本发明属于免疫细胞领域，涉及cik细胞，具体涉及一种葡甘聚糖在cik细胞体外培养方面的用途及cik细胞培养基。
背景技术：
：随着肿瘤免疫学的不断进展，肿瘤免疫治疗已经成为继手术和放、化疗之后第四种肿瘤治疗的手段，并且有望成为最终攻克肿瘤的方向。cik细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养后获得的具有高效溶解毒性的t细胞，由于其同时表达cd3和cd56两种膜蛋白分子(cd3+cd56+)，故又称为nk细胞样t淋巴细胞。cik细胞具有杀瘤谱广、效率高的特点，在肿瘤杀伤活性上具有淋巴因子激活杀伤细胞(lak)、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒性t细胞所无法比拟的优越性，因此日益受到重视。此外，cik自身还能分泌il-2、il-6、ifn-γ、tnf和粒细胞集落刺激生物因子等细胞因子，可提高细胞毒作用；还可诱导肿瘤细胞凋亡，活化肿瘤细胞凋亡基因。如何提高cik细胞的体外增殖率及其对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用cik细胞进行细胞免疫治疗的关键。卢意等研究发现，甘露糖和葡萄糖醛酸的组合应用可促进cik细胞体外扩增并提高所获得的cik细胞的肿瘤杀伤能力(甘露糖和葡萄糖醛酸组合促进cik细胞体外扩增，中国免疫学杂志，2019年15期)。龚子祯等研究发现，黄原胶可以支撑cik细胞的高密度扩增，并且扩增后的cik细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著提高(黄原胶支持cik细胞高密度扩增，高校化学工程学报，2019)。陈艳媛等研究发现，toll样受体7(tlr7)在cik细胞培养中扮演重要角色，tlr7激动剂具有增强cik效应细胞扩增能力的活性，其刺激后获得的cik细胞肿瘤细胞的杀伤效果更好(tlr7激动剂增强人cik细胞杀伤功能的研究，免疫学杂志，2016年07期)。魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan，kgm)又称魔芋葡甘露聚糖、魔芋胶、魔芋粉，是魔芋内含有的中性半纤维素复合杂多糖。kgm作为一种天然无端基可溶性膳食纤维，具有抗氧化自由基、抗肿瘤癌变、降血糖等功能，有较高的营养与保健价值。在食品加工与保鲜应用方面，kgm与儿茶素共抑香肠中ω-3脂肪酸的氧化，包埋鱼油赋予乳制品低脂特性；在医疗临床与保健应用方面，控谷胱甘肽s-转移酶基因表达下调bcl-2促上皮细胞凋亡，复配脂多糖实现口服结肠定位给药系统点控药物释放，延长乳酸菌在胃中的残留时间；在日用化学化妆品中，与聚丙酰胺复合修复受损皮肤，延缓脑神经胶质、动脉内皮细胞老化。目前没有魔芋葡甘聚糖用于cik细胞体外培养的研究报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种葡甘聚糖在cik细胞体外培养方面的用途及cik细胞培养基，该葡甘聚糖为魔芋葡甘聚糖。本发明上述目的通过如下方案实现：一种葡甘聚糖在cik细胞体外培养方面的用途，所述葡甘聚糖为魔芋葡甘聚糖。具体实施例中，魔芋葡甘聚糖具有促进cik细胞的体外增殖并提高其对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于cik细胞体外培养。一种葡甘聚糖在提高cik细胞体外扩增率中的用途，所述葡甘聚糖为魔芋葡甘聚糖。具体实施例中，魔芋葡甘聚糖具有促进cik细胞的体外增殖的活性。一种葡甘聚糖体外培养cik细胞提高其对肿瘤细胞杀伤力中的用途，所述葡甘聚糖为魔芋葡甘聚糖。具体实施例中，魔芋葡甘聚糖具有促进cik细胞对肿瘤细胞杀伤力的活性。一种cik细胞体外培养基，该培养基中含有魔芋葡甘聚糖。具体实施例中，魔芋葡甘聚糖具有促进cik细胞的体外增殖并提高其对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于制备cik细胞体外培养基。一种提高cik细胞体外扩增率的培养，该培养基中含有魔芋葡甘聚糖。一种体外培养cik细胞提高其对肿瘤细胞杀伤力的培养基，该培养基中含有有效浓度的魔芋葡甘聚糖。有益效果：cik细胞是同时表达cd3和cd56两种膜蛋白分子(cd3+cd56+)的一类细胞，具有杀瘤谱广、效率高的特点。提高cik细胞体外增殖率及其对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用cik细胞进行细胞免疫治疗的关键。本发明实验结果表明，魔芋葡甘聚糖具有促进cik细胞体外增殖并提高其对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于cik细胞体外培养、制备cik细胞体外培养基。附图说明图1为各组cik细胞增殖率；该结果显示，100μg/ml、200μg/ml魔芋葡甘聚糖具有明显的体外促进cik细胞增殖的作用，并且可见剂量依赖效应；图2为各组cik细胞对肿瘤细胞的杀伤率；该结果显示，100μg/ml、200μg/ml魔芋葡甘聚糖具有明显的体外提高cik细胞杀瘤活性的作用，并且可见剂量依赖效应；图3为westernblot检测结果；该结果显示，100μg/ml、200μg/ml药物组cik细胞中tlr7蛋白表达水平均比对照组具有一定程度的提高。具体实施方式下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。实施例1：一、实验材料gt-t551无血清培养基购自日本takara公司。各种试剂或试剂盒均为常规市售的试剂或试剂盒。魔芋葡甘聚糖，食品级，购自云南昭通三艾有机魔芋发展有限责任公司。称取适量魔芋葡甘聚糖缓慢添加到超纯水中，50℃水浴搅拌溶解，作为母液备用，临用现配。二、实验方法1、单个核细胞分离、cik细胞诱导培养和流式检测采集健康志愿者外周血，用4℃预冷的pbs缓冲液等体积稀释，然后缓慢加入淋巴细胞分离液上层，于650g、4℃离心20min，收集白色细胞层，即分离得到单个核细胞，用生理盐水洗涤后，用含5％自体血清的gt-t551培养基调至起始密度为2.0×106/l。于第0天加入ifn-γ1000u/ml，置于37℃、5％co2培养箱中培养，24h后加入il-1α100u/ml、cd3mcab50ng/ml和il-21000u/ml继续培养。以后每3d添加含5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基继续培养，并调整细胞密度为2.0×106/ml。取0d和培养至9d的细胞，按常规的流式操作规程，以fitc-cd3、apc-cd56单抗检测cd3+cd56+细胞比例。2、mtt法测定魔芋葡甘聚糖对cik细胞增殖活性的影响取培养至9d的cik细胞，消化后用含5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2.5×104/ml，接种于96孔板，每孔200μl，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/ml或200μg/ml魔芋葡甘聚糖和5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基继续培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)，以及不含细胞的培养液为空白组。继续培养48h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，孵育4h，弃上清液，每孔加入200μldmso，振荡使结晶物充分溶解，以空白组调零，测定药物组和对照组各孔490nm波长下od值，以对照组细胞增殖率为100％计，按如下公式计算药物组细胞增殖率。每个浓度3个复孔。细胞增殖率(％)＝od药物组/od对照组×100％3、cck-8法测定魔芋葡甘聚糖对cik细胞杀伤活性的影响效应细胞的制备：取培养至9d的cik细胞，消化后用含5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/ml，接种于6孔板，每孔2ml，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/ml或200μg/ml魔芋葡甘聚糖和5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基继续培养48h，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)。分别以药物组和对照组的cik细胞为效应细胞，以对数生长期的k562细胞为靶细胞，分别用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基制成2×106/ml、2×105/ml的细胞悬液，各取100μl按照效靶比10:1接种于96孔板中，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，于37℃、5％co2条件的细胞培养箱中培养；培养24h后，每孔加入20μlcck-8试剂，继续培养4h，用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光度od值，根据如下公式计算杀伤率：杀伤率＝[1-(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值]×l00％。4、流式法测定魔芋葡甘聚糖对cik细胞表型的影响取培养至9d的cik细胞，消化后用含5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/ml，接种于6孔板，每孔2ml，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/ml、200μg/ml魔芋葡甘聚糖和5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基继续培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)。继续培养48h后，收集细胞，按常规的流式操作规程，以fitc-cd3、apc-cd56单抗检测cd3+cd56+细胞比例。5、westernblot法测定cik细胞中tlr7蛋白表达的影响取培养至9d的cik细胞，消化后用含5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/ml，接种于6孔板，每孔2ml，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/ml、200μg/ml魔芋葡甘聚糖和5％自体血清、il-21000u/ml的gt-t551培养基继续培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)。继续培养48h后，弃培养液，pbs洗涤，将细胞消化下来，细胞冰上裂解，bca试剂盒测定蛋白浓度，各组取50μg蛋白进行sds-page电泳，转移至pvdf膜，5％脱脂奶粉封闭，加入tlr7和gapdh一抗4℃孵育过夜，tbs-t洗涤液洗膜，加入二抗室温孵育1h，ecl法显色、曝光，化学发光成像系统拍照。6、数据处理采用spss17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±sd表示。组间比较采用t检验，p<0.05代表具有显著性差异。三、实验结果1、单个核细胞分离、cik细胞诱导培养和流式检测结果单个核细胞中cd3+cd56+表型的cik细胞比例较低，经过特定细胞因子的诱导培养后，cd3+cd56+表型的cik细胞比例会显著升高。以单个核细胞诱导获得cik细胞仍然是目前最主流的方法。流式检测结果显示，与0天cd3+cd56+表型比例(5.95±1.07)％相比，诱导培养至9天时，cik细胞的比例显著升高至(17.83±2.36)％。2、魔芋葡甘聚糖对cik细胞增殖活性的影响mtt法测定结果如表1和图1所示，与对照组相比，含有100μg/ml、200μg/ml魔芋葡甘聚糖的药物组中cik细胞增殖活性显著升高，并且可见剂量依赖效应。表1各组cik细胞增殖率(％)对照组100μg/ml药物组200μg/ml药物组增殖率(％)100165.5±5.2249.0±5.7该结果表明，魔芋葡甘聚糖具有明显的体外促进cik细胞增殖的作用。3、魔芋葡甘聚糖对cik细胞杀伤活性的影响cck-8法测定结果如表2和图2所示，与对照组相比，100μg/ml、200μg/ml魔芋葡甘聚糖干预过的药物组的cik细胞明显具有更高的肿瘤杀伤活性，并且可见剂量依赖效应。表2各组cik细胞对肿瘤细胞的杀伤率(％)对照组100μg/ml药物组200μg/ml药物组杀伤率(％)40.6±4.366.7±5.487.2±5.1该结果表明，魔芋葡甘聚糖具有明显的体外提高cik细胞杀伤活性的作用。4、魔芋葡甘聚糖对cik细胞表型的影响流式检测结果显示，对照组cd3+cd56+表型比例为(18.12±2.42)％，100μg/ml、200μg/ml药物组cd3+cd56+表型比例分别为(25.49±2.77)％、(33.08±2.61)％，说明魔芋葡甘聚糖对cik细胞杀伤活性的提高与提高cd3+cd56+表型细胞比例有一定关系。5、魔芋葡甘聚糖对cik细胞中tlr7蛋白表达的影响westernblot检测结果如图3所示，与对照组相比，100μg/ml、200μg/ml药物组cik细胞中tlr7蛋白表达水平具有一定程度的提高。tlr7在cik细胞培养中扮演重要角色，tlr7激动剂具有增强cik效应细胞扩增能力和杀瘤活性的作用。该结果说明，说明魔芋葡甘聚糖对cik细胞增殖活性和杀伤活性的提高可能与激活tlr7蛋白表达有一定关系。cik细胞是同时表达cd3和cd56两种膜蛋白分子(cd3+cd56+)的一类细胞，具有杀瘤谱广、效率高的特点。提高cik细胞的体外增殖率及其对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用cik细胞进行细胞免疫治疗的关键。本发明以上实验结果表明，魔芋葡甘聚糖具有促进cik细胞的体外增殖并提高其对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于cik细胞体外培养、制备cik细胞体外培养基。实施例2：一种cik细胞体外培养基，用于促进cik细胞扩增并提高其杀瘤活性，含有有效浓度的魔芋葡甘聚糖。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12