一种用于培养冬虫夏草菌的液体培养基及其制法的制作方法

本发明属于微生物培养领域，涉及一种用于培养冬虫夏草菌的液体培养基，具体地涉及一种促进冬虫夏草菌产生液体分生孢子的液体培养基及其制备方法。

背景技术：

冬虫夏草菌[ophiocordycepssinensis(berk.)g.h.sung,j.m.sung,hywel-jones&spatafora(≡cordycepssinensis(berk.)sacc.)]是青藏高原特有的名贵药用菌，科学研究证明其具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等广泛的药理作用。由于其独特的药用价值以及良好的应用前景，加上分布地域的局限，野生资源相对有限，其人工培植成为近几十年的研究热点和难点。

作为一种虫生真菌，冬虫夏草菌隶属子囊菌门，其生活史包括有性型和无性型两个阶段。形态学研究和分子鉴定均证实中国被毛孢(hirsutellasinensis)是冬虫夏草的无性型。其有性阶段主要是由冬虫夏草菌专性寄生钩蝠蛾属(thitarodes，属鳞翅目)为主的数十种昆虫的幼虫阶段完成的，其中幼虫虫体相当于真菌生长的培养基。

在真菌的液体发酵过程中，根据培养条件的不同，产生的繁殖体形式可能有两种：芽生孢子(blastospore)和液生分生孢子(submergedconidia)。其中液生分生孢子的形状、大小与气生分生孢子相近，往往是通过芽生孢子通过微循环产孢的方式产生，也可能直接由菌丝产生，其着生的分生孢子梗往往比固体培养基上的气生分生孢子梗小。分生孢子的培养与大量制备是冬虫夏草人工培植过程中的一个重要环节。目前，冬虫夏草分生孢子研究存在的主要困难是分生孢子产生周期长、分生孢子产量低、培养过程中容易受到其它微生物的污染等。和其它常见真菌相比，冬虫夏草菌的产孢量非常低。如何通过培养基的改良和培养条件的优化获得较大浓度的分生孢子，是冬虫夏草顺利实现产业化亟待解决的问题之一。

在现有技术中，冬虫夏草菌液体培养基的常规成分为碳源、氮源和无机盐，目前对冬虫夏草菌液体培养基的研究也主要集中在提高冬虫夏草菌的菌丝产量上(刘欣,张宗豪,李玉玲,等.冬虫夏草菌液体发酵培养基的优化研究[j].中国草地学报,2010,32(s1):14-16.)。已有报道的冬虫夏草分生孢子基本上都是固体培养的分生孢子，产量低而且培养周期长，培养得到的分生孢子产量一般小于1×10⁵个/ml(李玉玲.不同因子对冬虫夏草真菌产生分子孢子的研究[j].食用菌,2002,24(5):8-8.)。所以，目前急需一种能获得较大浓度的分生孢子的冬虫夏草菌液体培养基。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的限制，提供一种促进冬虫夏草菌产生液生分生孢子的液体培养基。

本发明的第一个目的是提供一种用于培养冬虫夏草菌的液体培养基，含有碳源、氮源，以及复合维生素b和菜籽油中的一种或两种。优选地，所述碳源选自马铃薯、玉米碴和蔗糖中的一种或多种，所述氮源选自蛋白胨和酵母浸出物中的一种或两种。更优选地，所述培养基的碳源和氮源的重量比为100:1～20，优选地，以重量份数计，所述培养基含有马铃薯100～200份，玉米碴20～50份，蛋白胨2.5～10份，酵母浸出物1～10份，和蔗糖10～20份，以及0.1份～1.5份复合维生素b和1～5份菜籽油中的一种或两种。

优选地，每升所述培养基含有马铃薯100～200g，玉米碴20～50g，蛋白胨2.5～10g，酵母浸出物1～10g，和蔗糖10～20g，以及0.1g～1.5g复合维生素b和1～5g菜籽油中的一种或两种。进一步优选地，每升所述培养基含有马铃薯150g，玉米碴30g，蛋白胨5g，酵母浸出物2g，和蔗糖20g，以及0.25g～0.5g复合维生素b和1.5g～3g菜籽油中的一种或两种。所述液体培养基还包含余量的水。

本发明的第二个目的是提供一种用于培养冬虫夏草菌的液体培养基的制备方法，所述方法包括：向水中加入碳源、氮源，以及复合维生素b和菜籽油中的一种或两种，加水搅拌至充分溶解，即得。优选地，所述方法包括：(1)称取玉米碴于开水中煮10-20分钟；(2)向步骤(1)得到的产物中加入马铃薯，煮20-30分钟，冷却后过滤得到滤液；(3)称取蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖，以及复合维生素b和菜籽油中的一种或两种，加入到步骤(2)得到的滤液中，加水搅拌至充分溶解；(4)将步骤(3)得到的产物加水定容后分装灭菌。

本发明的第三个目的是提供了一种通过所述液体培养基培养冬虫夏草菌，进而得到高浓度冬虫夏草菌液生分生孢子的一种培养方法，包括以下步骤：将冬虫夏草菌种接种于上述液体培养基，在14～18℃和90～120rpm下摇床震荡培养15～30天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2％～5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，在14～18℃和90～120rpm下摇床震荡培养15～30天，即可收获。

复合维生素b、菜籽油的加入分别可以促进冬虫夏草菌液生分生孢子的产生，产孢浓度可达10⁶个/ml数量级，其中复合维生素b的加入效果更为明显。二者同时加入可以得到最高浓度的液生分生孢子，浓度可达2.5×10⁶个/ml。而两种促进剂都不添加的对照组，其液生分生孢子产量低于1×10⁴个/ml，无法用血球计数板直接计数。

本发明的培养基用于培养冬虫夏草菌液生分生孢子具有培养周期短、产生分生孢子浓度高、更不易污染其它微生物等显著优点。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施例3的方法培养得到的冬虫夏草液生分生孢子的显微镜镜检图(400×)。

图2为本发明实施例3的方法培养得到的冬虫夏草菌液生分生孢子的扫描电镜图(20μm)。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用于冬虫夏草菌液体培养的玻璃三角瓶规格均相同，容积为1000ml。

为了更好地理解本发明，下面以冬虫夏草菌菌株ioz-07为例阐释本发明，该实施例用于解释而不是限制本发明。

实施例1

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖20克，加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟后，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。由于分生孢子浓度过低，使用血球计数板无法直接计数，故通过离心的方法将发酵液浓缩100倍后再进行计数，经计数其液生分生孢子浓度为3.5×10³个/ml。

实施例2

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨(购自oxoid公司，下同)5克，酵母浸出物(购自oxoid公司，下同)2克，蔗糖20克，复合维生素b(购自汤臣倍健公司，下同)一粒(0.5g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，菜籽油(购自鲁花公司，下同)3克加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为2.5×10⁶个/ml。

实施例3

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖20克，菜籽油3克加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为1.5×10⁶个/ml。培养得到的冬虫夏草液生分生孢子的显微镜镜检图和扫描电镜图见图1和图2。

实施例4

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖20克，复合维生素b一粒(0.5g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为2.0×10⁶个/ml。

实施例5

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取20克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入100克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖20克，复合维生素b一粒(0.5g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，菜籽油3克加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为2.4×10⁵个/ml。

实施例6

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨2.5克，酵母浸出物1克，蔗糖20克，复合维生素b一粒(0.5g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，菜籽油3克，加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为2.8×10⁵个/ml。

实施例7

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖10克，复合维生素b一粒(0.5g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，菜籽油3克，加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为1.5×10⁵个/ml。

实施例8

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖10克，复合维生素b二分之一粒(0.25g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，菜籽油3克，加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为2.2×10⁶个/ml。

实施例9

本实施例中的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取30克玉米碴于开水中煮15分钟，而后加入150克切条的去皮马铃薯，小火煮25分钟，冷却，过滤。称取蛋白胨5克，酵母浸出物2克，蔗糖10克，复合维生素b一粒(0.5g)(需事先研磨成粉末，充分溶于水)，菜籽油1.5克，加入到上述滤液中，加水搅拌至充分溶解，加水定容至1000ml，分装至三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，置于15℃培养室预冷备用。

将实验室保存的冬虫夏草菌种ioz-07接种于上述液体培养基，16℃，110rpm摇床震荡培养18天即可获得接种用冬虫夏草菌种。按体积比2.5％的接种量，将冬虫夏草液体菌种接种于新的液体培养基中，16℃，110rpm摇床震荡培养约30天即可收获，发酵液用血球计数板计数。由于发酵液中含有大量的菌丝体，对计数有干扰，故用滤膜将菌丝体过滤后，再进行分生孢子的计数。取适量上述过滤液于血球计数板上，显微镜下观察计数，统计分生孢子数量。经计数液生分生孢子浓度为2.4×10⁶个/ml。