本发明属于植物提取
技术领域：
，具体涉及一种双孢菇壳多糖的制备方法。
背景技术：
：双孢菇是一种常见的食用菌，又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，欧美各国生产经营者常称之为普通栽培蘑菇或纽扣蘑菇，是中低温性真菌，生产速度快，实体多单生，形状园正，呈白色、外周没有鳞片，菌盖较厚，菇体肉质肥厚。双孢蘑菇是世界性栽培和消费的菇类，有“世界菇”之称，可鲜销、罐藏、盐渍。双孢蘑菇的菌丝还作为制药的原料。双孢蘑菇所含的酪氨酶有明显降低血压作用，多糖的醌类化合物与巯基结合，可抑制脱氧核糖核酸合成，在医学上，有抑制肿瘤细胞活性的作用。真菌多糖是多数食用菌含有的一种非常重要的活性成分，具有广阔的发展前景。双孢菇壳多糖具有良好的抗氧化性，是一款大众消费品，作为天然绿色防腐剂，在食品中的应用已被大众所接受和认可。目前，双孢菇壳多糖也被应用到化妆品的开发与成分添加中，应用前景广泛。专利号为cn105111322a的专利文本公开了一种水浴振荡辅助酶法提取双孢菇壳多糖的工艺，所述工艺包括原料预处理-冷冻干燥-乙醇回流-水浴振荡酶解-灭酶离心-上清液测多糖含量等步骤，通过调节提取过程中的振荡频率、ph值、酶解时间、酶解温度等条件来控制双孢菇粗多糖的提取效率和提取纯度。此提取工艺虽然可以通过简单的原料提取到双孢菇粗多糖，且提取环境简单，但是其提取效率较低，原料浪费严重，且提取周期较长。综上所述，现有技术中普遍存在双孢菇壳多糖的提取率较低，原料浪费严重，且提取周期较长等技术缺陷。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双孢菇壳多糖的制备方法。本发明提供的双孢菇壳多糖的制备方法提取工艺简单易操作，提取效率高，提取周期短，避免了原材料的浪费，缩短了提取周期，易于实现工业化生产。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种双孢菇壳多糖的制备方法，具体包括如下步骤：s1、将新鲜的双孢菇用去离子水清洗干净，50～60℃下烘干0.5h，然后切成2～5mm厚的薄片，100～130℃烘干24h，制得双孢菇干；s2、将步骤s1制得的双孢菇干粉碎至5μm，制得双孢菇粗粉；s3、取步骤s2制得的双孢菇粗粉放于75～90℃的热水中浸泡10～12h，然后将双孢菇与水的混合液放置于超声容器中，超声提取0.5～1h，1000～2000r/min离心分离，取上层清液，制得粗多糖提取液；s4、将步骤s3制得的粗多糖提取液冷却至40～50℃，加入0.5倍量的复合酶进行酶解，酶解时间为4～6h，制得酶解液；s5、将步骤s4制得的酶解液减压浓缩，制得干浸膏，然后向干浸膏中加入7～10倍量的乙醇溶液，进行回流提取，制得醇解液；s6、将步骤s5制得的醇解液进行纤维过滤器透析，制得多糖提取液；s7、将步骤s6制得的多糖提取液进行减压浓缩、冷冻干燥，即得。进一步的，所述步骤s3中双孢菇粗粉和热水的质量比为1:8～11。进一步的，所述步骤s3中超声提取的频率为50～60khz。进一步的，所述步骤s4中的复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为4～6:1:3组成。进一步的，所述步骤s5中的乙醇溶液的体积分数为70～90％，提取温度为70～85℃，提取时间为1h。进一步的，所述步骤s6中纤维过滤器中使用聚甲基丙烯酸甲酯膜。进一步的，所述步骤s5、步骤s7中减压浓缩的真空度为-0.1～-0.15mpa，温度为80～90℃。本发明提供的双孢菇壳多糖的提取方法采用高温水提法、超声提取法和乙醇溶液提取法提取出双孢菇粗粉中的多糖，采用酶解法去除多糖溶液中的蛋白质和氨基酸，进一步提纯多糖溶液，采用纤维过滤器过滤出多糖溶液中的小分子物质，然后进行减压浓缩和冷冻干燥，得到纯度较高的双孢菇壳多糖。本发明提供的双孢菇壳多糖的制备方法利用水对植物组织的穿透力强，提取效率高，使用安全、经济等特点对双孢菇壳多糖进行提取，采用75～90℃的热水浸提一方面可以提高多糖的提取效率，另一方面可以使双孢菇中含有的蛋白质变性，从而有利于分离蛋白质与多糖，提高提取纯度。超声提取过程中，超声波会产生“空化作用”，可以破坏植物细胞膜，有利于植物中有效成分的释放，且超声波能够形成强大的冲击波或高速射流，能够有效的减小、消除与水相之间的阻滞层，加大传质效率，有助于溶质的扩散，因此，热水浸提后的双孢菇溶液进行超声提取可以提高提取效率，缩短提取时间，减少原料浪费。本发明使用的复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为4～6:1:3组成，在此配比下，复合酶可以有效地分解粗多糖提取液中的蛋白质和氨基酸，从而提高多糖的提取纯度。乙醇溶液回流提取酶解液的过程中会进一步提纯溶液中的多糖，避免了原材料的浪费，且乙醇提取还具有浓缩回收方便、毒性小、价格便宜、提取液不易霉变等优点。醇解液经纤维过滤器透析中的聚甲基丙烯酸甲酯膜过滤后可以去除溶液中诸如低聚寡糖的小分子杂质，纤维过滤器透析不仅可以缩短提取周期，而且条件温和，是多糖脱出杂质最有效途径之一。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明提供的双孢菇壳多糖的制备方法提取到的双孢菇壳多糖含量高，灰分含量低，其中双孢菇壳多糖的含量≥89.3％；(2)本发明提供的双孢菇壳多糖的制备方法采用由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶组成的复合酶去除多糖溶液中的蛋白质和氨基酸，有效地提高了双孢菇壳多糖的提取纯度；(3)本发明提供的双孢菇壳多糖的制备方法操作简单，条件可控，工艺稳定，易于实现工业化生产。具体实施方式以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。本领域技术人员根据本发明的基本思路，可以做出各种修改，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范之内。实施例1、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法，具体包括如下步骤：s1、将新鲜的双孢菇用去离子水清洗干净，50℃下烘干0.5h，然后切成2mm厚的薄片，100℃烘干24h，制得双孢菇干；s2、将步骤s1制得的双孢菇干粉碎至5μm，制得双孢菇粗粉；s3、取步骤s2制得的双孢菇粗粉放于75℃的热水中浸泡10h，双孢菇粗粉和热水的质量比为1:8；然后将双孢菇与水的混合液放置于超声容器中，超声提取的频率为50khz，超声提取0.5h，1000r/min离心分离，取上层清液，制得粗多糖提取液；s4、将步骤s3制得的粗多糖提取液冷却至40℃，加入0.5倍量的复合酶进行酶解，复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为4:1:3组成，酶解时间为4h，制得酶解液；s5、将步骤s4制得的酶解液减压浓缩，减压浓缩的真空度为-0.1mpa，温度为80℃，制得干浸膏，然后向干浸膏中加入7倍量的乙醇溶液，进行回流提取，乙醇溶液的体积分数为70％，提取温度为70℃，提取时间为1h，制得醇解液；s6、将步骤s5制得的醇解液进行纤维过滤器透析，纤维过滤器中使用聚甲基丙烯酸甲酯膜，制得多糖提取液；s7、将步骤s6制得的多糖提取液进行减压浓缩、冷冻干燥，减压浓缩的真空度为-0.1mpa，温度为80℃，即得。实施例2、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法，具体包括如下步骤：s1、将新鲜的双孢菇用去离子水清洗干净，53℃下烘干0.5h，然后切成3mm厚的薄片，110℃烘干24h，制得双孢菇干；s2、将步骤s1制得的双孢菇干粉碎至5μm，制得双孢菇粗粉；s3、取步骤s2制得的双孢菇粗粉放于78℃的热水中浸泡10.5h，双孢菇粗粉和热水的质量比为1:9；然后将双孢菇与水的混合液放置于超声容器中，超声提取的频率为52khz，超声提取0.6h，1300r/min离心分离，取上层清液，制得粗多糖提取液；s4、将步骤s3制得的粗多糖提取液冷却至42℃，加入0.5倍量的复合酶进行酶解，复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为5:1:3组成，酶解时间为4.5h，制得酶解液；s5、将步骤s4制得的酶解液减压浓缩，减压浓缩的真空度为-0.11mpa，温度为83℃，制得干浸膏，然后向干浸膏中加入8倍量的乙醇溶液，进行回流提取，乙醇溶液的体积分数为75％，提取温度为74℃，提取时间为1h，制得醇解液；s6、将步骤s5制得的醇解液进行纤维过滤器透析，纤维过滤器中使用聚甲基丙烯酸甲酯膜，制得多糖提取液；s7、将步骤s6制得的多糖提取液进行减压浓缩、冷冻干燥，减压浓缩的真空度为-0.11mpa，温度为82℃，即得。实施例3、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法，具体包括如下步骤：s1、将新鲜的双孢菇用去离子水清洗干净，56℃下烘干0.5h，然后切成3.5mm厚的薄片，117℃烘干24h，制得双孢菇干；s2、将步骤s1制得的双孢菇干粉碎至5μm，制得双孢菇粗粉；s3、取步骤s2制得的双孢菇粗粉放于83℃的热水中浸泡10.8h，双孢菇粗粉和热水的质量比为1:9.4；然后将双孢菇与水的混合液放置于超声容器中，超声提取的频率为54khz，超声提取0.75h，1500r/min离心分离，取上层清液，制得粗多糖提取液；s4、将步骤s3制得的粗多糖提取液冷却至44℃，加入0.5倍量的复合酶进行酶解，复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为4.5:1:3组成，酶解时间为5h，制得酶解液；s5、将步骤s4制得的酶解液减压浓缩，减压浓缩的真空度为-0.13mpa，温度为85℃，制得干浸膏，然后向干浸膏中加入8.5倍量的乙醇溶液，进行回流提取，乙醇溶液的体积分数为80％，提取温度为78℃，提取时间为1h，制得醇解液；s6、将步骤s5制得的醇解液进行纤维过滤器透析，纤维过滤器中使用聚甲基丙烯酸甲酯膜，制得多糖提取液；s7、将步骤s6制得的多糖提取液进行减压浓缩、冷冻干燥，减压浓缩的真空度为-0.13mpa，温度为85℃，即得。实施例4、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法，具体包括如下步骤：s1、将新鲜的双孢菇用去离子水清洗干净，58℃下烘干0.5h，然后切成4mm厚的薄片，120℃烘干24h，制得双孢菇干；s2、将步骤s1制得的双孢菇干粉碎至5μm，制得双孢菇粗粉；s3、取步骤s2制得的双孢菇粗粉放于86℃的热水中浸泡11.5h，双孢菇粗粉和热水的质量比为1:10；然后将双孢菇与水的混合液放置于超声容器中，超声提取的频率为58khz，超声提取0.8h，1800r/min离心分离，取上层清液，制得粗多糖提取液；s4、将步骤s3制得的粗多糖提取液冷却至48℃，加入0.5倍量的复合酶进行酶解，复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为5.5:1:3组成，酶解时间为5.5h，制得酶解液；s5、将步骤s4制得的酶解液减压浓缩，减压浓缩的真空度为-0.14mpa，温度为88℃，制得干浸膏，然后向干浸膏中加入9倍量的乙醇溶液，进行回流提取，乙醇溶液的体积分数为85％，提取温度为82℃，提取时间为1h，制得醇解液；s6、将步骤s5制得的醇解液进行纤维过滤器透析，纤维过滤器中使用聚甲基丙烯酸甲酯膜，制得多糖提取液；s7、将步骤s6制得的多糖提取液进行减压浓缩、冷冻干燥，减压浓缩的真空度为-0.14mpa，温度为87℃，即得。实施例5、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法，具体包括如下步骤：s1、将新鲜的双孢菇用去离子水清洗干净，60℃下烘干0.5h，然后切成5mm厚的薄片，130℃烘干24h，制得双孢菇干；s2、将步骤s1制得的双孢菇干粉碎至5μm，制得双孢菇粗粉；s3、取步骤s2制得的双孢菇粗粉放于90℃的热水中浸泡12h，双孢菇粗粉和热水的质量比为1:11；然后将双孢菇与水的混合液放置于超声容器中，超声提取的频率为60khz，超声提取1h，2000r/min离心分离，取上层清液，制得粗多糖提取液；s4、将步骤s3制得的粗多糖提取液冷却至50℃，加入0.5倍量的复合酶进行酶解，复合酶由脱羧酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶按质量比为6:1:3组成，酶解时间为6h，制得酶解液；s5、将步骤s4制得的酶解液减压浓缩，减压浓缩的真空度为-0.15mpa，温度为90℃，制得干浸膏，然后向干浸膏中加入10倍量的乙醇溶液，进行回流提取，乙醇溶液的体积分数为90％，提取温度为85℃，提取时间为1h，制得醇解液；s6、将步骤s5制得的醇解液进行纤维过滤器透析，纤维过滤器中使用聚甲基丙烯酸甲酯膜，制得多糖提取液；s7、将步骤s6制得的多糖提取液进行减压浓缩、冷冻干燥，减压浓缩的真空度为-0.15mpa，温度为90℃，即得。对比例1、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法与实施例3类似。本对比例与实施例3的区别为：本对比例中的复合酶未添加脱羧酶。对比例2、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法与实施例3类似。本对比例与实施例3的区别为：本对比例中步骤s3中未进行超声提取。对比例3、一种双孢菇壳多糖所述双孢菇壳多糖的制备方法与实施例3类似。本对比例与实施例3的区别为：本对比例中步骤s5中未进行乙醇回流提取。试验例、双孢菇壳多糖含量检测试样样品：实施例1～5、对比例1～3制得的双孢菇壳多糖；试验方法：取试验样品配置成摩尔浓度为0.05mol/l的溶液并定容，采用硫酸-苯酚法测定壳多糖含量；试验结果：试验结果见表1。表1双孢菇壳多糖含量检测结果组别双孢菇壳多糖含量/％双孢菇壳多糖回收率/％实施例189.785.4实施例290.184.8实施例392.385.9实施例491.785.1实施例589.384.7对比例167.458.3对比例259.860.2对比例364.657.5由表1可知，本发明提供的双孢菇壳多糖的制备方法能够实现双孢菇壳多糖含量达到89％以上的提取，同时还能使双孢菇壳多糖的回收率达到84％以上，与现有技术相比提升巨大。其中实施例3制得的双孢菇壳多糖的纯度最高，回收效果最好，为本发明最佳实施例。与实施例3相比，对比例1改变了复合酶的配方组成，未添加脱羧酶，但是其制得的双孢菇壳多糖的纯度较低，这是由于复合酶配方的改变使得双孢菇壳多糖提取过程中蛋白质和氨基酸分解不完全造成的；对比例2和对比例3分别未进行超声提取和未进行乙醇回流提取，导致双孢菇壳多糖在提取过程中提取不完全，从而导致制得双孢菇壳多糖的纯度较低。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而并非限制本发明。本领域任何熟悉此技术的认识皆不可在违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修改。因此，举凡所属
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