx、ph为4.0～4.8。

本发明提供一种制备所述固态菌剂的方法，步骤为将所述地衣芽孢杆菌jyh-1接种于10～30ml培养基中，30～40℃下活化2至3代，待菌株浓度达到1.0×10⁷cfu/ml以上活菌数时，2000～6000rpm下离心15～25min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于1.0×10⁶cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水和/或1.0～2.5％(w/v)的生理盐水。

在本发明的一种实施方式中，所述冷冻保护剂为10～15％(w/v)的海藻糖和/或脱脂乳粉。

本发明还提供一种固态菌剂，所述固态菌剂为麸曲。

在本发明的一种实施方式中，所述麸曲的制备方法为：

(1)液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑取环地衣芽孢杆菌jyh-1于装有液体种子培养基的试管中，置摇床上以旋转转速为150～300rpm、22～55℃培养18～28h，即制得一级液体种子培养物。

(2)二级种子培养物的制备：按5～20mg/100ml接种量将一级液体种子培养物转接于装有液体种子培养基中，置摇床上以旋转转速为150～300rpm、22～55℃培养18～28h，即制得二级液体种子培养物。

(3)三级种子培养物的制备：按5～20mg/100ml将二级液体种子培养物转接于装有液体种子培养基的卡氏罐中，22～55℃静置培养18～28h，即制得三级液体种子培养物。

(4)将三级液体种子培养物以体积百分比为2～10％的接种量接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，22～55℃培养1～3d，风干1～3d，制成固态麸曲。

本发明提供了一种降低白酒中氰化物含量的方法，所述方法为在白酒大曲、堆积醅或窖池发酵的酒醅中添加所述地衣芽孢杆菌jyh-1，或所述组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物以液体或固体培养物的形式。

在本发明的一种实施方式中，所述地衣孢杆菌在大曲或堆积醅或入池醅中的终浓度1.0×10⁵～1.0×10⁷cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述液体培养物总接种量为1～200ml/kg，固体培养物总接种量为1～200g/kg。

本发明提供了所述地衣芽孢杆菌jyh-1，或降解氰化物的方法，或所述组合物，或降低白酒中氰化物含量的方法，或所述组合物在粮食发酵食品制备中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为在酿造酒或蒸馏酒制备中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为在白酒、黄酒、酱油、醋制备中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一株能够高效降解谷物食品发酵中氰化物的地衣芽孢杆菌cgmccno.19041，利用所述地衣芽孢杆菌进行蒸馏酒或其他谷物发酵食品的制备可在一定程度上减少食品中氰化物的含量。所述地衣芽孢杆菌可在以kcn为唯一氮源的环境中生长。本发明菌株对于氰化物的降解率可达99.9％。将所述地衣芽孢杆菌应用于白酒酿造过程中，能使酒醅和原酒中的氰化物含量分别降低52.1％和55.6％。此外，所述地衣芽孢杆菌在55℃、ph为4、乙醇浓度不高于12mg/100ml、14％的nacl的条件下，生长状况良好。并且菌株还能够生产包括酸、酯、醇、芳香化合物、酚、呋喃和醛酮在内的25种风味化合物，增添了发酵食物的风味，适宜在多种食品制备中应用。

生物材料保藏

本发明所提供的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，于2019年11月27日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cmgccno.19041，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为菌株扩增得到的16srdna片段的电泳图；b.licheniformis为本申请的地衣芽孢杆菌。

具体实施方式

筛菌培养基：kcn培养基，培养基配方(g/l)：(nh4)2so40.4，nacl0.1，k2hpo40.4，葡萄糖1，酵母膏1，琼脂20；ph8.0，灭菌后加入kcn及制霉菌素2.5ml/l(浓度为0.1g/ml)。

富集培养基：(nh4)2so40.4g，nacl0.1g，k2hpo40.4g，葡萄糖1g，酵母膏1g，121℃，20min灭菌，然后加入kcn，使氰浓度10mg/l。

lb培养基：在1l去离子水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5gnacl，用1mol/lnaoh调节ph至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

tris缓冲液(ph＝8.00)(实施例2中细胞重悬所用)：50ml0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷(tris)溶液与29.2ml0.1mol/l盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

氰化物检测方法：配制氧化剂(n-氯代丁二酰亚胺-丁二酰亚胺)：将1g丁二酰亚胺溶于30ml超纯水中，再加入0.1gn-氯代丁二酰亚胺并搅拌至溶解，加超纯水定容至100ml，于4℃避光贮存；配制显色剂(巴比妥酸-吡啶)：将6g巴比妥酸溶于少量超纯水中，并加入30ml吡啶，再加超纯水定容至100ml，于4℃避光贮存。吸取1ml的酒样，加入50μl氧化剂和50μl显色剂后在25℃下反应25min，于575nm处测定吸光度。重复测定3次求取平均值。

氰化物耐受培养基：(nh4)2so40.4g，nacl0.1g，k2hpo40.4g，葡萄糖1g，酵母膏1g，121℃，20min灭菌，然后加入过滤除菌后的高浓度kcn标准液，使氰浓度10mg/l，50mg/l，100mg/l。

风味化合物的提取：具体步骤参照文献fanwlandqianmc.characterizationofaromacompoundsofchinese"wuliangye"and"jiannanchun"liquorsbyaromaextractdilutionanalysis[j].j.agric.foodchem.,2006,54(7):2695-2704；取发酵液250ml，加nacl60g饱和溶液，用ch2cl290ml分别萃取三次。待分层后，收集萃取相，氮吹至250μl。

gc-ms分析：具体步骤参见张荣《产酱香功能细菌的筛选及其特征风味化合物的研究》(公开日2019年)：样品通过db-wax毛细管柱进行分离，程序升温条件：初温50℃，恒温2min，然后以6℃/min的速率升至230℃，保持30min。进样量：1μl，不分流。载气：he；流速：2ml/min；质谱条件ei：电离源；电子能量：70ev；离子源温度：230℃；扫描范围：30amu～550amu。

麸皮浸出汁：小麦麸皮200g，高温淀粉酶2,000iu，加水800ml，于100℃蒸煮10min。待冷却后，加入碱性蛋白酶100,000iu，于55℃保持30min；过滤取上清液，ph6.2，1×10⁵pa灭菌20min，使用前加葡萄糖至终浓度为10g/l。

实施例1：地衣芽孢杆菌jyh-1的筛选及鉴定

在50ml离心管中加入5g大曲及15ml无菌生理盐水震荡混匀5min后，300g离心3min获得浸提液，将浸提液转入无菌的50ml离心管，9000g离心5min去上清收集细胞。加入10ml无菌生理盐水震荡混匀后9000g离心5min去上清洗涤细胞，重复以上操作2次，最后用10ml生理盐水悬浮细胞，充分混匀，将细胞重新悬浮稀释后分别稀释至细胞浓度至1.0×10⁸cfu/ml，1.0×10⁷cfu/ml，1.0×10⁶cfu/ml涂布在含10mg/l的kcn平板，在37℃培养至长出单菌落；挑选单菌落种至96孔板培养基(含50mg/lkcn)，在37℃培养，并在24h及48h分别检测od600及kcn浓度，最终确定在较高氰化物浓度下能够正常生长并对cn^－有一定降解的菌株为氰化物降解菌。

吸取菌液并加入30％(v/v)的甘油在-80℃进行保存。

对氰化物降解菌进行分子生物学鉴定，利用细菌特异分类鉴定引物别27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3’分别扩增菌株的16srdna的片段，凝胶电泳检测(图1)，将扩增后得到的序列测序比对，确定所筛选得氰化物降解菌株在分类学上属于地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)；将其命名为地衣芽孢杆菌jyh-1。

实施例2：菌株耐高温特性的测定

将实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌jyh-1接种于5mllb培养基，使得菌株在培养基中的终浓度为1.0×10⁶cfu/ml，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃下培养24h，结果显示，菌株在55℃下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达1.7以上。采用地衣芽孢杆菌模式株14580模式株作为对照，在55℃培养相同的时间，结果显示，od600仅为0.5。

实施例3：菌株耐乙醇特性的测定

将实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌jyh-1分别接种于含3、6、9、12、15mg/100ml乙醇的5mllb培养基，使得菌株在培养基中的终浓度为1.0×10⁶cfu/ml，分别在37℃下培养24h，结果显示，菌株在乙醇浓度不高于12mg/100ml的环境下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达2.1以上。采用地衣芽孢杆菌模式株14580模式株作为对照，在含乙醇浓度为12mg/100ml的环境下培养相同时间，结果显示，培养24h后菌浓(od600)仅为0.5。

实施例4：菌株耐酸性环境的性能测定

将实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌jyh-1分别接种于ph为2、3、4、5、6的5mllb培养基(采用hcl和naoh调节ph)，使得菌株在培养基中的终浓度为1.0×10⁶cfu/ml，分别在37℃下培养24h，结果显示，菌株在ph为4的环境下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达2.2以上。采用地衣芽孢杆菌模式株14580模式株作为对照，在ph为4的环境下培养相同时间，结果显示，od600仅为0.6。

实施例5：菌株耐盐性能测定

将实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌jyh-1分别接种于盐度为8,、10、12、14、16g/100mlnacl的5mllb培养基，使得菌株在培养基中的终浓度为1.0×106cfu/ml，分别在37℃下培养24h，结果显示，菌株在乙醇浓度不高于12g/100ml的环境下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达2.1以上。采用地衣芽孢杆菌模式株14580模式株作为对照，在含乙醇浓度为14％的环境下培养相同时间，结果显示，培养24h后菌浓(od600)仅为0.5。

实施例6：菌株产风味特征的测定

将实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌jyh-1，使得菌株在培养基中的终浓度为1.0×10⁶cfu/ml，在麸皮浸出汁中进行培养。在37℃，150r/min振荡培养6d。以未接种的发酵液为对照，考察菌株产风味物质的特征。

从发酵液中提取风味化合物，并用gc-ms方法对风味化合物进行分析。

在发酵液中共检测到包括酸、酯、醇、芳香化合物、酚、呋喃和醛酮在内的25种风味化合物，具体如下表：

表1地衣芽孢杆菌jyh-1产发酵物质种类

实施例7：地衣芽孢杆菌jyh-1在降解氰化物中的应用

地衣芽孢杆菌jyh-1对氰化物降解能力的检验：

在5ml富集培养基中接入100～200μl的菌原液使初始菌浓为1.0×10⁶cfu/ml，培养12h后的菌浓度为1.0×10⁸cfu/ml。

取100ml富集培养基于250ml摇瓶中，灭菌后接入1～2ml的菌液培养12h后将培养得到的菌液(浓度为2.3×10⁸cfu/ml)，将菌液在12000rpm离心5min收集细胞，并将收集得到的细胞洗涤3次，将洗涤后的细胞重悬于10ml缓冲液，加入灭菌的离心管中，并加入氰化钾溶液(1g/l的0.1molnaoh配置)及无菌水至总量为25ml，使kcn浓度为50mg/l，ph8.0，30℃、120rpm转化6h(转化在离心管中进行，方便过程离心取样检测)，分别在8h、6h和24h时测定降解率，测定氰化物自然降解率。

实施例1中获得的地衣芽孢杆菌jyh-1在50mg/l的氰化钾溶液中经8h，16h及24h转化后其氰化物降解情况如下表：

表2氰化物降解率

转化进行8h后氰化物的降解率可达77.6％，16h转化后氰化物的降解率达93.1％，24h转化后氰化物的降解率可达99.9％。

实施例8：制备含有地衣芽孢杆菌jyh-1菌剂

(1)固体菌酵剂制备：将地衣芽孢杆菌jyh-1接种于10～30ml富集培养基中，30℃下活化2至3代，待菌株浓度达到1.0×10⁸cfu/ml以上活菌数时，4000rpm下离心20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(双蒸水和/或2.0％(w/v)的生理盐水)和冷冻保护剂(15％(w/v)的海藻糖和/或脱脂乳粉)，待细胞浓度不低于1.0×10⁷cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体发酵剂。

(2)液体菌剂制备：将地衣芽孢杆菌jyh-1接种于液体细菌发酵剂培养基中，于37℃培养24h，使得菌株在培养基中的终浓度为1.0×10⁸cfu/ml；所述液体细菌发酵剂培养基配方为a或者b；其中，

a：以g/l计，含有酵母粉5、蛋白胨10、nacl10、其余为水；

b：以白酒酿造所用的原料高粱为培养基成分：高粱经粉碎后，按原料与水的比例为1:4w/v的比例混合，105℃蒸煮45min，冷却后加入糖化酶50单位/g原料，于60℃保持2-10h，过滤，离心所得滤液调节糖度为100bx、ph为4.5。

实施例9：地衣芽孢杆菌jyh-1在浓香型白酒中的应用

液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环地衣芽孢杆菌jyh-1于装有5ml液体种子培养基的20ml试管中，置摇床上以旋转转速为200rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：按10％接种量(按体积计)将一级液体种子培养物转接于装有300ml液体种子培养基的500ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为200rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

三级种子培养物的制备：按10％接种量(按体积计)将一级液体种子培养物转接于装有3l液体种子培养基的5l卡氏罐中，37℃静置培养24h，即制得三级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/l)：牛肉膏10，葡萄糖10，nacl5，ph7.0，1×10⁵pa灭菌20min。

将二级液体种子培养物以体积百分比为4％的接种量接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养2d，风干1天，制成固态麸曲。

上述麸曲培养基：麸皮：水＝1：0.9，121℃，灭菌50分钟。

将上述固态麸曲和经过蒸酒蒸粮，摊凉后的熟粮醅以及大曲粉混合均匀后制成发酵起始酒醅，将酒醅入池发酵70d。用曲量为投料量的4％(按质量计)。

发酵完成后，检测酒醅中的氰化物含量，结果如表3和4所示；将酒醅经拌粮、装甑、蒸酒(具体制备步骤参照文献：余乔云《浓香型白酒的生产工艺对质量的影响》)，制备得到原酒，检测原酒里面氰化物的含量，发现添加地衣芽孢杆菌jyh-1的酒醅，在进行生产时，能使酒醅中的氰化物含量降低52.1％，使原酒中的氰化物含量分别降低55.6％，说明添加所述菌株确实能达到减少酒中氰化物含量的目的。

表3菌株强化后酒醅中氰化物的含量

表4菌株强化后原酒中氰化物的含量

注：对照为未添加地衣芽孢杆菌jyh-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。