一种复方精油及其制备方法和应用与流程

本发明涉及复方精油技术领域，更具体地，涉及一种复方精油及其制备方法和应用。

背景技术：

精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中，通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶剂提取法提炼萃取的挥发性芳香物质。其通常具有以下功能：1)可刺激大脑前叶分泌出内啡肽及脑啡肽两种荷尔蒙，使精神呈现舒适的状态；2)可杀菌消炎、防传染病、防发炎，防痉挛、促进细胞新陈代谢及细胞再生功能；3)加强呼吸道的免疫功能、发汗或解热作用、化痰作用；4)能适用于各种皮肤，发挥紧实、舒缓的特性等等。

然而，现有技术中，通常采用多种植物精油复合得到复方精油，以达到相辅相成、增强疗效的作用，如申请号为201810570138.3的专利公开了一种复方抑菌精油，包含如下重量配比的原料：圆柏精油5-10份、荷荷巴精油1-2份、天竺葵精油1-3份、甘菊精油1-3份、罗勒精油1-3份、玉兰花精油1-2份、荆介精油1-2份、艾蒿精油1-3份、杜鹃精油1-5份、人参精油1-2份、白芷精油1-2份和茶树精油1-2份，该复方精油中各组分的利用率低，且成分复杂多样，生产成本高。

因此，开发出一种原料较为简单，成本低廉，同时还能保障具有较高的抗氧化和抑菌活性的产品对于天然保鲜防腐具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复方精油的制备方法，本发明提供的复方精油原料成分简单，成本低廉，制备工艺清洁环保，同时具有较高的抗氧化和抑菌活性。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种复方精油的制备方法，包括以下步骤：

1)将丁香、迷迭香粉碎成20～60目，按照丁香与迷迭香的质量比为1：1～3的比例混合，得预处理料；

2)将步骤1)所得预处理料投入超临界萃取釜中，以萃取的温度为40～60℃，萃取的压力为30～50mpa，萃取的时间为40～50min，进行提取，得复方精油，所述复方精油中包括以下相对含量的各组分：丁香酚的相对含量为50～55％，乙酸丁香酚酯的相对含量为25～28％，β-石竹烯的相对含量为8～10％，桉叶油醇的相对含量为3～5％。

优选的，步骤1)中丁香和迷迭香粉碎为60目。

优选的，步骤2)中萃取的温度为55℃，萃取的压力为40mpa，萃取的时间为45min。

本发明的目的之二在于提供一种上述任一制备方法得到的复方精油。

本发明的目的还在于提供一种由上述任一方法制备得到的复方精油在水果保鲜中的应用。

优选的，使用时，将所述复方精油配置成1～5ml/l的浓度。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的复方精油其原料配比简单，所得复方精油中活性成分高，同时具有较高的抗氧化和抑菌活性，且制备工艺清洁环保；

(2)本方案采用将丁香与迷迭香料按比例配好后，再进行超临界萃取，相比于将丁香和迷迭香分别单独提取，再按比例调配，可以显著提高各成分的提取率，且提取的物质活性成分高；

(3)将本发明提供的复方精油用于水果保鲜，相对于传统的化学保鲜剂等，绿色安全无污染，对于人体健康无毒副作用，且保鲜效果优良。

附图说明

图1是本发明中丁香精油浓度与dpph清除率的关系；

图2本发明中迷迭香精油浓度与dpph清除率的关系；

图3是本发明中三种精油浓度与dpph清除率的关系；

图4是本发明中不同m复方精油浓度与dpph清除率的关系；

图5是本发明中不同m复方精油抑菌效果图；

图6是丁香总离子色谱图；

图7是迷迭香总离子色谱图；

图8是本发明中复方精油(m＝1:3)总离子色谱图；

图9是本发明中时间对出油率的影响图；

图10是本发明中温度对出油率的影响图；

图11是本发明中压力对出油率的影响图；

图12是本发明中粉碎度对出油率的影响图；

图13是丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提ppo活性的影响图；

图14是丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提pal活性的影响图；

图15是丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提pod活性的影响图；

图16是蔗糖标准曲线图；

图17是丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提可溶性糖含量的影响图；

图18是复方精油和单方精油对红提ppo活性的影响图；

图19是复方精油和单方精油对红提pal活性的影响图；

图20是复方精油和单方精油对红提pod活性的影响图；

图21是复方精油和单方精油对红提可溶性糖含量的影响图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明实施例中所用仪器与材料如下：

仪器：6890n-5973n型气相色谱质谱联用仪(美国agilent公司)；dfy-1000型摇摆式高速粉碎机(温市林大机械有限公司)；me204e/02型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器公司)；751型可见分光光度计(上海佑科仪器有限公司)；fy230-40-11型超临界萃取装置(美国appliedseparations公司)，spx-150型生化培养箱(上海跃进医疗机械有限公司)；sq510c全自动高压蒸汽灭菌锅(重庆雅马拓科技有限公司)；sw-cj-1f型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

材料：丁香产地四川；迷迭香(康美药业)；正已烷(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；dpph(含量>97％，凯玛生化有限公司)；液态co2(含量>99.995％，北京兆格气体科技有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；空白药敏试纸(6mm，南京茂捷生物科技有限公司)；nacl(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；琼脂粉(生化试剂，强顺化工有限公司)；胰蛋白胨(分析纯，oxodi有限公司)；酵母粉(含量30％，oxodi有限公司)；氢氧化钠(分析纯，西陇化工股份有限公司)；金黄色葡萄球菌(上海鲁微科技有限公司)。

实施例1

取粉碎为40目丁香和迷迭香，分别称取混合样品20g(原料丁香和迷迭香质量比m＝1:0；9:1；7:1；5:1；3:1；1:1；1:3；1:5；1:7；1:9；0:1)投入容积为100ml超临界萃取釜中。在萃取温度30℃、萃取压力30mpa下，提取得到一份丁香精油、一份迷迭香精油以及9份复方精油。

以下对实施例1制备得到的丁香精油、迷迭香精油以及复方精油进行活性检测

1、检测方法

1.1、dpph法测定抗氧化活性

称取约0.0100g精油，用无水乙醇溶解稀释500倍，得浓度为0.042mg/ml的精油样品。取10ml容量瓶共11个。分为空白(1个)、对照组(5个)和实验组(5个)共3组。再取1ml，2ml，3ml，4ml，5ml各两份分别注入对照组和实验组中。精确称取dpph0.0200g，用无水乙醇溶解至100ml，摇匀得dpph储备液。取dpph储备液2ml于实验组和空白容量瓶中。用无水乙醇对所有容量瓶定容。避光放置30min后在517nm波长处测定各吸光度。按照式(1)计算清除率。

清除率s(％)＝[1-(ai-aj)/ao]×100(1)

式中：ao为所配置的dpph溶液吸光度；ai为样品溶液与dpph溶液反应的吸光度；aj为空白样品溶液的吸光度。

1.2、纸片法测定抑菌活性

采用滤纸片琼脂板扩散法测定精油抑菌圈。精密吸取已经活化的金黄色葡萄球菌(浓度为1.33×10⁹od)100μl涂布于琼脂培养基上，备用。采用分析天平精确称取各组精油0.1000g，溶解在100μl正己烷中，制成浓度为1.0g/l的待测精油，备用。

在无菌条件下，将滤纸片呈三角状贴于已涂布的固体培养基上。各取10μl稀释后的待测精油滴加到3个药敏纸片上。丁香精油、迷迭香精油、复方精油和空白对照共12组。用封口膜封好，置于36℃培养箱，培养10h。准确测量抑菌圈直径。

1.3、gc-ms测定精油化学成分

取精油样品10μl，加入正已烷稀释100倍，编号、装瓶、密封。于4℃下冷藏，备用。

色谱柱：hp-5石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.5μm)；初始温度为50℃，维持2.0min，以速率4℃·min-1升温至130℃，维持2min，以速率3℃·min-1缓慢升温至140℃，维持2min，以速率2℃·min-1升温至150℃，维持2min，以速率3℃·min-1升温至160℃，维持2min；进样量1μl；进样口温度250℃；载气为99.999％氦气；初始载气流量设置为1.0ml·min-1；分流比为10:1。自动调谐；溶剂延时3min；ei离子源；全扫描采集模式，扫描范围：30～150amu；阈值为150；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；通过计算机谱库nist11.l进行检索。

2、检测结果

2.1、dpph法测定抗氧化活性

2.1.1、丁香精油的抗氧化活性

丁香精油浓度与dpph清除率的关系，如图1所示。丁香精油浓度与dpph自由基清除率的回归方程和相关系数分别为y＝37.118x+0.1723，r²＝0.9934。由图1可知：丁香精油对dpph自由基清除率为50％时即s50％值为0.0088g/l。当浓度范围为0.004～0.014g/l时，随着丁香精油浓度的增加，试液对dpph自由基的清除率也不断增加。

2.1.2、迷迭香精油的抗氧化活性

迷迭香精油浓度对dpph清除率的关系，如图2所示。由图2可知：当浓度范围为0.005～0.025g/l时，随着迷迭香精油浓度增加，试液对dpph自由基的清除率也不断增加。迷迭香精油与dpph清除率的回归方程和相关系数分别为y＝19.808x-0.013，r²＝0.9981。根据拟合曲线得出：丁香精油对dpph自由基的s50％值为0.0245g/l。

2.1.3、复方精油的抗氧化活性

三种精油浓度与dpph清除率的关系如图3所示。不同m复方精油浓度与dpph清除率的关系如图4所示。

图3中，1为丁香精油；2为原料丁香和迷迭香质量比m＝1:3得到的复方精油；3为迷迭香精油；

图4中，1为丁香精油；2至10依次为原料丁香和迷迭香质量比m＝9:1、m＝7:1、m＝5:1、m＝3:1、m＝1:1、m＝1:3、m＝1:5以及m＝1:7得到的复方精油；11为迷迭香精油；

不同m复方精油抗氧化活性如表1所示。

表1不同m复方精油抗氧化活性

由图3，图4和表1可知：当自由基清除率为50％时，复方精油的抗氧化活性大小顺序为：m＝1:0>m＝1:3>m＝9:1>m＝1:5>m＝3:1>m＝5:1>m＝7:1>m＝1:1>m＝1:7>m＝1:9>m＝0:1。当dpph清除率为30％～50％时，复方精油(m＝1:3)抗氧化活性优于丁香精油(m＝1:0)的抗氧化活性。由表1可知：当自由基清除率s>50％时，丁香精油(m＝1:0)的抗氧化活性最强；迷迭香精油(m＝0:1)的抗氧化活性最弱。当自由基清除率s<50％时，复方精油(m＝1:3)抗氧化活性最强。

2.2、纸片法测定复方精油抑菌活性

复方精油抑菌圈直径如表2所示。复方精油的抑菌效果如图5所示，其中，a至g依次为原料丁香和迷迭香质量比m＝1:0、m＝3:1、m＝9:1、m＝7:1、m＝5:1、m＝1:1、m＝1:3得到的复方精油的抑菌效果图，另外，m＝1:5；m＝1:7；m＝1:9；m＝0:1在实验浓度下无法测得其抑菌圈大小，故舍去。

表2复方精油抑菌圈直径

由表2和图5可知：原料丁香和迷迭香质量比m＝1:3时，所提取的复方精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳。所有丁香与迷迭香复方精油抑菌圈直径均在10～20mm之间，属于中度敏感。

2.3、gc-ms分别测定丁香、迷迭香、复方精油的化学成分

根据上述1.3的色谱条件，查找nist标准质谱图库，得到超临界co2法提取的丁香和迷迭香精油的gc-ms总离子色谱图，分别如图6和图7所示。丁香和迷迭香精油的化学成分分别如下表3和表4。复方精油(m＝1:3)总离子色谱图如图8所示。复方精油(m＝1:3)化学成分如下表5。

表3丁香精油的化学成分

表4迷迭香精油的化学成分

表5复方精油(m＝1:3)化学成分

由表3～表5，图6～图8可知：从超临界方法萃取的丁香精油鉴别了19种化合物，含量占总成分的98.92％。丁香精油主要物质为丁香酚(60.79％)、乙酸丁香酚酯(28.24％)、β-石竹烯(8.22％)，丁香精油中桉叶油醇的含量较低(0.12％)。迷迭香精油中鉴定出62种物质，其中主要物质为丁香酚(21.23％)、β-石竹烯(13.46％)、樟脑(7.99％)，迷迭香精油中桉叶油醇的含量为5.74％。复方精油(m＝1:3)中共鉴定出19种物质，其中主要物质为丁香酚(54.56％)、乙酸丁香酚酯(26.04％)、β-石竹烯(8.39％)和桉叶油醇(3.43％)。由于单种精油的协同作用，相比丁香和迷迭香精油化学成分，复方精油(m＝1:3)化学成分主要活性物质更多。同时，复方精油(m＝1:3)未检测出丁香精油中的水杨酸甲酯和迷迭香精油中的2-蒎烯，可能这些物质相对含量过低或者发生了转化。

综上，抗氧化活性实验结果表明：当自由基清除率为50％时，复方精油的抗氧化活性大小顺序为：m＝1:0>m＝1:3>m＝9:1>m＝1:5>m＝3:1>m＝5:1>m＝7:1>m＝1:1>m＝1:7>m＝1:9>m＝0:1。当自由基清除率为30％～50％时，复方精油(m＝1:3)抗氧化活性优于丁香精油(m＝1:0)抗氧化活性。抑菌实验结果表明：复方精油(m＝1:3)对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳。gc-ms成分分析实验结果表明：复方精油(m＝1:3)主要物质为丁香酚(54.56％)、乙酸丁香酚酯(26.04％)、β-石竹烯(8.39％)和桉叶油醇(3.43％)。由于单一精油的协同作用，相比丁香和迷迭香精油化学成分，复方精油(m＝1:3)化学成分活性物质更多。丁香和迷迭香复方精油(m＝1:3)较好的抗氧化活性以及抑菌活性可为天然保鲜防腐剂的开发提供理论依据。

实施例2制备复方精油时不同条件对出油率的影响

将粉碎后的丁香与迷迭香按照质量比1:3的比例混合，得到复方粉末，然后根据以下条件提取精油，将提取出来的精油装瓶、密封、冷藏，备用。根据公式(2)计算出油率。(气体流速波动性较大，本实施例将co2流速控制在2.5l/min左右)

出油率＝精油质量/复方原料质量×100％(2)

1、单因素分析

1)萃取时间对出油率的影响

取5份复方粉末，每份10g，在温度40℃、压力30mpa、粉碎度60目条件下，用超临界co2仪器进行萃取，分别计算在15min、30min、45min、60min、75min时的出油率。其结果如图9所示，由图9可知：复方的出油率随时间的增加而增加，在45min左右基本提取完成，50min后已经不再出油。因此，从经济上考虑，最佳提取时间为45min。

2)萃取温度对出油率的影响

取5份复方粉末，每份10g，在萃取时间为45min、压力40mpa、粉碎度60目的条件下，用超临界co2仪器进行萃取，分别计算温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃时的出油率。其结果如图10所示，由图10可知：当反应温度低于50℃时，复方精油的出油率随着萃取温度的升高而增加，但当温度超过50℃后，出油率反而会下降。因此，从生产效益考虑，最佳萃取温度应选择40℃。

3)萃取压力对出油率的影响

取5份复方粉末，每份10g，在萃取时间为45min、温度40℃、粉碎度60目的条件下，用超临界co2仪器进行萃取，分别计算压力为10mpa、20mpa、30mpa、40mpa、50mpa时的出油率。其结果如图11所示，由图11可知：随着萃取压力的不断升高，复方精油出油率逐渐增加，但当压力超过40mpa后，得油率反而下降。因此，从生产效益考虑，最佳萃取压力选择40mpa。

4)萃取粉碎度对出油率的影响

取3份复方粉末，每份10g，在萃取时间为45min、温度40℃、压力40mpa的条件下，用超临界co2仪器进行萃取，分别计算粉碎度为20目、40目、60目时的出油率。其结果如图12所示，由图12可知：随着粉碎度的增加，复方精油出油率逐渐增加。因此，最佳粉碎度选择60目。

2、正交法确定最佳工艺

在上述单因素的基础上，以温度、压力、时间为考虑因素，进一步对工艺参数的确定进行优化，确定最优组合。正交实验设计因素与水平设计表如下表6所示；其正交实验优化方案及结果如下表7所示。

表6正交实验设计因素与水平设计表

表7正交实验设计方案及结果

由表7中r值可得在温度和压力两个因素对丁香、迷迭香复方精油萃取率的影响顺序为萃取温度(a)>萃取压力(b)>萃取时间(c)，比较各影响因素k1k2k3的值得到最佳工艺条件为a3b2c2，即萃取温度为55℃、萃取压力40mpa，萃取时间45min。

通过正交实验得到了最佳工艺条件。现用最佳工艺条件(萃取温度55℃、萃取压力40mpa、萃取目数60目，萃取时间45min)下萃取丁香、迷迭香复方精油，重复3次，并计算出油率以验证该工艺条件的准确性。在此条件下的出油率为8.65％。

实施例3复方精油(丁香与迷迭香原料质量比为1：1)对红提保鲜的应用

将复方精油(丁香与迷迭香原料质量比为1：1)：丙酮＝1：10混合，用无菌水补齐，配出浓度分别为1ml/l，3ml/l，5ml/l，并以丙酮和无菌水作为对照组。将红提置于不同浓度处理液中浸渍1.5min后取出，自然风干。用保鲜膜袋装，转入15℃培养箱中贮藏。

1、多酚氧化酶活性(ppo)酶液制备与活性测定

1)酶液制备：取10g果肉，加0.5gpvp于20ml0.2mol/l磷酸缓冲液(ph＝6.4)中，冰浴研磨，4℃，12000rpm冰冻离心20min，取上清液测定酶活性。

2)酶活性的测定：将0.04ml粗酶提取液加入3ml0.1mol/l的邻苯二酚溶液(用0.2mol/lph＝6.4的磷酸缓冲液配成)。反应温度为30℃，加酶液后1min开始扫描3min内410nm处吸光值变化，酶活单位定义为每分钟od410改变0.01所需的酶量为一个活性单位u，重复3次。

酶活性(u/gfw·min)＝δod410×vr/(fw×t×vs×0.01)

式中：δod410为扫描时间内吸光度的变化；fw为样品鲜重(gfw)；t为扫描时间(min)；vs为测定时取用酶液体积(ml)；vr为酶液总体积(ml)。

按照上述步骤测定得到丁香与迷迭香原料质量比为1：1时不同浓度复方精油对红提ppo活性的影响，其结果如图13所示，由图13可以看出，相比对照组，红提分别被丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油处理后，ppo活性上升，有利于抵御红提因病原菌侵染而引起的腐烂变质。当丁香与迷迭香原料质量比为1：1的浓度为3ml/l，红提贮藏时间为6天时，ppo活性与丁香与迷迭香原料质量比为1：1的浓度为5ml/l接近。

2、苯丙氨酸解氨酶活性(pal)酶液制备与活性测定

1)酶液制备：取10g果肉，加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，再加入0.1mol/l的硼酸钠-硼酸缓冲液20ml(ph＝8.8)，冰浴匀浆，4℃，12000rpm冷冻离心20min，上清液用于酶活测定。

2)酶活测定：取1ml粗提酶液于10ml试管中，加1ml0.02mol/l的l-苯丙氨酸、2ml蒸馏水，总体积为4ml。对照中不加粗酶液，改加1ml0.1mol/l的硼酸缓冲液。反应液混匀，置30℃恒温水浴中30min，反应结束后，迅速放入冰浴中，向试管中加入0.5ml6mol/l的盐酸终止反应。在290nm波长下测定吸光度值。以od290改变0.01定义为一个酶活性单位u，用u/gfw〃min表示酶活力。

酶活性(u/gfw·min)＝od290×v/(0.01×a×fw×t)

式中：od290为吸光度值；v为酶液总体积(ml)；a为测定时所用酶液体积(ml)；fw为样品鲜重(gfw)；t为反应时间(min)。

按照上述步骤测定得到丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提pal活性的影响，其结果如图14所示，由图14可以看出，相对于对照组，红提分别经过丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油处理后，pal活性下降被抑制。经过复方精油丁香：迷迭香＝1:1复方精油浓度为3ml/l时，处理后的红提抑制ppo活性的下降能力最强，提高了红提抗病菌的能力。

3、过氧化物酶活性(pod)酶液制备与活性测定

1)酶液制备：取10g果肉，加0.5gpvp(聚乙烯吡咯烷酮)于20ml0.2mol/l磷酸缓冲液(ph＝6.4)中，冰浴研磨，4℃，12000rpm冰冻离心20min，取上清液测定酶活性。

2)酶活性测定：将0.1ml粗酶提取液加入3ml0.1mol/l愈创木酚[0.2mol/l(ph＝6.4)磷酸缓冲液配成]中,在30℃水浴中平衡5min,然后加1ml0.2％h2o2[用0.2mol/l(ph＝6.4)磷酸缓冲液配成]混匀，1min后扫描1min内470nm处吸光值变化，以od470改变0.01定义为一个酶活性单位u,用u/gfw.min表示酶活力。

酶活性(u/gfw〃min)＝δod470×vr/(fw×t×vs×0.01)

式中：δod470为扫描时间内吸光度的变化；fw为样品鲜重(gfw)；t为扫描时间(min)；vs为测定时取用酶液体积(ml)；vr为酶液总体积(ml)。

按照上述步骤测定得到丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提pod活性的影响，其结果如图15所示，由图15可知：在红提贮藏过程中，当丁香：迷迭香＝1:1的复方精油浓度为1ml/l和5ml/l时，可抑制pod活性的下降，确保组织免受活性氧的伤害，保护膜质不被过氧化，减少病害的发生，同时延缓果实在贮藏过程中的衰老进程，从而延长果实的贮藏期。

4、可溶性糖含量(ss)测定

1)标准曲线的制作

取6支25ml刻度试管(重复做两组)，编号后按表3加入100μg/ml蔗糖标准液和蒸馏水。再按顺序向试管内加入1.0ml90g/l苯酚溶液，摇匀，再从管液正面在5～20s内加入5ml浓硫酸，摇匀。混合液总体积为8ml，在室温下放置30min进行反应。然后，以空白为参比，在波长485nm处比色测定混合反应液的吸光度值。以蔗糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图16所示，求出线性回归方程。

2)可溶性糖的提取

称取0.10～0.30g果肉置于研钵中，研磨呈浆状后，加入少量蒸馏水，转入到刻度试管中，再加人5～10ml蒸馏水，用塑料薄膜封口，于沸水中煮沸提取30min，取出待冷却后过滤，将滤液直接滤入到25ml容量瓶中，再将残渣回收到试管中，加入5～10ml蒸馏水再煮沸提取10min，并过滤入容量瓶中，用水反复漂洗试管及残渣，过滤后一并转入容量瓶并定容至刻度。

3)可溶性糖的测定

取1支25ml刻度试管，吸取0.5ml样品液于试管中，加入1.5ml蒸馏水。测定步骤与制作标准曲线相同，按顺序分别加入0.09g/ml苯酚溶液、浓硫酸,显色并测定吸光度值。重复三次。如果吸光度值读数过高，可将样品液稀释后再吸取0.5ml进行反应和测定。

根据显色液吸光度值，在标准曲线上查出相应的蔗糖质量，按下式计算果蔬组织中可溶性糖含量，以质量分数(％)表示。计算公式：

式中m′——从标准曲线查得的蔗糖质量，μg；

v——样品提取液总体积，ml；

n——样品提取液稀释倍数；

vs——测定时所取样品提取液体积，ml；

m——样品质量，g。

根据上述步骤测定得到丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油对红提可溶性糖含量的影响，其结果如图17所示，由图17可以看出，相对于对照组，红提分别经过丁香与迷迭香原料质量比为1：1不同浓度复方精油处理后，可溶性糖含量趋势一致，均是随着贮藏时间的增加，先下降，当贮藏时间达到6天时，红提的可溶性糖的含量上升。经过复方精油丁香：迷迭香＝1:1复方精油浓度为1ml/l时，处理后的红提可溶性糖的含量最高。

实施例4复方精油(丁香与迷迭香原料质量比为1：1和1：3)和单方精油(纯丁香和纯迷迭香)对红提保鲜应用

1、按照实施例3中的步骤测定得到复方精油和单方精油对红提ppo活性的影响，其结果如图18所示，由图18可以看出，红提分别经过复方精油和单方精油处理后，ppo变化趋势基本一致，但是经过复方精油丁香：迷迭香＝1:1和丁香：迷迭香＝1:3处理后的红提比单方精油更能诱导ppo活性的上升，有利于抵御红提因病原菌侵染而引起的腐烂变质。

2、按照实施例3中的步骤测定得到复方精油和单方精油对红提pal活性的影响，其结果如图19所示，由图19可以看出，红提分别经过复方精油和单方精油处理后，pal变化趋势基本一致，但是经过复方精油丁香：迷迭香＝1:1处理后的红提比单方精油更能抑制pal活性的下降，提高红提抗病菌的能力。

3、按照实施例3中的步骤测定得到复方精油和单方精油对红提pod活性的影响，其结果如图20所示，由图20可以看出，在红提贮藏过程中，丁香：迷迭香＝1:3的复合精油可抑制pod活性的下降，确保组织免受活性氧的伤害，保护膜质不被过氧化，减少病害的发生，同时延缓果实在贮藏过程中的衰老进程，从而延长果实的贮藏期。在红提贮藏过程中，相对于单方精油抑制红提pod活性的下降，丁香：迷迭香＝1:3的复方精油抑制红提pod活性的下降效果最好，有利于红提的贮藏保鲜。

4、按照实施例3中的步骤测定得到复方精油和单方精油对红提可溶性糖含量的影响，其结果如图21所示，由图21可以看出，红提经过复方精油丁香：迷迭香＝1:1处理6天后的红提的可溶性糖含量比单方精油处理后可溶性糖含量高。可溶性糖含量的多少，直接影响红提的口感，在红提贮藏期间其可溶性糖的含量有所变化，直接影响了红提的品质。红提经过复方精油处理后可溶性糖的含量比单方精油处理后可溶性糖含量高。

综上，可以看出，本发明提供的复方精油在水果保鲜上具有显著的保鲜效果，且相对于传统的化学保鲜剂等，绿色安全无污染，对于人体健康无毒副作用，适用性强。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。