[0001]
本发明涉一种防菌剂领域；尤其涉及一种猕猴桃叶枯病新型生防菌剂的制备方法与应用。
背景技术：
[0002]
陕西为我国最大的猕猴桃生产基地，主要种植区域集中在西安周至县、户县、长安县、灞桥区和宝鸡市的眉县，其中仅周至县的种植面积就达到了13万亩。从1993年起我省开始建设大规模生产基地和标准化管理示范区，至今全省的猕猴桃种植面积已超过50万公顷，产量50万吨以上，分别占全国总面积的1/3和产量的2/3以上，均居全国首位。猕猴桃产品已远销东南亚、俄罗斯等10余个国家和地区，在国外拥有较高声誉，发展势头强劲。
[0003]
然而，随着猕猴桃产业的迅猛发展，随之而来的猕猴桃病害也不断加重。猕猴桃细菌性叶枯病是一种严重的猕猴桃病害，在陕西周至、杨凌、户县等猕猴桃主栽培区均有不同程度的发生，己发展成为猕猴桃生产中的主要病害之一。近年来，猕猴桃叶部病害发生严重，猕猴桃主产区西安周至县、眉县等地猕猴桃园一般发病率20％，沙土地、低洼地及密闭园发病率高达30％，个别果园8月即开始落叶，影响猕猴桃花芽分化及翌年产量，严重削弱树势，一般减产20％，严重时甚至造成死树，经济损失较大。而目前猕猴桃叶枯病防治方面主要采用化学药物方法，农户通常使用的化学杀菌剂主要有：扑海因、施特灵、甲基托布津、多菌灵、春雷霉素、百菌清、速灭杀丁等，造成病原菌抗药性增加和环境污染。
[0004]
目前猕猴桃叶枯病防治方面主要采用化学药物方法，但由于生产过程中长期大量使用化肥、农药，果园生态环境严重恶化，果树营养供给不足，严重影响果树树势生长，果树自身对各种病虫害的抗性能力减弱，高毒农药的大量使用使各种病虫害的天敌减少，病虫害抗药性增加及其发病频率日益增多，产品农药残留的污染日渐严重，已严重影响猕猴桃的生产、产品外销、人们的身体健康和产业的可持续发展。农业防治法主要针对当地已出现的严重病害选择抗性品种，但是由于优良抗病品种本身就比较缺乏，再加上长期大量的田间实验工作，局限性较大；针对不同病害采取相应措施加强田间管理，可以在一定程度上减缓和推迟病害发生，但仅作为辅助手段，其自身并不能起到有效的防治作用。
[0005]
化学防治过程中主要使用化学试剂，快速、有效、方便，因此在植物病害的防治中占据重要地位，也是目前猕猴桃病害防治最为广泛的手段。然而长时间大量使用却造成了严重后果：
①
诱发植物病原菌产生抗药性；
②
农产品农残超标日益严重，影响人、畜安全；
③
造成环境污染，自然农业生态系统的平衡遭到破坏。
[0006]
因此，急需寻求效果明显、绿色环保、可持续的新型防治途径。
[0007]
目前国内对猕猴桃病害的防治手段主要局限于农业防治和化学防治，在生物防治领域的研究和应用还比较落后，特别是以拮抗菌株为主体而制备的拮抗菌剂产品的应用范围还比较窄，研究潜力巨大。
[0008]
依据陕西省科学院的发展战略——“以产业化为中心，面向地方经济、社会可持续发展总体目标，面向企业技术创新、解决企业技术难题的现实需求，为地方经济主导产业发
展和产业结构调整不断做出应有贡献”及设施蔬菜、果业、饲料、微生物肥料、农药等关系农业可持续发展方面的研究方向。已有的苹果落叶病拮抗菌株研究效果良好，为进一步针对猕猴桃病害的生物防治研究奠定了前期技术基础。
[0009]
通过优良的菌株的进一步选育工作，不仅能筛选出新的拮抗微生物资源，同时也将极大提高现有菌种的拮抗能力，是保证拮抗菌剂研发的重要基础和前提，值得深入开展研究。
技术实现要素：
[0010]
本发明的目的是提供了一种猕猴桃叶枯病新型生防菌剂的制备方法与应用。
[0011]
第一方面，本发明是通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种猕猴桃叶枯病新型生防菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0012]
步骤一，菌株的选定；
[0013]
步骤二，菌株的培养；
[0014]
步骤三，菌株发酵条件优化；
[0015]
步骤四，复合生防菌剂的制备。
[0016]
优选地，步骤一中，所述菌株的选定：枯草芽孢杆菌q14、解淀粉芽孢杆菌j、美丽短芽孢杆菌nf2，其中nf2的保藏编号cgmcc no.12749。
[0017]
优选地，步骤二中，所述菌株的培养具体为以下步骤：
[0018]
(1)菌株活化：将菌株保存于-80℃环境下的原始菌株经无菌操作分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基上活化；
[0019]
(2)生防菌的拮抗试验：平板对峙法，对美丽短芽孢杆菌nf2、枯草芽孢杆菌q14、解淀粉芽孢杆菌j进行拮抗试验；未发现三株菌之间的拮抗作用，因此可混合使用。
[0020]
(3)发酵种子制备：分别将美丽短芽孢杆菌nf2、枯草芽孢杆菌q14和解淀粉芽孢杆菌j的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于恒温振荡器。
[0021]
优选地，步骤(1)中，培养温度30℃，培养时间24h。
[0022]
优选地，步骤(2)中，三种菌株之间的拮抗作用为零。
[0023]
优选地，步骤(3)中，恒温振荡器的温度为30℃，转速为200r/min，培养时间16h。
[0024]
优选地，步骤三中，所述菌株发酵条件优化具体为：
[0025]
步骤a，美丽短芽孢杆菌nf2，发酵温度30℃、200r/min，培养48h，通过正交实验优化培养中的营养成分；结果显示，优化后的美丽短芽孢杆菌nf2的发酵培养基配方为：0.2g/l mgso4、3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、5g/lnacl、20g/l玉米粉，ph 7.0-7.2，活菌5.4
×
108cfu/ml，符合农用微生物菌剂执行标准gb20287-2006。
[0026]
步骤b，枯草芽孢杆菌q14，发酵温度30℃、200r/min，培养48h，通过正交实验优化培养中的营养成分。结果显示，优化后的枯草芽孢杆菌q14发酵培养基配方为：5g/l nacl、10g/l葡萄糖、0.2g/l mgso4、10g/l蛋白胨、3g/l牛肉膏、20g/l玉米粉，ph 7.0-7.2，活菌数3.7
×
109cfu/ml，符合农用微生物菌剂执行标准gb20287-2006。
[0027]
步骤c，解淀粉芽孢杆菌j，发酵温度30℃、200r/min，培养48h，通过正交实验优化培养中的营养成分。结果显示，优化后的解淀粉芽孢杆菌j发酵培养基配方为：5g/l nacl、5g/l葡萄糖、0.2g/l mgso4、10g/l蛋白胨、3g/l牛肉膏、15g/l玉米粉，ph 7.0-7.2，活菌数6
×
108cfu/ml，符合农用微生物菌剂执行标准gb20287-2006。
[0028]
优选地，步骤四中，所述复合生防菌剂的制备：将美丽短芽孢杆菌nf2、枯草芽孢杆菌q14、解淀粉芽孢杆菌j的发酵液分别梯度稀释到106、107、108cfu/ml，美丽短芽孢杆菌nf2(108cfu/ml)和枯草芽孢杆菌q14(107cfu/ml)、解淀粉芽孢杆菌j(106cfu/ml)按照1:1:1体积混合，即可。对猕猴桃叶枯病的生防效果最好，相对防效达到81.5％。
[0029]
第二方面，本发明还涉及前述的猕猴桃叶枯病新型生防菌剂的制备方法的应用，所述猕猴桃叶枯病新型生防菌剂在4月初至6月底喷施于猕猴桃叶面，每半个月施用一次，可有效防治细菌性叶枯病的发生。
[0030]
本发明通过进一步分离、筛选、诱变、选育针对猕猴桃叶枯病主要病原菌具有安全、高效、广谱、拮抗能力的菌株，不断提高现有拮抗菌株的抗病性能，丰富现有的拮抗菌株资源。本发明所制备的新型广谱拮抗菌株的选育工作是制备拮抗菌剂的重要基础，将极大促进其产品的研发和应用，通过筛选、诱变获得抗病能力强的拮抗菌株，充分发挥生物防治作用，对于农业可持续发展，提高经济效益、社会效益和生态效益具有重大意义。
[0031]
目前，用于植物病害防治的拮抗微生物种类很多，主要有细菌、真菌、放线菌、芽孢杆菌属和假单胞菌属等。用于生物防治的细菌主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属、放射性土壤农杆菌、沙雷氏菌属和欧文氏菌属等，其中研究和应用最多的是芽孢杆菌属和假单胞菌属。
[0032]
美国开发成为产品的生防细菌已达到十几种，比如枯草芽孢杆菌qst713和qst2808在美国已经注册并进行商品化生产，用于多种果蔬疫病、灰霉病等常见病害的生物防治；agrobacterium radiobacte k84菌株由于其对果树冠瘿并及桃树根癌病突出的防效已被开发为生防产品并出售。国内关于芽孢杆菌用于植物病害防治的研究报道也比较多，已登记的防病增产的芽孢杆菌商品制剂，如亚宝、麦丰宁、百抗等。目前暂未发现主要针对猕猴桃叶枯病的拮抗菌剂产品，并且有针对性开展的菌种选育工作也很少见。
[0033]
陕西是猕猴桃产业大省，积极探索有效的生物防治途径，积极开发新型广谱拮抗菌株，并充分利用现代发酵工程技术生产拮抗微生物菌剂替代化学药物，针对猕猴桃叶枯病进行大田病害生物防治，增强作物自身生长能力和对病虫害的抗病能力，改善其现有生态环境，进一步建立绿色、可持续发展的生产模式，形成综合长效防控体系，将是未来猕猴桃产业健康有序发展的主要趋势。
[0034]
在本发明的方法有以下优点：
[0035]
(1)拮抗菌剂由一种或几种有益微生物组成，是生物防治的重要手段之一，主要通过有益微生物与病原菌间的拮抗作用、重寄生作用、竞争作用来抑制病原菌的生长繁殖以减少病原菌的数量、降低其致病性，或通过对植株抗性的诱导和对植株的促生作用等减少病原菌的侵染几率，从而对植物起到保护作用。具有无残留无污染、不杀伤天敌、不会(或较少)产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护、成本低、兼防兼治、增产增收等优点，是一种无公害植保新技术，对长期实施猕猴桃病害防治是十分必要的。
[0036]
(2)本发明所制备的新型广谱拮抗菌株的选育工作是制备拮抗菌剂的重要基础，将极大促进其产品的研发和应用，通过筛选、诱变获得抗病能力强的拮抗菌株，充分发挥生物防治作用，对于农业可持续发展，提高经济效益、社会效益和生态效益具有重大意义。
[0037]
(3)本发明制备的防菌剂无化学成分，
①
不会诱发植物病原菌产生抗药性；
②
不会造成农产品农残超标日益严重，影响人、畜安全；
③
不会造成环境污染，自然农业生态系统
的平衡遭到破坏；
[0038]
(4)本发明说制备的防菌剂效果明显、绿色环保、可持续的新型防治途径。
[0039]
(5)本发明方法充分利用现代发酵工程技术生产拮抗微生物菌剂替代化学药物，针对猕猴桃叶枯病进行大田病害生物防治，增强作物自身生长能力和对病虫害的抗病能力，改善其现有生态环境，进一步建立绿色、可持续发展的生产模式，形成综合长效防控体系，将是未来猕猴桃产业健康有序发展的主要趋势。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
[0041]
实施例
[0042]
本实施例涉及一种猕猴桃叶枯病新型生防菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0043]
步骤一，菌株的选定；
[0044]
步骤二，菌株的培养；
[0045]
步骤三，菌株发酵条件优化；
[0046]
步骤四，复合生防菌剂的制备。
[0047]
优选地，步骤一中，所述菌株的选定：枯草芽孢杆菌q14、解淀粉芽孢杆菌j、美丽短芽孢杆菌nf2，其中nf2的保藏编号cgmcc no.12749。
[0048]
优选地，步骤二中，所述菌株的培养具体为以下步骤：
[0049]
(1)菌株活化：将菌株保存于-80℃环境下的原始菌株经无菌操作分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基上活化；
[0050]
(2)生防菌的拮抗试验：平板对峙法，对美丽短芽孢杆菌nf2、枯草芽孢杆菌q14、解淀粉芽孢杆菌j进行拮抗试验；未发现三株菌之间的拮抗作用，因此可混合使用。
[0051]
(3)发酵种子制备：分别将美丽短芽孢杆菌nf2、枯草芽孢杆菌q14和解淀粉芽孢杆菌j的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于恒温振荡器。
[0052]
优选地，步骤(1)中，培养温度30℃，培养时间24h。
[0053]
优选地，步骤(2)中，三种菌株之间的拮抗作用为零。
[0054]
优选地，步骤(3)中，恒温振荡器的温度为30℃，转速为200r/min，培养时间16h。
[0055]
优选地，步骤三中，所述菌株发酵条件优化具体为：
[0056]
步骤a，美丽短芽孢杆菌nf2，发酵温度30℃、200r/min，培养48h，通过正交实验优化培养中的营养成分；结果显示，优化后的美丽短芽孢杆菌nf2的发酵培养基配方为：0.2g/l mgso4、3g/l牛肉膏、10g/l蛋白胨、5g/lnacl、20g/l玉米粉，ph 7.0-7.2，活菌5.4
×
108cfu/ml，符合农用微生物菌剂执行标准gb20287-2006。
[0057]
步骤b，枯草芽孢杆菌q14，发酵温度30℃、200r/min，培养48h，通过正交实验优化培养中的营养成分。结果显示，优化后的枯草芽孢杆菌q14发酵培养基配方为：5g/l nacl、10g/l葡萄糖、0.2g/l mgso4、10g/l蛋白胨、3g/l牛肉膏、20g/l玉米粉，ph 7.0-7.2，活菌数3.7
×
109cfu/ml，符合农用微生物菌剂执行标准gb20287-2006。
[0058]
步骤c，解淀粉芽孢杆菌j，发酵温度30℃、200r/min，培养48h，通过正交实验优化
培养中的营养成分。结果显示，优化后的解淀粉芽孢杆菌j发酵培养基配方为：5g/l nacl、5g/l葡萄糖、0.2g/l mgso4、10g/l蛋白胨、3g/l牛肉膏、15g/l玉米粉，ph 7.0-7.2，活菌数6
×
108cfu/ml，符合农用微生物菌剂执行标准gb20287-2006。
[0059]
优选地，步骤四中，所述复合生防菌剂的制备：将美丽短芽孢杆菌nf2、枯草芽孢杆菌q14、解淀粉芽孢杆菌j的发酵液分别梯度稀释到106、107、108cfu/ml，美丽短芽孢杆菌nf2(108cfu/ml)和枯草芽孢杆菌q14(107cfu/ml)、解淀粉芽孢杆菌j(106cfu/ml)按照1:1:1体积混合，即可。对猕猴桃叶枯病的生防效果最好，相对防效达到81.5％。
[0060]
本实施例还涉及前述的猕猴桃叶枯病新型生防菌剂的制备方法的应用，所述猕猴桃叶枯病新型生防菌剂在4月初至6月底喷施于猕猴桃叶面，每半个月施用一次，可有效防治细菌性叶枯病的发生。
[0061]
本发明通过进一步分离、筛选、诱变、选育针对猕猴桃叶枯病主要病原菌具有安全、高效、广谱、拮抗能力的菌株，不断提高现有拮抗菌株的抗病性能，丰富现有的拮抗菌株资源。本发明所制备的新型广谱拮抗菌株的选育工作是制备拮抗菌剂的重要基础，将极大促进其产品的研发和应用，通过筛选、诱变获得抗病能力强的拮抗菌株，充分发挥生物防治作用，对于农业可持续发展，提高经济效益、社会效益和生态效益具有重大意义。
[0062]
目前，用于植物病害防治的拮抗微生物种类很多，主要有细菌、真菌、放线菌、芽孢杆菌属和假单胞菌属等。用于生物防治的细菌主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属、放射性土壤农杆菌、沙雷氏菌属和欧文氏菌属等，其中研究和应用最多的是芽孢杆菌属和假单胞菌属。
[0063]
美国开发成为产品的生防细菌已达到十几种，比如枯草芽孢杆菌qst713和qst2808在美国已经注册并进行商品化生产，用于多种果蔬疫病、灰霉病等常见病害的生物防治；agrobacterium radiobacte k84菌株由于其对果树冠瘿并及桃树根癌病突出的防效已被开发为生防产品并出售。国内关于芽孢杆菌用于植物病害防治的研究报道也比较多，已登记的防病增产的芽孢杆菌商品制剂，如亚宝、麦丰宁、百抗等。目前暂未发现主要针对猕猴桃叶枯病的拮抗菌剂产品，并且有针对性开展的菌种选育工作也很少见。
[0064]
陕西是猕猴桃产业大省，积极探索有效的生物防治途径，积极开发新型广谱拮抗菌株，并充分利用现代发酵工程技术生产拮抗微生物菌剂替代化学药物，针对猕猴桃叶枯病进行大田病害生物防治，增强作物自身生长能力和对病虫害的抗病能力，改善其现有生态环境，进一步建立绿色、可持续发展的生产模式，形成综合长效防控体系，将是未来猕猴桃产业健康有序发展的主要趋势。
[0065]
本实施例是针对猕猴桃叶枯病分离筛选的广谱拮抗菌株数量少，现已发现和鉴定的种类也很少，这对于形成多样化、效果佳的拮抗菌剂产品是极大的制约。在广阔的大自然，尚有很多具有拮抗能力的菌株值得我们去发现，并可通过诱变提高菌株原有的拮抗能力，这对于丰富和提高现有拮抗菌株的数量、种类和拮抗能力都具有重要的研究价值和应用价值。
[0066]
根据中国农业部所提供的数据估测，2008年全国化学农药需求总量(有效成分)预计为29.82万吨，我省农药年需求超过1万吨。我国化肥(n.p.k)的使用呈逐年增加，1990年我国化肥生产总量为1879.2万吨，而化肥施用量则达到2590.3万吨，1995年化肥施用量已达3594.6万吨，本世纪初化肥施用量已超过4000万吨。
[0067]
近年来，大量使用化学药品带来的一系列严重后果已引起人们广泛关注，随着人
们生活水平的提高和对自身健康的重视，不使用化肥和化学农药的绿色食品越来越受到人们青睐。在猕猴桃的生产上，施用微生物拮抗菌剂来取代化学农药进行种植、防害和生产，可以降低生产成本，减少化学性污染，势必在未来的农业发展中逐步替代化学农药的市场占有率，随之带来的市场需求也将逐步增加。我国以绿色食品为代表的安全优质农产品获得快速发展，截至2009年9月末，全国绿色食品企业共6489家，产品总数17899个，生产总量达9000万吨，产品销售总额超过2772亿元，年均增长31.3％。有机食品具有无人工合成物质、无转基因、无化学农药、无化肥、无重金属、无生长调节激素等特性，是食品安全体系中最高标准。根据ifoam的统计，近年全球有机食品市场一直保持年均20％-30％增速，2008年全球有机食品的市场规模为500亿美元。
[0068]
我国开展有机食品认证以来，有机食品行业获得了快速发展，截至2008年末，我国有机产品认证企业已达2800多家，有机食品市场规模已达81亿元，有机食品对农药要求十分严格，只有通过“有机产品认证”的生物农药才能用于有机农药生产，化学农药无法进入该市场。同时，绿色无公害食品、有机食品的价格通常比普通产品高出50％-100％左右，具有较高经济附加值，农民生产积极性日益增加。随着我国绿色无公害农业及有机农业的迅速发展，我国生物农药特别是拮抗菌剂的市场需求规模将相应持续、快速增长。
[0069]
本发明的方法有以下优点：
[0070]
(1)拮抗菌剂由一种或几种有益微生物组成，是生物防治的重要手段之一，主要通过有益微生物与病原菌间的拮抗作用、重寄生作用、竞争作用来抑制病原菌的生长繁殖以减少病原菌的数量、降低其致病性，或通过对植株抗性的诱导和对植株的促生作用等减少病原菌的侵染几率，从而对植物起到保护作用。具有无残留无污染、不杀伤天敌、不会(或较少)产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护、成本低、兼防兼治、增产增收等优点，是一种无公害植保新技术，对长期实施猕猴桃病害防治是十分必要的。
[0071]
(2)本发明所制备的新型广谱拮抗菌株的选育工作是制备拮抗菌剂的重要基础，将极大促进其产品的研发和应用，通过筛选、诱变获得抗病能力强的拮抗菌株，充分发挥生物防治作用，对于农业可持续发展，提高经济效益、社会效益和生态效益具有重大意义。
[0072]
(3)本发明制备的防菌剂无化学成分，
①
不会诱发植物病原菌产生抗药性；
②
不会造成农产品农残超标日益严重，影响人、畜安全；
③
不会造成环境污染，自然农业生态系统的平衡遭到破坏；
[0073]
(4)本发明说制备的防菌剂效果明显、绿色环保、可持续的新型防治途径。
[0074]
(5)本发明方法充分利用现代发酵工程技术生产拮抗微生物菌剂替代化学药物，针对猕猴桃叶枯病进行大田病害生物防治，增强作物自身生长能力和对病虫害的抗病能力，改善其现有生态环境，进一步建立绿色、可持续发展的生产模式，形成综合长效防控体系，将是未来猕猴桃产业健康有序发展的主要趋势。
[0075]
发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。