本发明属于污水生物处理技术领域，特别涉及一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法。
背景技术：
温室气体氧化亚氮排放问题和污泥膨胀问题是污水处理厂一直面临且急需解决的两个关键问题；污水处理厂中氧化亚氮产生途径有三种，分别为羟胺的不完全氧化、异养反硝化过程及硝化菌的反硝化过程；其中，羟胺的不完全氧化是指在氨氧化细菌的亚硝化过程中，氨态氮在跨膜蛋白氨单加氧酶的作用下，在细胞周质内生成羟胺；在羟胺被羫胺氧化酶催化氧化生成亚硝态氮的过程，会出现中间产物，如硝酰基等；在酸性条件下，该中间产物可以自发或被酶与其他化学物质，如细胞色素p460或亚铁离子等，催化发生化学反应生成氧化亚氮；异养反硝化过程是指硝酸盐在硝酸盐还原酶，亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶的催化的作用下，依此从亚硝酸盐，一氧化氮，还原到氧化亚氮的过程；硝化菌的反硝化过程是指亚硝酸盐在亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶的催化作用下，依此从亚硝酸盐，一氧化氮，还原到氧化亚氮的过程。
污水处理系统在不同的运行条件或运行模式下，上述途径对于总氧化亚氮排放的贡献不同；如何快速识别何种途径是氧化亚氮产生的主要途径仍是一个有待解决的问题；其中，硝化菌的反硝化过程和异养反硝化过程中氧化亚氮的产生过程均与一氧化氮还原酶活性有关；通过分析一氧化氮还原酶活性与氧化亚氮的逸散情况，可以区分羟胺的不完全氧化过程和反硝化过程；通过分析该酶活性与有机物的浓度的关系，可以区分异养反硝化过程和硝化菌的反硝化过程。
引起污水处理厂中活性污泥膨胀的原因很多，氮氧化物的累积引起的污泥膨胀问题是其中重要的一种，在活性污泥内部氮氧化物会出现累积，一氧化氮还原酶活性必然较低或没有，通过分析一氧化氮还原酶活性，可以区分氮氧化物的累积引起的污泥膨胀问题和其他类型的污泥膨胀问题。
综上所述，解决上述问题的核心是测定一氧化氮还原酶的催化活性；如何高效而便捷地从活性污泥中提取一氧化氮还原酶，并测定其酶活性则是一项必不可少的工作。目前，尚无污水生物处理活性污泥中提取一氧化氮还原酶的相关报道。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，以实现高效地从活性污泥中提取一氧化氮还原酶并测定其酶活性。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，包括以下步骤：
步骤1、对待测活性污泥进行离心分离，收集固体样品；采用缓冲液对固相产物进行反复冲洗；采用缓冲溶液对冲洗后的固相样品定容，至待测活性污泥的原始容积，并混合均匀，得到活性污泥样品；
步骤2、对活性污泥样品进行破碎，离心，得到上清液；在上清液中加入苯乙醇和十二烷基-beta-d-麦芽糖苷进行反应，反应结束后，离心，得到待测一氧化氮还原酶样品；
步骤3、在厌氧状态下，向密闭容器中加入缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯溶液，并充入一氧化氮气体，得到酶活性反应液；在酶活性反应液中加入步骤2中的待测一氧化氮还原酶样品，震荡后，利用气相色谱法，测定氧化亚氮的含量，进而计算得到一氧化氮还原酶的活性。
进一步的，步骤1中，冲洗过程中的缓冲液采用20-200mm的tris-hcl缓冲液，ph为7.5-8.0；
步骤1及步骤3中，缓冲溶液采用在5-50mm的tris-hcl缓冲液中加入kcl配制得到，其中，kcl的浓度为15-150mm。
进一步的，步骤1中，离心过程，离心转速为4000-5000r/min，离心时间为5-15min。
进一步的，步骤2中，破碎后的离心过程，采用在5000-6000g条件下，离心时间为10-15min；反应后的离心过程，采用在40000-186400g条件下，离心时间为90-120min。
进一步的，步骤1及步骤2的温度条件为4℃以下。
进一步的，步骤2中，将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎，破碎功率为500-1000bar。
进一步的，步骤2中，苯乙醇及十二烷基-beta-d-麦芽糖苷的体积比为(0.1-0.5)：(0.1-0.5)；其中，苯乙醇溶液的质量浓度为0.02％、十二烷基-beta-d-麦芽糖苷的质量浓度为1％。
进一步的，酶活性反应液中缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯的体积比为2.6:0.1:0.1:0.1；其中，抗坏血酸钠溶液的浓度为1-1.5m，乙酸钠溶液的浓度为2.5-3m，吩嗪硫酸甲酯溶液的浓度为0.25-0.5mm。
进一步的，步骤3中，采用在恒温培养摇床上进行震荡，温度为28-30℃，震荡转速为150-180r/min，震荡时间为20-30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，通过采用缓冲液对待测活性污泥进行反复冲洗，有效去除了待测活性污泥中的杂质，同时，确保了活性污泥样品中一氧化氮还原酶的纯度；通过对活性污泥样品的破碎、离心实现了对一氧化氮还原酶的高效提取，提取过程操作步骤简单快速；采用苯乙醇有效维持了细胞的活性，通过加入十二烷基-beta-d-麦芽糖苷作为细胞裂解液，实现了对细胞膜的溶解，实现了一氧化氮还原酶的高效释放；采用气相色谱法测定氧化亚氮的量，实现对一氧化氮还原酶活性的测定，测定结果准确，高效稳定，为探索污水生物处理中一氧化氮产生和控制的酶水平研究奠定基础。
进一步的，冲洗过程tris-hcl缓冲液，有效维持了提取过程的ph环境，避免对细胞的影响；定容和破碎过程采用在tris-hcl缓冲液加入kcl，有效稳定了一氧化氮还原酶蛋白的折叠状态，保持待测样品中酶活性的稳定。
进一步的，采用合适的离心转速，避免了离心转速过低时，无法实现分离出活性污泥样品，离心转速过高时，易造成活性污泥样品中杂质较多。
进一步的，酶活性测定过程，通过加入缓冲溶液，有效维持了酶活性测定体系中的ph环境，防止极端ph对酶蛋白的影响；通过加入抗坏血酸钠为酶催化过程提供电子，乙酸钠溶液维持酶催化状态的稳定，加入吩嗪硫酸甲酯溶液将抗坏血酸钠所供应的电子传递给酶的催化中心；加入一氧化氮气体为酶催化过程提供底物，有效提高了酶活性测定结果的准确性。
进一步的，一氧化氮还原酶提取过程，采用在4℃以下，确保了还原酶的稳定性，避免了还原酶在提取过程出现失活，保证了测定结果的准确性。
本发明所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，通过优化低温高压破碎条件，优化测定酶活性的条件和时间，大大提高了所测定酶的活性，提高酶活性测定的稳定性，且利用低温高压破碎法提取酶活性方便快捷，对设备要求较低，有利于方法的推广和运用；本发明中采用的试剂中tris-hcl缓冲液、氯化钾、抗坏血酸钠、乙酸钠、吩嗪硫酸甲酯及一氧化氮气体，具有成分简单、制备简便及成本低廉的特点；本发明所述的测定方法，能够为探索污水生物处理中污泥膨胀问题和氧化亚氮产生和逸散问题奠定基础。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题，技术方案及有益效果更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，包括以下步骤：
步骤1、多次冲洗
将待测的活性污泥进行离心，收集固体样品；将固体样品采用缓冲液重新定容，并利用振荡器将定容后的混合物重新混匀，对混合物再次离心，收集固体样品；重复上述步骤，利用缓冲液冲洗固体样品，反复冲洗多次；反复冲洗后，采用缓冲溶液重新定容固体样品至原始容积，并混匀，得到活性污泥样品；其中，冲洗过程中的缓冲液采用20-200mm的tris-hcl缓冲液，ph为7.5-8.0；
样品定容过程中的缓冲溶液采用在5-50mm的tris-hcl缓冲液中加入kcl配制得到，其中，kcl的浓度为15-150mm，缓冲溶液的ph为7.5-8.0；离心分离过程，离心转速为4000-5000r/min，离心时间为5-15min。
步骤2、破碎纯化
将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎，破碎功率为500-1000bar，破碎次数为1-4次；并将破碎后的样品再次离心，得到上清液；其中，离心条件为5000-6000g，离心时间为10-15min；在上清液中加入苯乙醇和十二烷基-beta-d-麦芽糖苷进行反应，反应结束后，离心，得到待测一氧化氮还原酶样品；其中，离心条件为40000-186400g，离心时间为90-120min；苯乙醇及十二烷基-beta-d-麦芽糖苷的体积比为(0.1-0.5)：(0.1-0.5)；其中，苯乙醇溶液的质量浓度为0.02％、十二烷基-beta-d-麦芽糖苷的质量浓度为1％。
当制备的待测一氧化氮还原酶样品没有立即使用时，将待测一氧化氮还原酶样品储存在-80℃。
上述步骤1及步骤2均在4℃以下进行操作。
步骤3、测定活性
在厌氧状态下，向密闭容器中加入缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯，并充入5-10ml2.5mol/m3一氧化氮气体，得到酶活性反应液；在酶活性反应液中加入步骤2中的待测一氧化氮还原酶样品，放置在恒温培养摇床上剧烈震荡反应；剧烈震荡过程，温度为28-30℃，震荡转速为150-180r/min，震荡反应时间为20-30min；震荡结束后，利用气相色谱法，测定氧化亚氮的含量，进而计算一氧化氮还原酶的活性；
其中，酶活性反应液中缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯的体积比为2.6:0.1:0.1:0.1；其中，抗坏血酸钠溶液的浓度为1-1.5m，乙酸钠溶液的浓度为2.5-3m，吩嗪硫酸甲酯溶液的浓度为0.25-0.5mm。
一氧化氮还原酶的活性采用单位体积一氧化氮还原酶所具有的酶活力单位进行表示，其中，一个酶活力单位为每分钟产生氧化亚氮的量表示；具体计算公式如下：
一氧化氮还原酶的活性＝δn/(t*v)
式中，δn为待测样品中氧化亚氮的产生量与空白对照组的差值；t为震荡反应时间；v为待测一氧化氮还原酶样品。
本发明所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，通过优化低温高压破碎条件，优化测定酶活性的条件和时间，可以大大提高所测定酶的活性，提高酶活性测定的稳定性，且利用低温高压破碎法提取酶活性方便快捷，对设备要求较低，有利于方法的推广和运用；本发明中采用的试剂中tris-hcl缓冲液、氯化钾、抗坏血酸钠、乙酸钠、吩嗪硫酸甲酯及一氧化氮气体，具有成分简单、制备简便及成本低廉的特点；本发明所述的测定方法，能够为探索污水生物处理中污泥膨胀问题和氧化亚氮产生和逸散问题奠定基础。
实施例1
本实施例1提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，包括以下步骤：
取20mla/osbr的缺氧池的活性污泥样品，以4000r/min离心5min使活性污泥样品中的泥水分离，倾倒上清液，收集固体样品，并将固体样品采用缓冲液定容到20ml；其中，缓冲液采用20mm的tris-hcl缓冲液，ph为7.5；利用振荡器将定容后的溶液重新混匀，离心分离，得到固体泥样；重复上述冲洗操作三次；反复冲洗后，利用缓冲溶液重新定容固体样品至20ml，并混匀，得到活性污泥样品。
其中，缓冲溶液采用在tris-hcl缓冲液中加入kcl配制得到，其中，tris-hcl缓冲液的浓度为5mm，kcl的浓度为15mm；缓冲溶液的ph为7.5。
将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎，破碎功率为500bar，破碎次数为4次；破碎后的样品，在5000g条件下，离心10min，分离杂质，得到上清液；取10ml上清液至离心管中，加入0.1ml质量浓度为0.02％的苯乙醇，边搅拌边加入0.1ml质量浓度为1％的十二烷基-beta-d-麦芽糖苷；在冰浴环境中，进行反应15min；反应结束后，在40000g条件下，离心90min，分离杂质，得到待测一氧化氮还原酶样品，用于测定一氧化氮还原酶活性；如果待测一氧化氮还原酶样品没有立即使用，将待测一氧化氮还原酶样品储存在-80℃环境中。
上述提取过程中，除特殊说明外，其余步骤均在温度为4℃以下进行操作。
采用橡胶隔片对13ml的厌氧反应容器进行密封，加入2.6ml缓冲溶液，0.1ml1m抗坏血酸钠溶液，0.1ml2.5m乙酸钠溶液，0.1ml0.25mm吩嗪硫酸甲酯溶液，依次加入后，分别加入0.1ml待测一氧化氮还原酶样品和5ml2.5mol/m3一氧化氮气体；放入摇床中剧烈震荡反应，剧烈震荡过程，温度为28℃，震荡转速为150r/min，震荡反应时间为20min；
震荡结束后，利用注射器在反应容器中提取1ml气体样品，用氩气稀释后，利用气相色谱法测定气体样品中氧化亚氮的含量。
本实施例1中，设置空白对照组，空白对照组将待测一氧化氮还原酶样品等体积置换为空白样品。
根据检测结果计算a/osbr的缺氧池的活性污泥样品中的一氧化氮还原酶活性的值为10.6u/m，其精确度为3.9％。
实施例2
本实施例2提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，包括以下步骤：
取20mla/osbr的缺氧池的活性污泥样品，以5000r/min离心15min使活性污泥样品中的泥水分离，倾倒上清液，收集固体样品，并将固体样品采用缓冲液定容到20ml；其中，缓冲液采用200mm的tris-hcl缓冲液，ph为8.0；利用振荡器将定容后的溶液重新混匀，离心分离，得到固体泥样；重复上述冲洗操作三次；反复冲洗后，利用缓冲溶液重新定容固体样品至20ml，并混匀，得到活性污泥样品。
其中，缓冲溶液采用在tris-hcl缓冲液中加入kcl配制得到，其中，tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，kcl的容度为150mm；缓冲溶液的ph为8.0。
将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎，破碎功率为500bar，破碎次数为1次；破碎后的样品，在6000g条件下，离心15min，分离杂质，得到上清液；取10ml上清液至离心管中，加入0.5ml质量浓度为0.02％的苯乙醇，边搅拌边加入0.5ml质量浓度为1％的十二烷基-beta-d-麦芽糖苷；在冰浴环境中，进行反应15min；反应结束后，在186400g条件下，离心120min，分离杂质，得到待测一氧化氮还原酶样品，用于测定一氧化氮还原酶活性；如果待测一氧化氮还原酶样品没有立即使用，将待测一氧化氮还原酶样品储存在-80℃环境中。
上述提取过程中，除特殊说明外，其余步骤均在温度为4℃以下进行操作。
采用橡胶隔片对13ml的厌氧反应容器进行密封，加入2.6ml缓冲溶液，0.1ml1.5m抗坏血酸钠溶液，0.1ml3m乙酸钠溶液，0.1ml0.5mm吩嗪硫酸甲酯溶液，依次加入后，分别加入0.1ml待测一氧化氮还原酶样品和10ml2.5mol/m3一氧化氮气体；放入摇床中剧烈震荡反应，剧烈震荡过程，温度为30℃，震荡转速为180r/min，震荡反应时间为30min；
震荡结束后，利用注射器在反应容器中提取1ml气体样品，用氩气稀释后，利用气相色谱法测定气体样品中氧化亚氮的含量。
本实施例2中，设置空白对照组，空白对照组将待测一氧化氮还原酶样品等体积置换为空白样品。
根据检测结果计算a/osbr的缺氧池的活性污泥样品中的一氧化氮还原酶活性的值为6.58u/m，其精确度为0.9％。
实施例3
本实施例3提供了一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法，包括以下步骤：
取20mla/osbr的好氧池的活性污泥样品，以4000r/min离心10min使活性污泥样品中的泥水分离，倾倒上清液，收集固体样品，并将固体样品采用缓冲液定容到20ml；其中，缓冲液采用200mm的tris-hcl缓冲液，ph为8.0；利用振荡器将定容后的溶液重新混匀，离心分离，得到固体泥样；重复上述冲洗操作三次；反复冲洗后，利用缓冲溶液重新定容固体样品至20ml，并混匀，得到活性污泥样品。
其中，缓冲溶液采用在tris-hcl缓冲液中加入kcl配制得到，其中，tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，kcl的浓度为150mm；缓冲溶液的ph为8.0。
将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎，破碎功率为500bar，破碎次数为4次；破碎后的样品，在5000g条件下，离心10min，分离杂质，得到上清液；取10ml上清液至离心管中，加入0.1ml质量浓度为0.02％的苯乙醇，边搅拌边加入0.1ml质量浓度为1％的十二烷基-beta-d-麦芽糖苷；在冰浴环境中，进行反应15min；反应结束后，在40000g条件下，离心90min，分离杂质，得到待测一氧化氮还原酶样品，用于测定一氧化氮还原酶活性；如果待测一氧化氮还原酶样品没有立即使用，将待测一氧化氮还原酶样品储存在-80℃环境中。
上述提取过程中，除特殊说明外，其余步骤均在温度为4℃以下进行操作。
采用橡胶隔片对13ml的厌氧反应容器进行密封，加入2.6ml缓冲溶液，0.1ml1m抗坏血酸钠溶液，0.1ml2.5m乙酸钠溶液，0.1ml0.25mm吩嗪硫酸甲酯溶液，依次加入后，分别加入0.1ml待测一氧化氮还原酶样品和5ml2.5mol/m3一氧化氮气体；放入摇床中剧烈震荡反应，剧烈震荡过程，温度为28℃，震荡转速为180r/min，震荡反应时间为25min；
震荡结束后，利用注射器在反应容器中提取1ml气体样品，用氩气稀释后，利用气相色谱法测定气体样品中氧化亚氮的含量。
本实施例3中，设置空白对照组，空白对照组将待测一氧化氮还原酶样品等体积置换为空白样品。
根据检测结果计算a/osbr的缺氧池的活性污泥样品中的一氧化氮还原酶活性的值为6.19u/m，其精确度为13.0％。
以上所述仅表示本发明的优选实施方式，任何人在不脱离本发明的原理下而做出的结构变形、改进和润饰等，这些变形、改进和润饰等均视为在本发明的保护范围内。