本发明属于肿瘤学
技术领域：
，涉及cenpk基因在胃癌诊断与治疗中的应用，具体涉及特异性检测cenpk基因及其表达产物的试剂在制备判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品中的应用。
背景技术：
：胃癌在世界范围内是最常见的恶性肿瘤之一，我国是胃癌的高发区，其发病率和死亡率居消化道肿瘤的首位。然而早期胃癌发现率低，临床中可用的胃癌早期诊断的标志物较少。另外，目前尚缺乏有效的针对胃癌的靶向药物。因此，进一步深入阐明胃癌的发生发展机理，有目的寻找新的胃癌诊治的标志物以及有效的靶向药物，对改善胃癌的诊疗现状有十分重要的意义。着丝粒蛋白k(centromereproteink,cenpk)是着丝粒蛋白家族的一个成员，与细胞的正常有丝分裂密切相关，并且参与细胞间期核质的形成。现有技术中并未公开cenpk基因与胃癌之间的关系。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了人cenpk基因在胃癌诊断与治疗中的应用。人cenpk基因能够用于判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发；并通过抑制cenpk基因表达，能够开发出治疗胃癌的靶向药物。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供特异性检测cenpk基因及其表达产物的试剂在制备判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品中的应用。作为优选，上述产品包括：用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、基因芯片或全基因组测序判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品。作为优选，所述用rt-pcr判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品至少包括一对特异扩增cenpk基因的引物；所述用实时定量pcr判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品至少包括一对特异扩增cenpk基因的引物；所述用免疫检测判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品包括：与cenpk蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品包括：与cenpk基因的核酸序列杂交的特异性探针；所述用芯片判断是否患有胃癌、预判胃癌转移风险、判断胃癌是否转移、判断胃癌转移是否复发的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与cenpk蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与cenpk基因或mrna特异性结合的探针。本发明的cenpk核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的基因。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。通过对血液进行全基因组测序，能够判定cenpk基因是否高表达。作为优选，所述cenpk蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。作为优选，所述的产品包括芯片、试剂盒。作为进一步优选，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测cenpk基因转录水平的针对cenpk基因的特异性寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的cenpk蛋白的特异性抗体。所述基因芯片可用于检测包括cenpk基因在内的多个基因(例如，与胃癌转移相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括cenpk蛋白在内的多个蛋白质(例如与胃癌转移相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与胃癌转移的标志物同时检测，可大大提高胃癌诊断的准确率。所述特异性抗体包括对cenpk蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于cenpk基因产物或片段。较佳地，指那些能与cenpk基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab’或(fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子；或嵌合抗体。抗cenpk蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的cenpk蛋白。所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于特异性检测cenpk基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括cenpk蛋白的特异性抗体。作为优选，所述试剂包括针对cenpk基因的特异性引物和/或特异性探针。根据cenpk基因的核酸序列设计出用于检测cenpk基因表达水平的引物和探针。与cenpk基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。比如所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。在本发明中，cenpk基因表达产物包括cenpk蛋白以及cenpk蛋白的部分肽。所述cenpk蛋白的部分肽含有与胃癌转移相关的功能域。“cenpk蛋白”包括cenpk蛋白以及cenpk蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括cenpk蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与cenpk的dna杂交的dna所编码的蛋白质。优选地，cenpk蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：(1)由序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。(3)与seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与seqidno.1所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。在本发明的具体实施方案中，所述cenpk蛋白是具有seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白质。通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是cenpk蛋白的融合蛋白。对于与cenpk蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留cenpk蛋白的生物学活性即可。本发明的cenpk蛋白也包括对seqidno.1所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留cenpk蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。本发明还提供了抑制cenpk基因及其表达产物的试剂在制备抑制胃癌细胞生长或增殖，治疗胃癌，预防胃癌转移或治疗胃癌转移的药物中的应用。作为优选，所述药物包括：通过rna干扰抑制cenpk基因表达的双链核糖核酸，或用于抑制cenpk蛋白活性的蛋白质。本发明的药物还可包括药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明还提供一种筛选治疗胃癌的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中cenpk的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中cenpk的表达量和/或活性；其中，如果测试组中细胞的cenpk的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对cenpk的表达和/或活性有抑制作用的治疗胃癌的候选化合物；所述的细胞优选包括：胃癌细胞或正常细胞。作为优选，上述方法还包括步骤：(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对胃癌细胞生长或增殖的抑制作用。作为优选，所述步骤(b)中包括步骤：测试组中，胃癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察胃癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在胃癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察胃癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中胃癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对胃癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗胃癌的候选化合物。本发明公开了cenpk基因在胃癌中的应用，本发明通过实验发现胃癌细胞中cekpk基因的表达水平升高，并且cekpk基因可促进细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡，对cenpk基因的沉默能够显著抑制胃癌细胞的生长增殖、克隆形成以及迁移侵袭，对胃癌的发生发展起重要作用。本发明可为胃癌的诊断提供一个新的肿瘤标志物，为实现胃癌的早期诊断，提供有力的技术支持。本发明为胃癌的靶向治疗提供了一种新的方案，可通过干扰cenpk基因的表达抑制胃癌的生长和转移，改善治疗效果。本发明提供一种用于胃癌诊断的标志物，可以提供一种靶向治疗药物，早期诊断，早期治疗，提高治愈率，减少病人痛苦，减轻病人经济负担。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为cenpk基因在tcga数据库中癌症与癌旁组织样本的表达差异。图2为cenpk基因在tcga数据库中26个胃癌样本的表达。图3为cenpk基因在不同胃癌细胞中mrna的表达丰度。图4为通过qpcr验证cenpk基因的敲减效率。图5为通过wb验证cenpk基因的敲减效率。图6为mtt实验检测cenpk基因沉默后胃癌ags细胞的增殖。图7为高内涵检测cenpk基因沉默后胃癌ags细胞的增殖。图8为克隆形成实验检测cenpk基因的沉默后胃癌ags细胞的增殖。图9为流式细胞计数(facs)的方法检测cenpk基因敲减后促进胃癌细胞的凋亡。图10为细胞划痕实验检测cenpk基因敲减后胃癌mgc80-3细胞的迁移率。图11为transwell细胞侵袭实验检测cenpk基因敲减后胃癌mgc80-3细胞的迁移效率分析。图12为肿瘤移植瘤的大小。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1一、本申请人首先利用tcga数据库查找胃癌(stomachadenocarcinoma，stad)中差异表达的癌基因。通过数据过滤与标准化分析后，进一步选取了26例能够将normal(癌旁)与cancer(癌症)样本被明显的分离开的成对人样本数据，通过进一步的分析之后，筛选到了在人胃癌组织中表达有明显上调的差异新基因cenpk(如表1，图1，图2)。同时，本申请人使用real-timepcr验证所得结果，证实了cenpk基因在几种人胃癌细胞系中显著表达上调(图3)。表1cenpk基因在tcga数据库中癌症与癌旁组织样本的表达差异其中，fc表示癌症样本与癌旁样本表达量的比值。图1为cenpk基因在tcga数据库中癌症与癌旁组织样本的表达差异。图2为cenpk基因在tcga数据库中26个胃癌样本的表达。其中，logfc表示对fc取以2为底的对数值，横轴为不同的样本，每一个样本的logfc以一个柱形来表示。图3为cenpk基因在不同胃癌细胞中mrna的表达丰度。其中，δct＝目的基因ct值-内参基因ct值，δct相对较大的细胞，目的基因表达丰度相对越低：当δct值≤12时，该细胞中基因表达丰度为高；当12<δct值<16时，该细胞中基因表达丰度为中；当δct值≥16时，该细胞中基因表达丰度为低。其中，real-timepcr实验检测cenpk基因在胃癌组织中的表达情况的具体步骤为：1.抽提细胞中的总rna(使用trizol试剂盒抽提)；2.反转录获得cdna(使用promegam-mlv试剂盒)；3.real-timepcr检测：(使用广州市锐博生物科技有限公司试剂盒)cenpk上游引物序列：atggtactgtccactaaggagtc；下游引物序列：tgttcatccaaccaccgttgt。按下列比例配置反应体系(12μl体系)：①micrornapcr引物来自广州市锐博生物科技有限公司(http://www.ribobio.com/)。表2试剂每管加入量sybrpremixextaq6.0μl上游引物(5μm)0.5μl下游引物(5μm)0.5μl模板(反转录产物)1.0μlrnase-freeh2o4.0μl②rnapcr表3试剂每管加入量sybrpremixextaq6.0μl引物mix(5μm)0.3μl模板(反转录产物)0.6μlrnase-freeh2o5.1μl两步法进行real-timepcr，并制作熔解曲线，程序如表4。表4数据分析：相对定量分析f＝2-δδct；δct＝目的基因ct值-内参基因ct值；-δδct＝nc组δct平均值-各样品δct值；反映各样品相对nc组样品目的基因的相对表达水平。cenpk基因的基因信息见表5。表5cenpk基因所编码蛋白的氨基酸序列可查阅uniprotkb-q9bs16，具体为：二、本申请人以cenpk基因为模板，设计多个19-21ntrna干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取了两个序列作为干扰靶点。以胃癌ags细胞为模型，对cenpk基因的两个靶点沉默后，通过qpcr与wb验证了基因的敲减效率(图4，图5)。图4为通过qpcr验证cenpk基因的敲减效率。其中，shctrl表示对照组，shcenpk-1和shcenpk-2代表敲减cenpk的两个靶点组。*表示p<0.05,**表示p<0.01。图5为通过wb验证cenpk基因的敲减效率。其中，1：shctrl为阴性对照细胞组(negativecontrol)；2：shcenpk1和shcenpk2为基因敲减组。cenpk实际检测大小为45kda左右。其中，以胃癌ags细胞为模型，对cenpk基因的两个靶点沉默的具体步骤为：1.rna干扰靶点设计根据rna干扰序列设计原则，以cenpk基因为模板，设计多个19-21ntrna干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取表6中序列作为干扰靶点。表62.dnaoligo序列合成根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加ttttt终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链dnaoligo。具体见表7。表7其中，ccgg：agei酶切位点；aattc：ecori酶切位点；g：ecori酶切位点互补序列。3.双链dnaoligo制备将合成的单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μm)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。4.线性化载体制备按照neb说明书配制50μl反应体系，使用agei和ecori双酶切gv115载体使其线性化。反应体系见表8。表837℃(最适温度)反应1h，之后切胶回收目的片段。5.rna干扰慢病毒载体构建(1)连接按照fermentast4dnaligase说明书配制20μl反应体系，将双链dnaoligo与线性化的载体相连。具体见表9。表9于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc45250，psc45251之后进行转化实验。(2)转化将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：①将10μl连接产物psc45250，psc45251加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。②42℃热激90sec，冰浴2min。③加入500μl无抗生素的lb液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1hr。④取150μl菌液均匀涂抹在含有amp的lb固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。(3)阳性克隆的pcr鉴定(4)阳性克隆测序结果分析以鉴定引物-f进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。6.质粒抽提7.质粒转染与慢病毒收获8.慢病毒感染目的细胞使基因靶点沉默。其中，通过qpcr验证基因的敲减效率的具体方法和实验结果为：1.用试剂盒抽提细胞中的总rna(上海普飞公司trizol试剂盒)。2.将rna反转录为cdna(使用promegam-mlv试剂盒)。3.real-timepcr检测(使用广州市锐博生物科技有限公司试剂盒)cenpk上游引物序列：atggtactgtccactaaggagtc；下游引物序列：tgttcatccaaccaccgttgt。4.实验结果见图4。图4为通过qpcr验证cenpk基因的敲减效率。其中，shctrl表示对照组，shcenpk-1和shcenpk-2代表敲减cenpk的两个靶点组。*表示p<0.05,**表示p<0.01。其中，通过wb验证cenpk基因的敲减效率的具体方法和实验结果为：1.细胞中总蛋白的提取2.sds-page凝胶电泳分离蛋白3.免疫印迹(转膜，湿转)4.抗体杂交(1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的tbst溶液)室温封闭pvdf膜1h或4℃过夜。(2)一抗孵育：封闭液稀释cenpk抗体，然后将封闭好的pvdf膜室温孵育2h或4℃过夜，并用tbst洗膜4次，每次8min。一抗信息见表10。表10一抗信息(3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育pvdf膜1.5h，并用tbst洗膜4次，每次8min。二抗信息见表11。表11二抗信息5.化学发光显影。6.实验结果见图5。图5为通过wb验证cenpk基因的敲减效率。其中，1：shctrl为阴性对照细胞组(negativecontrol)；2：shcenpk1和shcenpk2为基因敲减组。cenpk实际检测大小为45kda左右。三、本申请人使用mtt法(图6)、高内涵cellomics细胞计数方法(图7)分别检测了慢病毒沉默cenpk基因后胃癌ags细胞的生长增殖能力，使用软琼脂方法检测细胞的克隆形成能力(图8)，根据以上结果，发现cenpk基因的沉默能够显著抑制胃癌ags细胞的克隆和增殖。图6为mtt实验检测cenpk基因沉默后胃癌ags细胞的增殖。其中，shcenpk-1和shcenpk-2分别表示基因沉默的两个靶点。图7为高内涵检测cenpk基因沉默后胃癌ags细胞的增殖。其中，shcenpk-1和shcenpk-2分别表示基因沉默的两个靶点。图8为克隆形成实验检测cenpk基因的沉默后胃癌ags细胞的增殖。其中，shcenpk-1和shcenpk-2分别表示基因沉默的两个靶点。其中，使用mtt法检测慢病毒沉默cenpk基因后ags细胞的生长增殖能力的具体步骤为：1.将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。2.根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(一般为2000cell/well)，每组3-5重复，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96孔板)。每板细胞数量和密度基本一致，放入细胞培养箱中培养。3.从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μl5mg/ml的mtt(黄色噻唑蓝)于孔中，无需换液。4.4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μldmso溶解甲瓒颗粒。5.振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测od值。6.数据统计分析。其中，使用高内涵cellomics细胞计数方法检测慢病毒沉默cenpk基因后ags细胞的生长增殖能力的具体步骤为：1.将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；2.根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为2000cell/well)。每组3复孔，培养体系为100μl/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致,37℃、5％co2培养箱培养；3.从铺板后第二天开始，每天用高内涵活细胞分析系统(celigo)检测读板一次，连续检测读板3-5天；4.通过调整analysissettings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。其中，使用软琼脂方法检测细胞的克隆形成能力的具体步骤为：1.准备感染后细胞：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定)，每个实验组设3个复孔。3.将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。4.实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，pbs洗涤细胞1次。5.每孔加入1ml4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，pbs洗涤细胞1次。6.每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000μl，染细胞10-20min。7.ddh2o洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数。四、本申请人通过流式细胞计数(facs)的方法发现cenpk基因敲减后可促进胃癌细胞的凋亡(图9)，具体步骤和实验结果为：1.待各实验组6孔板细胞生长至覆盖率约为70％时开始实验。2.若为贴壁细胞，则上清中细胞也需收集。胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一5ml离心管中，每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×105/处理)。3.1300rpm离心5min，弃上清，4℃预冷的d-hanks(ph＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀。4.1×bindingbuffer洗涤细胞沉淀一次，1300rpm、3min离心，收集细胞。5.200μl1×bindingbuffer重悬细胞沉淀。6.加入10μlannexinv-apc染色，室温避光10-15min。7.根据细胞量，补加400-800μl1×bindingbuffer，上机检测。8.结果分析，使用流式细胞仪分析软件guavaincyte进行分析。图9为流式细胞计数(facs)的方法检测cenpk基因敲减后促进胃癌细胞的凋亡。其中，shcenpk-1和shcenpk-2分别表示基因沉默的两个靶点。柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差(sd)。**，shctrl与目的基因shrna慢病毒处理组相比，p<0.01。*，shctrl与目的基因shrna慢病毒处理组相比，0.01<p<0.05。五、本申请人用划痕实验发现cenpk基因敲减后可抑制胃癌细胞的迁移(图10)，具体步骤和实验结果为：1.将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；2.根据细胞大小决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为50000cell/well)，以次日细胞达到90％以上汇合度为准。37℃、5％co2培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μl/孔。3.第二天使用划痕仪对准96孔板的上端中央部位，向上轻推形成划痕。4.使用pbs轻轻漂洗2-3遍，加入含1％fbs血清培养基，0h扫板。5.37℃、5％co2培养箱培养，根据愈合程度选择合适时间用celigo扫板，共采集三个时间点。6.用celigo分析迁移面积。图10为经shrna慢病毒感染3天后，胃癌细胞中cenpk基因表达敲减，胃癌mgc80-3细胞划痕24小时后迁移率分析。由图10发现实验组(shcenpk-1和shcenpk-2)中mgc80-3细胞的迁移能力受到显著抑制，提示cenpk基因与mgc80-3细胞的迁移能力显著相关。六、本申请人用transwell方法，发现cenpk基因敲减后可抑制胃癌细胞的转移(图11)，具体步骤为和实验结果为：1.取出transwell(corning)试剂盒，将所需数目的小室置于新的24孔板中，上室加100μl无血清培养基，37℃培养箱中放置1h。2.制备无血清细胞悬浮液，并计数，细胞数根据预实验调整，一般为105/孔(24孔板)。3.小心除去上室中培养基并加入100μl细胞悬液，下室内加入600μl30％fbs培养基。4.37℃培养箱培养一段时间(具体时间根据预实验调整。一般情况下，预实验培养16h后可以捞一个小室，染色观察，根据小室转移情况判断下一次捞取小室的时间，直到达到合适的转移密度，确定实验时间)。5.倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，将小室置于4％多聚甲醛固定液中固定半小时。6.固定后，将小室捞出，用吸水纸吸干小室表面固定液，滴1-2滴染色液到膜的下表面染色转移细胞1-3min后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。7.显微镜拍照：每个transwell小室，随机选取视野，拍100x照片4张，200x照片9张。8.以200x的照片来计数，进行数据分析，比较实验组与对照组细胞转移能力的差异：计算各组转移细胞数(migratorycellsperfield)，标准差，t-test分析得到p值，判断是否有显著性差异(p<0.05，有显著性差异，否则无显著性差异)。图11为经shrna慢病毒感染3天后，胃癌细胞中cenpk基因表达敲减，胃癌mgc80-3细胞在transwell小室中24小时后迁移效率分析。由图11发现实验组(shcenpk-1和shcenpk-2)中mgc80-3细胞的转移能力受到显著抑制，提示cenpk基因与mgc80-3细胞的转移能力显著相关。七、本申请人利用动物移植瘤实验发现cenpk基因敲减的胃肿瘤细胞的致瘤率较低，，具体步骤为和实验结果为：本申请人分别培养一定数量的胃癌肿瘤细胞，并将其中一部分的肿瘤细胞中cenpk基因敲减(kd组)，与对照组细胞(nc组)分别皮下接种到免疫缺陷动物(裸鼠)皮下，观察肿瘤形成以及移植瘤的大小。如图12所示，cenpk基因敲减(ko组)的肿瘤大小比对照组(nc组)的肿瘤体积小。说明cenpk基因敲减后可抑制肿瘤的形成与生长。图12为肿瘤移植瘤的大小。综上，通过以上研究内容和研究手段，我们证明了cenpk基因与胃癌的发生发展密切相关，在与癌旁组织的对比中，cenpk基因在胃癌中呈现高表达。将cenpk基因敲减后可以抑制胃癌细胞的生长、增殖、克隆形成、迁移、转移，以及成瘤。实施例2以cenpk基因表达产物为靶分子设计的基因治疗以cenpk基因表达产物为靶分子，设计一种携带某基因的表达载体，导入该载体，其产物对cenpk基因的表达有抑制作用，或对cenpk蛋白活性有抑制作用最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>兰州大学<120>cenpk基因在胃癌诊断与治疗中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>269<212>prt<213>着丝粒蛋白k(centromereproteink)<400>1metasnglngluaspleuaspproaspserthrthraspvalglyasp151015valthrasnthrgluglugluleuileargglucysgluglumettrp202530lysaspmetgluglucysglnasnlysleuserleuileglythrglu354045thrleuthraspserasnalaglnleuserleuleuilemetglnval505560lyscysleuthralagluleuserglntrpglnlyslysthrproglu65707580thrileproleuthrgluaspvalleuilethrleuglylysgluglu859095pheglnlysleuargglnaspleuglumetvalleuserthrlysglu100105110serlysasnglulysleulysgluaspleugluarggluglnargtrp115120125leuaspgluglnglnglnilemetgluserleuasnvalleuhisser130135140gluleulysasnlysvalgluthrphesergluserargilepheasn145150155160gluleulysthrlysmetleuasnilelysglutyrlysglulysleu165170175leuserthrleuglyglupheleugluasphispheproleuproasp180185190argservallyslyslyslyslysasnileglngluserservalasn195200205leuilethrleuhisglumetleugluileleuileasnargleuphe210215220aspvalprohisaspprotyrvallysileseraspserphetrppro225230235240protyrvalgluleuleuleuargasnglyilealaleuarghispro245250255gluaspprothrargileargleuglualaphehisgln260265当前第1页12