一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

covid-19案例很快出现在世界各国，并被世界卫生组织（worldhealthorganization，who）宣布为世界性的公共卫生威胁。虽然目前报道covid-19的中位发作时间为4-5天，但有一小部分感染者是在14天隔离之后才出现症状。covid-19最常见的症状是咳嗽和发烧。不过，也有一定比例的病人并不呈现症状，包括x光检测及ct检测。covid-19出现症状时间的不确定以及无症状感染的情况给疾病的早期精准检测带来了极大障碍，因而也使得疾病防控极具挑战。这使得covid-19病原核酸的分子检测变得尤为重要。

引起covid-19的病原已经被确认为是β属冠状病毒，被命名为sars-cov-2。和其他冠状病毒类似，sars-cov-2是单链、正义的rna病毒。sars-cov-2和sars-cov以及中东呼吸综合症冠状病毒（mers-cov）分别具有79%和50%的核酸相似性。针对covid-19的现有分子诊断方法主要是基于反转录pcr（rt-pcr）。sars-cov-2的e、n以及orf1ab基因是常用的rt-pcr的靶标基因。高通量的rt-pcr平台也已被研发出来用于大规模的诊断。不过，rt-pcr通常依赖于特别的、大型的仪器，因此大规模的rt-pcr检测往往局限于在医院的病人。

最近研究表明，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrrepeats（crispr）技术可用于病原的低成本、便携式的分子检测。crispr以及crispr-associatedgenes（cas）基因是细菌抵御外源病毒感染的免疫系统。crispr的模块特性使得此技术被广泛应用于基因组工程中。基于crispr的病原核酸的分子诊断依赖于cas核酸酶的rna或dna的靶向活性。同时，不同crispr系统可以组合实现对病原的多重检测。在最近中国爆发的非洲猪瘟疫情中，很多基于crispr-cas12a的诊断平台被开发出来。

目前作为新发传染病的新型冠状病毒，其亚基因组表达谱尚未被清晰阐明，各个基因的表达情况以及各个基因片段对扩增及crispr-cas检测的敏感性也不清楚，能否设计出针对新型冠状病毒、甲型流感病毒以及乙型流感病毒等呼吸道病原的且特异性高、无交叉反应的检测方法等本身目前仍然是未被阐明的科学问题。目前检测新型冠状病毒时所使用的传统rt-qpcr方法较容易误检，且不太容易区分新型冠状病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒的区别，这三种在临床表现上的症状是十分相似的，而实际应用时也发生了将新冠误诊为流感的案例（kongetal.,2020,natmicrobiol）。此外，基于crispr-cas12a的病原检测技术已有报道（gootenbergetal,2017,science；gootenbergetal,2018,science；chenetal,2017,science；），特别是针对新型冠状病毒的crispr检测平台也已研发成功（wangetal,2020,scibull；guoetal,2020,celldiscov；broughtonetal,2020,natbiotech），不过这些研究多侧重原理性的技术研发，对技术实现病原特异性检测的研究不够深入，如没有对各个病原亚型间特异性进行研究，同时并未明确不同探针组合间的交叉反应（如病原a探针和病原b探针在两种病原间是否存在交叉反应）。

因此，急需一种既高效快速、又具有较高的特异性和灵敏度、且检测多种呼吸道病原时无交叉反应的引物及crrna探针，以实现对多种呼吸道病原的特异性检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有检测呼吸道病原（例如新型冠状病毒（sars-cov-2）、甲型流感、乙型流感）的方法依赖于大型仪器、检测不方便等缺陷，提供了一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、一种呼吸道病原的核酸的检测方法、crrna、引物对及其应用。首先，本发明的试剂盒和检测方法不依赖于大型仪器而可通过肉眼直接进行结果观测，同时在温和的条件（25-42℃）即可实现检测，检测更方便。使用本发明的试剂盒和检测方法可用于高效、快速地检测/诊断呼吸道病原（例如甲型流感、乙型流感以及新冠状病毒等）。其次，使用本发明的试剂盒和检测方法检测多种呼吸道病原（例如甲型流感、乙型流感以及新冠状病毒等）相互之间时无交叉反应，且检测的特异性和灵敏度均较高。目前没有任何专利或文献报道能够完整的实现新型冠状病毒、甲型流感、乙型流感的同时检测，本申请首次提供了一种试剂盒和检测方法等，其在保证灵敏度的同时，实现对新冠、甲流和乙流的完整的、交互的特异性检测。本发明的试剂盒和检测方法可用于呼吸道病原的检测与筛查，例如快速区分包括甲型流感（包括各种亚型）、乙型流感（包括各种亚型）以及新型冠状病毒在内的多种呼吸道病原。此外，目前所有基于crispr的检测都是采用呼吸道样品如咽拭子或鼻拭子，而本发明的试剂盒和检测方法进一步还可以实现对除呼吸道样品外其他类型样品（例如肛拭子、粪便、痰液、痰液上清等分泌物）的检测；同时可对活体组织来源的、含有多种病原的样品中各个病原实现检测。

首先，在设计检测新型冠状病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒的crrna和引物时，一方面需要考虑检测新冠和其他流感时预防出现交叉反应而出现误诊，另一方面由于新冠病毒自身的亚基因组结构（subgenomicarchitecture）并未有明确的科学阐释。目前研究表明，新冠病毒的亚基因组结构由于含有10个不连续的编码区而十分复杂，各个基因的表达情况以及各个基因片段对扩增及crispr-cas检测的敏感性也不清楚；同时除了已知的10个编码区还有其他未知的转录本。在设计引物时需要寻找出转录效率高的病原基因片段进行设计（例如本发明人发现，同为新冠病毒基因，n基因比m基因更易获得高效扩增的引物（图14和15）；还发现同为m基因，不同片段的扩增效率差异很大（图14））、设计crrna时需要满足cas12apam序列的限制，同时还需要考虑必须定位于引物扩增区域之内，同时满足这些要求的引物对和crrna还需要能够保证较高的灵敏度和特异性，还需要保证同时检测新型冠状病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒时不发生交叉反应，设计难度非常大。其次，特异性反映的是筛检试验确定非阳性样本的能力；灵敏度是指某方法对单位浓度或单位量待测物质变化所致的响应量变化程度；在设计crrna和引物对的过程中，需要平衡特异性和灵敏度的关系，众所周知本领域中同时提高敏感度和特异度的难度非常大。在保证高特异性的同时灵敏度就会有所下降，在保证灵敏度高的同时特异性就会下降。本发明所要保护的试剂盒中检测不同的病毒时，不仅能够保证特异性的同时，而且还能够保证很高的灵敏度。此外，目前所有的基于crispr的检测都是采用咽拭子等呼吸道样品，而本发明的试剂盒和检测方法所检测的样品的范围大，不局限于呼吸道样品（如咽拭子或鼻拭子），例如还可用于检测肛拭子、粪便、痰液、痰液上清等分泌物等，而检测不同部位和不同环境的样品时所存在的干扰细菌均有所不一样，例如检测肛拭子、粪便等时会存在大肠杆菌等干扰性物质，对检测的灵敏度和特异性均会产生影响。而本发明的试剂盒和检测方法在各种不同类型的样品中均能够保持良好的特异性和灵敏度且不发生交叉感染，适用范围很广。

为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种检测呼吸道病原的核酸的靶标位点，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中，

检测所述新型冠状病毒的靶标位点的序列如seqidno:1-20中的一种或多种所示；

检测所述甲型流感病毒的靶标位点的序列如seqidno:21-24中的一种或多种所示；

检测所述乙型流感病毒的靶标位点的序列如seqidno:25-28、103中的一种或多种所示；

本发明中所述的这些靶标位点能特异性区分3种呼吸道病原（新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒）且其对应的dna序列包含cas蛋白（例如cas12a）识别的pam序列。此外，本领域技术人员应当理解的是，与seqidno:1-28、103互补的rna序列、将seqidno:1-28、103反转录后的双链dna中任一链的序列所示的靶标位点也应当在本发明的保护范围之内。

其中，检测所述新型冠状病毒的orf1ab基因的靶标位点的序列如seqidno:1-4中的一种或多种所示。

其中，检测所述新型冠状病毒的s基因的靶标位点的序列如seqidno:5-8中的一种或多种所示。

其中，检测所述新型冠状病毒的e基因的靶标位点的序列如seqidno:9-12中的一种或多种所示。

其中，检测所述新型冠状病毒的m基因的靶标位点的序列如seqidno:13-16中的一种或多种所示。

其中，检测所述新型冠状病毒的n基因的靶标位点的序列如seqidno:17-20中的一种或多种所示。

在本发明某一较佳实施例中，检测新型冠状病毒的s基因和e基因靶位点可以产生较高的信号（可达3×10⁷），检测新型冠状病毒的orf1ab、m基因和n基因时信号也较强，但未超过3×10⁷。

本发明中，所述的检测甲型流感病毒主要是检测所述甲型流感病毒的m基因。其中，所述的甲型流感病毒（influenzaavirus，iav）可以为本领域常规，通常根据h和n抗原不同，分为许多亚型，h可分为18个亚型（h1～h18），n有11个亚型（n1～n11），例如包括h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h7n1、h7n2、h7n3、h7n7、h7n9、h9n2和h10n8等亚型，例如可以为h1n1、h3n2、h9n2。

本发明中，所述的检测乙型流感病毒主要是检测所述乙型流感病毒的ha基因。其中，所述的乙型流感病毒（influenzabvirus，ibv）可以为本领域常规，例如包括yamagata系（山形系）或者victoria系（维多利亚系）乙型流感病毒等。其中，检测所述乙型流感病毒的yamagata系（山形系）的靶标位点的序列可以是如seqidno:25-28中的一种或多种所示。其中，检测所述乙型流感病毒的victoria系（维多利亚系）的靶标位点的序列可以是如seqidno:25、26、103、28中的一种或多种所示。

本发明中，所述的靶标位点可以是优选用于crispr-cas检测体系。

本发明中，所得的靶向序列的5’端具有5’-tttn-3’序列，且靶向序列本身和其余序列间不形成稳定二级结构。

为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种crrna和引物对的组合，所述crrna和引物对为检测呼吸道病原的核酸的crrna和引物对，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒；其中，

检测所述新型冠状病毒的orf1ab基因的crrna的序列如seqidno:32所示；检测所述新型冠状病毒的s基因的crrna的序列如seqidno:34所示；检测所述新型冠状病毒的e基因的crrna的序列如seqidno:38所示；检测所述新型冠状病毒的m基因的crrna的序列如seqidno:43所示；检测所述新型冠状病毒的n基因的crrna的序列如seqidno:48所示；检测所述甲型流感病毒的m基因的crrna的序列如seqidno:51所示；和，检测所述乙型流感病毒的ha基因的crrna的序列如seqidno:56所示；

扩增所述新型冠状病毒的orf1ab基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:58和seqidno:62所示；扩增所述新型冠状病毒的s基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:66和seqidno:70所示；扩增所述新型冠状病毒的e基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:74和seqidno:78所示；扩增所述新型冠状病毒的m基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:82和seqidno:86所示；扩增所述新型冠状病毒的n基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:90和seqidno:94所示；扩增所述甲型流感病毒的m基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:98和seqidno.99所示；和，扩增所述乙型流感病毒的ha基因的引物对的核苷酸序列如seqidno:100和seqidno.101所示；

所述crrna用于crispr-cas检测体系，所述引物对用于qpcr、lamp（loop-mediatedisothermalamplification，环介导等温扩增反应）或rpa（recombinasepolymeraseamplification，重组酶聚合酶介导等温扩增）中以扩增所述呼吸道病原的核酸（的靶标位点）。

本发明中，所述的rpa为本领域常规含义，其一般也包括基于rpa的衍生反应。通常可以是包括针对dna模板的普通rpa，还可以是针对rna模板的结合反转录的rt-rpa（rt为reversetranscription缩写）。

本发明中，所述的引物对可用于扩增新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的靶位点序列从而实现cas12a的荧光检测。这些引物对在其他反应（如qpcr）中及其他crispr系统（如cas12b或cas13等）的应用也在本发明的保护范围。

为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种用于检测呼吸道病原的核酸的试剂盒，其包括crispr-cas检测体系，所述crispr-cas检测体系包括：crrna、引物对、cas蛋白和核酸探针；其中，所述的crrna和所述的引物对如本发明第二方面所述。

较佳地，所述crispr-cas检测体系还包括金属离子和/或缓冲液。

本发明中，所述的cas蛋白可以为本领域常规，例如包括cas9、cas12a、cas12b和/或cas13。其中，所述的cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的cas蛋白。比如cas12a、cas12b等。所述cas12a的氨基酸序列优选如seqidno.57所示，其核苷酸序列优选如seqidno.102所示。

本发明中，所述的crispr-cas检测体系中包括的核酸探针可以是单链dna探针。本领域技术人员应当理解地是，本领域常规使用的核酸探针都应该能够完成本发明。在本发明某一较佳实施例中，所述的核酸探针可以是购于通用生物系统（安徽）有限公司，型号为rx012179的核酸探针。

本发明中，所述的cas蛋白的含量通常可以为100ng。在某一较佳实施例中，所述的试剂盒包括（适用于20μl体系反应）：100ngcas蛋白，25pm核酸探针例如单链dna探针，和cas12a等摩尔比的crrna。以用来检测2μl待检测病毒核酸（例如可以是使用上述引物对进行rt-rpa反应的产物或针对呼吸道病原rna核酸的靶标位点反转录后的双链dna模拟底物），所述的试剂盒还可以包括50mmtris-hcl,ph7.5,100mmnacl,10mmmgcl2,100μg/mlbsa。

为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种呼吸道病原的核酸的检测方法，利用如本发明第三方面所述的试剂盒中所述的crispr-cas检测体系检测所述核酸（例如利用cas12a蛋白和对应所述靶标位点的crrna进行crispr核酸检测）、和/或利用如本发明第五方面所述的试剂盒中的引物对扩增所述核酸。

本发明中，所述的核酸的检测方法通常是非诊断目的的，例如以离体样本进行实验供研发使用等，或者已感染新冠病毒的病人的痰液、粪便等分泌物对环境造成污染后，检测从这些环境中采集的样本。

为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了如本发明第二方面所述的crrna和引物对在检测呼吸道病原的核酸、或在制备检测呼吸道病原的核酸的试剂或试剂盒中的应用。

较佳地，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒。

较佳地，所述检测为使用crispr-cas检测体系（例如利用cas12a蛋白和对应所述靶标位点的crrna进行crispr核酸检测）、qpcr、lamp和/或rpa（例如rt-rpa）进行检测。

为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了如本发明第二方面所述的crrna在制备预防和/治疗呼吸道病原感染的药物中的应用，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒。

较佳地，所述crrna利用crispr-cas系统破坏受试者体内的呼吸道病原。

本发明还提供了一种crispr-cas12a特异性检测系统，其包括cas12a蛋白和crrna，所述crrna为检测如本发明第一方面所述靶标位点的crrna，其用于检测3种呼吸道病原（新型冠状病毒、甲型流感、乙型流感）。

较佳地，检测新型冠状病毒的crrna的序列如seqidno:29-40、42、43、45-48中的一种或多种所示。

较佳地，检测甲型流感病毒的crrna的序列如seqidno:50-52中的一种或多种所示。

较佳地，检测乙型流感病毒的crrna的序列如seqidno:53-56中的一种或多种所示。

本发明还提供了一种组合物，其包括本发明第二方面所述的crrna和/或本发明第三方面所述的引物对。

本发明中，所述的核酸的检测方法可以是基于crispr-cas12a系统，特别是基于crispr-cas12a单链dna活性激活反应。

术语解释

术语crrna是指crisprrna，是短的引导cas12a（cpf1）到结合到靶标dna序列的rna。

术语crispr是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。

术语cas蛋白是指crispr-associated蛋白，它是crispr系统中的相关蛋白。

术语cas12a（又称cpf1）是指crrna依赖的内切酶，它是crispr系统分类中v型（typev）的酶。

术语pam是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacentmotif)，是cas12a切割所必须，lbcas12a的pam为tttn序列。

本发明中，所述的病原（又称病原体，pathogen）通常是能引起疾病的微生物和寄生虫等的统称。微生物占绝大多数，包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌等；寄生虫主要包括源虫和嚅虫等。

本发明中，所述检测可以是检测样本中是否含有所述的呼吸道病原，即所检测的样本可以是含有呼吸道病原的样本，也可以是不含有呼吸道病原的样本。所述的检测可以是用来筛查样本中是否含有所述的呼吸道病原，例如用来筛查离体的样本。

本发明中，所述的“一种或多种”中的“多种”可以是指2种、3种、4种或者更多种。

本发明中，所述“包括、包含或含有”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

（1）本发明的试剂盒和检测方法不依赖于大型仪器而可通过肉眼直接进行结果观测，同时在温和的条件（25-42℃）即可实现检测，检测更方便。使用本发明的试剂盒和检测方法可用于高效、快速地检测/诊断呼吸道病原（例如甲型流感、乙型流感以及新冠状病毒等）。

（2）使用本发明的试剂盒和检测方法检测多种呼吸道病原（例如甲型流感、乙型流感以及新冠状病毒等）相互之间时无交叉反应，且检测的特异性和灵敏度均较高。目前没有任何专利或文献报道能够完整的实现新型冠状病毒、甲型流感、乙型流感的同时检测，而本申请首次提供了一种试剂盒和检测方法等，其在保证灵敏度的同时，实现对新冠、甲流和乙流的完整的、交互的特异性检测。本发明的试剂盒和检测方法可用于呼吸道病原的检测与筛查，例如快速区分包括甲型流感（包括各种亚型）、乙型流感（包括各种亚型）以及新型冠状病毒在内的多种呼吸道病原。

（3）此外，目前所有基于crispr的检测都是采用呼吸道样品如咽拭子或鼻拭子，而本发明的试剂盒和检测方法进一步还可以实现对除呼吸道样品外其他类型样品（例如肛拭子、粪便、痰液、痰液上清等分泌物）的检测；同时可对活体组织来源的、含有多种病原的样品中各个病原实现检测。

在本发明某一较佳实施例中，使用本发明的试剂盒和检测方法同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒的不同亚型和乙型流感病毒的不同亚型时，没有任何交叉反应，特异性很高。在本发明某一较佳实施例中，使用本发明的试剂盒和检测方法检测新型冠状病毒和甲型流感病毒的灵敏度均可达5病毒拷贝；检测乙型流感病毒的灵敏度可达3病毒拷贝。

附图说明

图1为针对新型冠状病毒orf1ab基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。

图2为针对新型冠状病毒s基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。

图3为针对新型冠状病毒m基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。

图4为针对新型冠状病毒e基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。

图5为针对新型冠状病毒n基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。

图6为针对甲型流感病毒（h1n1）m基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。

图7为针对乙型流感病毒（victoria亚型（维多利亚系）和yamagata亚型（山形系））ha基因靶点的cas12a荧光检测。相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrnaseqidno.55是可以检测yamagata亚型（山形系）的特异性探针。

图8为针对新型冠状病毒s基因靶点的cas12acrrna探针seqidno.34能特异性检测新型冠状病毒，与甲型流感病毒及乙型流感病毒无交叉反应。同时，seqidno.34能区分不同类型冠状病毒。

图9为针对甲型流感病毒m基因靶点的cas12acrrna探针seqidno.51能特异性检测甲型流感病毒，与新型冠状病毒及乙型流感病毒无交叉反应。

图10为针对乙型流感病毒ha基因靶点的cas12acrrna探针seqidno.56能特异性检测乙型流感病毒，与新型冠状病毒及甲型流感病毒无交叉反应。

图11为针对新型冠状病毒orf1ab基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.58-61，reverseprimers5-8分别为seqidno.62-65。

图12为针对新型冠状病毒s基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.66-69，reverseprimers5-8分别为seqidno.70-73。

图13为针对新型冠状病毒e基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.74-77，reverseprimers5-8分别为seqidno.78-81。

图14为针对新型冠状病毒m基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.82-85，reverseprimers5-8分别为seqidno.86-89。

图15为针对新型冠状病毒n基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.90-93，reverseprimers5-8分别为seqidno.94-97。

图16为基于cas12a荧光检测的裸眼数据读取，新型冠状病毒样本。白色发亮试管对应产生荧光信号的病毒核酸样本。

图17显示了对新型冠状病毒的灵敏度的检测结果。

图18显示了对甲型流感病毒的灵敏度的检测结果。

图19显示了对乙型流感病毒的灵敏度的检测结果。

图20显示了针对不同类型的样品进行的检测结果。

图21显示了针对动物活体组织来源、含有多种病原的样品中每个病原的检测结果。

图22显示了cas12a蛋白浓度与检测效率的依赖性关系。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

（1）cas12a蛋白的表达与纯化

lachnospiraceaebacteriumnd2006来源的cas12a（lbcas12a，氨基酸序列如seqidno:57所示）基因通过密码子优化（优化后的序列如seqidno:102所示）后，连接进pet28a质粒（thermofisherscientific,massachusetts,usa）中，蛋白表达受t7启动子调控。lbcas12a的c端含有his6标签，用于亲和力纯化，cas12a和his6序列中间插入有tev酶切位点。将所得的重组质粒（下称pet28a-lbcas12a）转化进入escherichiacolibl21(de3)细胞中。第二天，单克隆接种进含有50μg/mlkanamycin的luria-bertani(lb)培养基中，在37℃震荡培养。在od600达到0.8时，加入1mm的isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside(iptg)诱导蛋白质表达，在37℃培养16小时。细胞通过在4℃进行5,000g离心10分钟来收集。

收集的细胞在裂解缓冲液（20mmtris-hcl,ph8.0,500mmnacl,10%(v/v)glycerol,0.5mmphenylmethylsulfonylfluoride(pmsf)）中进行重悬。表达的cas12a蛋白质通过ni-nta柱子（qiagen,shanghai,china）进行纯化。纯化后的蛋白在用fastproteinliquidchromatography(fplc)进行纯化，采用superdex200的过滤柱(gehealthcarelifesciences,connecticut,usa)。纯化的蛋白质保存于存储缓冲液中（20mmtris-hcl,ph7.5,500mmnacl,10%(v/v)glycerol,2mmdithiolthreitol(dtt)），分装后保存于-80℃。蛋白质浓度通过bcaproteinassaykit（thermofisherscientific,massachusetts,usa）测定。

（2）crrna和dna底物的制备

针对呼吸道病原rna核酸的靶标位点（序列详见表1）反转录后的双链dna底物的crrna（详见表2）通过genscriptbiotech(nanjing,jiangsu,china)进行合成。模拟呼吸道病原rna核酸的底物dna由tsingkebiologicaltechnology(shanghai,china)进行合成，并克隆进入puc57载体中作为模板，通过pcr扩增获得模拟等温扩增的产物。

表1

表2

（3）等温扩增

等温扩增通过商业化的rt-rpa试剂盒(qitiangenebiotech,wuxi,jiangsu,china)完成。步骤简要如下：在50μl的rt-rpa（reversetranscriptionrecombinasepolymeraseamplification，逆转录重组酶聚合酶介导等温扩增）反应液中加入2μl病原核酸样本，0.4μm的正向及反向引物（详见表3）。最后加入14mm的醋酸镁起始反应，并在42℃孵育20分钟，得到rt-rpa反应产物。

表3

（4）基于crispr-cas12a的荧光激活反应

荧光激活反应在20μl体系中进行，包括：50mmtris-hcl,ph7.5,100mmnacl,10mmmgcl2,100μg/mlbovineserumalbumin(bsa),0.05单位（对应100ng）纯化的lbcas12a，25pm单链dna探针（购于通用生物系统（安徽）有限公司，型号为rx012179），和cas12a等摩尔比的crrna，2μl上述rt-rpa反应产物（或针对呼吸道病原rna核酸的靶标位点反转录后的双链dna模拟底物）。反应在37℃孵育30分钟。荧光信号可以通过酶标仪进行读取，也可通过照胶仪肉眼进行判定。荧光探针的excitation波长和emission波长分别为485nm及520nm。

（5）实验结果

图1-5中显示了新型冠状病毒核酸的特异性检测的结果图。其中，图1为针对新型冠状病毒orf1ab基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:29-32）混合后所得。由图1中可以看出，crrna1-4（seqidno:29-32）以及crrna混合（mix）均能高效地检测对应的基因片段，信号强度均在1×10⁷以上。

图2为针对新型冠状病毒s基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:33-36）混合后所得。由图2中可以看出，crrna1-4（seqidno:33-36）以及crrna混合（mix）均能高效地检测对应的基因片段，信号强度均在1×10⁷以上，其中crrna1、2、4（seqidno:33、34、36）以及crrna混合（mix）的信号强度均在2×10⁷以上。

图3为针对新型冠状病毒e基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:37-40）混合后所得。由图3中可以看出，crrna1-4（seqidno:37-40）以及crrna混合（mix）均能高效地检测对应的基因片段，信号强度均在1×10⁷以上，其中crrna2-4（seqidno:38-40）以及crrna混合（mix）的信号强度均在2×10⁷以上。

图4为针对新型冠状病毒m基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:41-44）混合后所得。由图4中可以看出，crrna2和crrna3（seqidno:42、43）能够检测对应的基因片段，其中crrna3（seqidno:43）的检测效果较佳，信号强度在2×10⁷以上。

图5为针对新型冠状病毒n基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:45-48）混合后所得。由图5中可以看出，crrna1-4（seqidno:45-48）以及crrna混合（mix）能高效地检测对应的基因片段，信号强度大部分在1×10⁷左右或以上。

图6中显示了甲型流感病毒（iav）核酸的特异性检测的结果图，具体是针对甲型流感病毒（h1n1）m基因靶点的cas12a荧光检测，相应靶位点序列及crrna序列如图所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:49-52）混合后所得。由图6中可以看出，crrna2-4（seqidno:50-52）以及crrna混合（mix）能高效地检测对应的基因片段，信号强度均在5×10⁶以上，其中crrna3（seqidno:51）的信号强度高达2×10⁷以上。

图7中显示了乙型流感病毒（ibv）不同亚型（victoria亚型（维多利亚系）和yamagata亚型（山形系））的核酸的特异性检测，具体是针对乙型流感病毒ha基因靶点的cas12a荧光检测。相应靶位点序列及crrna序列如图所示，其中yamagata亚型（山形系）特异性的靶标位点序列如seqidno:27所示，victoria亚型（维多利亚系）特异性的靶标位点序列如seqidno:103所示。其中crrna混合（mix）为crrna1-4（seqidno:53-56）混合后所得。由图7中可以看出，crrna1-4（seqidno:53-56）以及crrna混合（mix）能高效地检测对应的基因片段，其中crrna3（seqidno.55）是可以检测yamagata亚型（山形系）的特异性探针。

图8为针对新型冠状病毒s基因靶点的cas12acrrna探针seqidno.34能特异性检测新型冠状病毒，与甲型流感病毒及乙型流感病毒无交叉反应。同时，seqidno.34能区分不同类型冠状病毒。图9为针对甲型流感病毒m基因靶点的cas12acrrna探针seqidno.51能特异性检测甲型流感病毒，与包括新型冠状病毒在内的多种冠状病毒及乙型流感病毒无交叉反应。图10为针对乙型流感病毒ha基因靶点的cas12acrrna探针seqidno.56能特异性检测乙型流感病毒，与包括新型冠状病毒在内的多种冠状病毒及甲型流感病毒无交叉反应。由图8-10中可以看出，特异性crrna探针对新型冠状病毒、甲型流感病毒及乙型流感病毒无交叉反应。

图11为针对新型冠状病毒orf1ab基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.58-61，reverseprimers5-8分别为seqidno.62-65。这些引物对扩增后均能够检测出信号，其中正向引物与反向引物分别为seqidno:58与seqidno:62、63、64或65时；正向引物与反向引物分别为seqidno:59与seqidno:64时；正向引物与反向引物分别为seqidno:60与seqidno:62时；正向引物与反向引物分别为seqidno:60与seqidno:64时；以及正向引物与反向引物分别为seqidno:61与seqidno:62、63或64时，荧光信号强度都在0.5×10⁸以上。其中采用crrna探针为seqidno:32。

图12为针对新型冠状病毒s基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.66-69，reverseprimers5-8分别为seqidno.70-73。这些引物对扩增后基本能够检测出信号，其中正向引物与反向引物分别为seqidno:66与seqidno:70时；正向引物与反向引物分别为seqidno:66与seqidno:72时；正向引物与反向引物分别为seqidno:66与seqidno:73时；正向引物与反向引物分别为seqidno:69与seqidno:72时；以及正向引物与反向引物分别为seqidno:69与seqidno:73时，荧光信号强度较强，均显著高于0.5×10⁸。其中采用crrna探针为seqidno:34。

图13为针对新型冠状病毒e基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.74-77，reverseprimers5-8分别为seqidno.78-81。这些引物对扩增后均能够检测出信号，其中正向引物与反向引物分别为seqidno:74与seqidno:78、79、80或81时；正向引物与反向引物分别为seqidno:75与seqidno:78、79或81时；正向引物与反向引物分别为seqidno:76与seqidno:78或81时；正向引物与反向引物分别为seqidno:77与seqidno:78、79或81时，荧光信号强度较强，均显著高于0.5×10⁸。其中采用crrna探针为seqidno:38。

图14为针对新型冠状病毒m基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.82-85，reverseprimers5-8分别为seqidno.86-89。这些引物对扩增后基本能够检测出信号，其中正向引物与反向引物分别为seqidno:82与seqidno:86时；正向引物与反向引物分别为seqidno:83与seqidno:86时；正向引物与反向引物分别为seqidno:83与seqidno:89时；正向引物与反向引物分别为seqidno:85与seqidno:87时，荧光信号强度较强。其中采用crrna探针为seqidno:43。

图15为针对新型冠状病毒n基因靶点的rt-rpa引物筛选。forwardprimers1-4分别为seqidno.90-93，reverseprimers5-8分别为seqidno.94-97。这些引物对扩增后均能够检测出信号，且信号强度均很强，都在0.5×10⁸以上。其中采用crrna探针为seqidno:45。

由图11-15中可以看出，特异性rt-rpa可扩增新型冠状病毒的靶位点序列用于cas12a的荧光检测。

图16为基于cas12a荧光检测的裸眼数据读取，新型冠状病毒样本。白色发亮试管对应产生荧光信号的病毒核酸样本。

采用实验室新型冠状病毒的标准毒株的核酸样本，进行浓度梯度稀释（样本稀释后的病毒拷贝数分别为3200、650、130、26、5、1、0.2病毒拷贝）后进行检测，观察是否出现阳性信号。图17显示了对新型冠状病毒的灵敏度的检测结果，由图中可知其灵敏度为5病毒拷贝/每反应。

采用实验室甲型流感病毒的标准毒株的核酸样本，进行浓度梯度稀释（样本稀释后的病毒拷贝数分别为3500、700、140、28、5、1、0.2病毒拷贝）后进行检测，观察是否出现阳性信号。图18显示了对甲型流感病毒的灵敏度的检测结果，由图中可知其灵敏度为5病毒拷贝/每反应。

采用实验室乙型流感病毒的标准毒株的核酸样本，进行浓度梯度稀释（样本稀释后的病毒拷贝数分别为2000、400、80、16、3.2、0.6、0.1病毒拷贝）后进行检测，观察是否出现阳性信号。图19显示了对乙型流感病毒的灵敏度的检测结果，由图中可知其灵敏度为3病毒拷贝/每反应。

实施例2

针对不同类型的样品进行的检测时所得结果如图20所示，检测方法同实施例1。从图中可以看出实施例1中的crrna和引物对能够针对不同样品类型（包括痰液上清、鼻拭子、咽拭子、痰液、肛拭子、粪便等）进行检测，其检测的特异性和灵敏度均较高。

实施例3针对活体组织来源、含有多种病原的样品中每个病原的检测

将编码有ace2的腺病毒（adenovirusserotype5，ad5）通过滴鼻（intranasal，in）转染到balb/c小鼠上；5天后，再将新冠病毒通过滴鼻转染到小鼠内，1至7天收取样品进行病毒滴度及核酸检测（检测方法同实施例1）。结果如图21所示，由图中可以看出，除能检测到新冠病毒（n和s基因）外，也能检测到腺病毒。可见，实施例1中的crrna和引物对可对活体组织来源的、含有多种病原的样品中各个病原实现检测。

实施例4cas12a蛋白浓度与检测效率的依赖性关系

结果如图22所示。图22的a中为dna底物浓度固定，b中为dna底物浓度随cas12a浓度等比例增加。

通过对三批次cas12a蛋白的研究发现，蛋白浓度并不是越高越好，在固定底物dna的情况下高浓度cas12a反而会抑制检测效率（荧光强度）；而高浓度cas12a蛋白对反应的抑制效果也是取决于底物dna的浓度（含量），即如果dna浓度增大则抑制效果消失。比较a和b可推测出，在极低底物dna浓度的情况下，过量的cas12a蛋白质会抑制反应。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

sequencelisting

<110>上海科技大学

<120>一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用

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cuauggccuuugcauguuccccu23

<210>55

<211>23

<212>rna

<213>artificialsequence

<220>

<223>乙型流感病毒ha基因，crrna3，靶向正链

<400>55

aagcuugccaauggaaccaaaua23

<210>56

<211>23

<212>rna

<213>artificialsequence

<220>

<223>乙型流感病毒ha基因，crrna4，靶向负链

<400>56

cuuuaauaguuuugcaggagguc23

<210>57

<211>1227

<212>prt

<213>lachnospiraceaebacteriumnd2006

<400>57

serlysleuglulysphethrasncystyrserleuserlysthrleu

151015

argphelysalaileprovalglylysthrglngluasnileaspasn

202530

lysargleuleuvalgluaspglulysargalagluasptyrlysgly

354045

vallyslysleuleuaspargtyrtyrleuserpheileasnaspval

505560

leuhisserilelysleulysasnleuasnasntyrileserleuphe

65707580

arglyslysthrargthrglulysgluasnlysgluleugluasnleu

859095

gluileasnleuarglysgluilealalysalaphelysglyasnglu

100105110

glytyrlysserleuphelyslysaspileilegluthrileleupro

115120125

glupheleuaspasplysaspgluilealaleuvalasnserpheasn

130135140

glyphethrthralaphethrglyphepheaspasnarggluasnmet

145150155160

phesergluglualalysserthrserilealapheargcysileasn

165170175

gluasnleuthrargtyrileserasnmetaspilepheglulysval

180185190

aspalailepheasplyshisgluvalglngluilelysglulysile

195200205

leuasnserasptyraspvalgluaspphephegluglygluphephe

210215220

asnphevalleuthrglngluglyileaspvaltyrasnalaileile

225230235240

glyglyphevalthrgluserglyglulysilelysglyleuasnglu

245250255

tyrileasnleutyrasnglnlysthrlysglnlysleuprolysphe

260265270

lysproleutyrlysglnvalleuserasparggluserleuserphe

275280285

tyrglygluglytyrthrseraspglugluvalleugluvalphearg

290295300

asnthrleuasnlysasnsergluilepheserserilelyslysleu

305310315320

glulysleuphelysasnpheaspglutyrserseralaglyilephe

325330335

vallysasnglyproalaileserthrileserlysaspilephegly

340345350

glutrpasnvalileargasplystrpasnalaglutyraspaspile

355360365

hisleulyslyslysalavalvalthrglulystyrgluaspasparg

370375380

arglysserphelyslysileglyserpheserleugluglnleugln

385390395400

glutyralaaspalaaspleuservalvalglulysleulysgluile

405410415

ileileglnlysvalaspgluiletyrlysvaltyrglyserserglu

420425430

lysleupheaspalaaspphevalleuglulysserleulyslysasn

435440445

aspalavalvalalailemetlysaspleuleuaspservallysser

450455460

phegluasntyrilelysalaphepheglygluglylysgluthrasn

465470475480

argaspgluserphetyrglyaspphevalleualatyraspileleu

485490495

leulysvalasphisiletyraspalaileargasntyrvalthrgln

500505510

lysprotyrserlysasplysphelysleutyrpheglnasnprogln

515520525

phemetglyglytrpasplysasplysgluthrasptyrargalathr

530535540

ileleuargtyrglyserlystyrtyrleualailemetasplyslys

545550555560

tyralalyscysleuglnlysileasplysaspaspvalasnglyasn

565570575

tyrglulysileasntyrlysleuleuproglyproasnlysmetleu

580585590

prolysvalphepheserlyslystrpmetalatyrtyrasnproser

595600605

gluaspileglnlysiletyrlysasnglythrphelyslysglyasp

610615620

metpheasnleuasnaspcyshislysleuileaspphephelysasp

625630635640

serileserargtyrprolystrpserasnalatyrasppheasnphe

645650655

sergluthrglulystyrlysaspilealaglyphetyrarggluval

660665670

glugluglnglytyrlysvalserphegluseralaserlyslysglu

675680685

valasplysleuvalglugluglylysleutyrmetpheglniletyr

690695700

asnlysasppheserasplysserhisglythrproasnleuhisthr

705710715720

mettyrphelysleuleupheaspgluasnasnhisglyglnilearg

725730735

leuserglyglyalagluleuphemetargargalaserleulyslys

740745750

glugluleuvalvalhisproalaasnserproilealaasnlysasn

755760765

proaspasnprolyslysthrthrthrleusertyraspvaltyrlys

770775780

asplysargphesergluaspglntyrgluleuhisileproileala

785790795800

ileasnlyscysprolysasnilephelysileasnthrgluvalarg

805810815

valleuleulyshisaspaspasnprotyrvalileglyileasparg

820825830

glygluargasnleuleutyrilevalvalvalaspglylysglyasn

835840845

ilevalgluglntyrserleuasngluileileasnasnpheasngly

850855860

ileargilelysthrasptyrhisserleuleuasplyslysglulys

865870875880

gluargpheglualaargglnasntrpthrserilegluasnilelys

885890895

gluleulysalaglytyrileserglnvalvalhislysilecysglu

900905910

leuvalglulystyraspalavalilealaleugluaspleuasnser

915920925

glyphelysasnserargvallysvalglulysglnvaltyrglnlys

930935940

pheglulysmetleuileasplysleuasntyrmetvalasplyslys

945950955960

serasnprocysalathrglyglyalaleulysglytyrglnilethr

965970975

asnlysphegluserphelyssermetserthrglnasnglypheile

980985990

phetyrileproalatrpleuthrserlysileaspproserthrgly

99510001005

phevalasnleuleulysthrlystyrthrserilealaaspser

101010151020

lyslyspheileserserpheaspargilemettyrvalproglu

102510301035

gluaspleuphegluphealaleuasptyrlysasnpheserarg

104010451050

thraspalaasptyrilelyslystrplysleutyrsertyrgly

105510601065

asnargileargilepheargasnprolyslysasnasnvalphe

107010751080

asptrpglugluvalcysleuthrseralatyrlysgluleuphe

108510901095

asnlystyrglyileasntyrglnglnglyaspileargalaleu

110011051110

leucysgluglnserasplysalaphetyrserserphemetala

111511201125

leumetserleumetleuglnmetargasnserilethrglyarg

113011351140

thraspvalasppheleuileserprovallysasnseraspgly

114511501155

ilephetyraspserargasntyrglualaglngluasnalaile

116011651170

leuprolysasnalaaspalaasnglyalatyrasnilealaarg

117511801185

lysvalleutrpalaileglyglnphelyslysalagluaspglu

119011951200

lysleuasplysvallysilealaileserasnlysglutrpleu

120512101215

glutyralaglnthrservallyshis

12201225

<210>58

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，正向引物1

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gcaataacagttacaccggaagccaatatg30

<210>59

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，正向引物2

<400>59

caggcaataacagttacaccggaagccaata31

<210>60

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，正向引物3

<400>60

tggtactggtcaggcaataacagttacaccg31

<210>61

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，正向引物4

<400>61

tacacacactggtactggtcaggcaataac30

<210>62

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，反向引物1

<400>62

atcacaactacagccataacctttccacat30

<210>63

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，反向引物2

<400>63

actacagccataacctttccacataccgcaga32

<210>64

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，反向引物3

<400>64

tcacaactacagccataacctttccacatac31

<210>65

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒orf1ab基因，等温扩增，反向引物4

<400>65

actacagccataacctttccacataccgca30

<210>66

<211>33

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，正向引物1

<400>66

atgtttgtttttcttgttttattgccactagtc33

<210>67

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，正向引物2

<400>67

agtgtgttaatcttacaaccagaactcaat30

<210>68

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，正向引物3

<400>68

aatcttacaaccagaactcaattaccccctgc32

<210>69

<211>33

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，正向引物4

<400>69

ctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaac33

<210>70

<211>30

<212>dna

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<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，反向引物1

<400>70

agtaccattggtcccagagacatgtatagc30

<210>71

<211>33

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，反向引物2

<400>71

atcaaacctcttagtaccattggtcccagagac33

<210>72

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，反向引物3

<400>72

gttatcaaacctcttagtaccattggtcccag32

<210>73

<211>33

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒s基因，等温扩增，反向引物4

<400>73

cttagtaccattggtcccagagacatgtatagc33

<210>74

<211>35

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，正向引物1

<400>74

ttcggaagagacaggtacgttaatagttaatagcg35

<210>75

<211>38

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，正向引物2

<400>75

tcgtttcggaagagacaggtacgttaatagttaatagc38

<210>76

<211>37

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，正向引物3

<400>76

tcggaagagacaggtacgttaatagttaatagcgtac37

<210>77

<211>37

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，正向引物4

<400>77

tcgtttcggaagagacaggtacgttaatagttaatag37

<210>78

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，反向引物1

<400>78

agaccagaagatcaggaactctagaagaat30

<210>79

<211>35

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，反向引物2

<400>79

tttagaccagaagatcaggaactctagaagaattc35

<210>80

<211>37

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，反向引物3

<400>80

tcaggaactctagaagaattcagatttttaacacgag37

<210>81

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒e基因，等温扩增，反向引物4

<400>81

agaccagaagatcaggaactctagaagaattc32

<210>82

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，正向引物1

<400>82

tcttgtaggcttgatgtggctcagctactt30

<210>83

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，正向引物2

<400>83

gtaggcttgatgtggctcagctacttcatt30

<210>84

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，正向引物3

<400>84

tacttcattgcttctttcagactgtttgcg30

<210>85

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，正向引物4

<400>85

gctacttcattgcttctttcagactgtttgcg32

<210>86

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，反向引物1

<400>86

tcacagctccgattacgagttcactttcta30

<210>87

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，反向引物2

<400>87

aggatcacagctccgattacgagttcactt30

<210>88

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，反向引物3

<400>88

gtgtccagcaatacgaagatgtccacgaag30

<210>89

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒m基因，等温扩增，反向引物4

<400>89

gtcctagatggtgtccagcaatacgaagatgt32

<210>90

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，正向引物1

<400>90

catggaagtcacaccttcgggaacgtggtt30

<210>91

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，正向引物2

<400>91

atggaagtcacaccttcgggaacgtggttg30

<210>92

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，正向引物3

<400>92

aagtcacaccttcgggaacgtggttgacct30

<210>93

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，正向引物4

<400>93

gaagtcacaccttcgggaacgtggttgaccta32

<210>94

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，反向引物1

<400>94

gtttcatcagccttcttctttttgtccttt30

<210>95

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，反向引物2

<400>95

ggctctgttggtgggaatgttttgtatgcg30

<210>96

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，反向引物3

<400>96

tcatcagccttcttctttttgtcctttttag31

<210>97

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>新型冠状病毒n基因，等温扩增，反向引物4

<400>97

cttctttttgtcctttttaggctctgttggtg32

<210>98

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>甲型流感病毒m基因，等温扩增，正向引物1

<400>98

atgagycttctaacygargtcgaaacgtacgttc34

<210>99

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>甲型流感病毒m基因，等温扩增，反向引物1

<400>99

cgtctacgctgcagtccycgctcactgggc30

<210>100

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>乙型流感病毒ha基因，等温扩增，正向引物1

<400>100

caygaaaaatacggtggattaaacaaaagc30

<210>101

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>乙型流感病毒ha基因，等温扩增，反向引物1

<400>101

cgtgccarcctgcaatcattccttcccatc30

<210>102

<211>3684

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>优化后的cas12a核酸序列

<400>102

atgagcaagctggaaaaatttaccaactgctacagcctgagcaagaccctgcgtttcaaa60

gcgatcccggttggcaagacccaggaaaacattgacaacaaacgtctgctggttgaggac120

gaaaagcgtgcggaggattataaaggtgtgaagaaactgctggatcgttactatctgagc180

tttatcaacgacgtgctgcacagcattaagctgaaaaacctgaacaactacatcagcctg240

ttccgtaagaaaacccgtaccgagaaggaaaacaaagagctggaaaacctggaaatcaac300

ctgcgtaaggagattgcgaaggcgttcaagggtaacgagggctacaagagcctgttcaag360

aaagatatcatcgaaaccatcctgccggagttcctggacgataaggacgaaattgcgctg420

gttaacagcttcaacggttttaccaccgcgttcaccggcttctttgataaccgtgagaac480

atgtttagcgaggaagcgaaaagcaccagcatcgcgttccgttgcattaacgaaaacctg540

acccgttacatcagcaacatggacattttcgagaaggttgacgcgatctttgataaacac600

gaggtgcaggaaatcaaggagaaaattctgaacagcgactatgatgttgaagatttcttt660

gagggtgaattctttaactttgttctgacccaagagggcatcgacgtgtacaacgcgatc720

attggtggcttcgtgaccgaaagcggcgagaagatcaaaggcctgaacgagtacattaac780

ctgtataaccagaagaccaaacaaaagctgccgaaatttaagccgctgtataagcaggtg840

ctgagcgatcgtgaaagcctgagcttctacggcgagggctataccagcgacgaggaagtt900

ctggaagtgtttcgtaacaccctgaacaaaaacagcgagatcttcagcagcattaagaaa960

ctggaaaagctgttcaaaaactttgacgagtacagcagcgcgggtatctttgttaagaac1020

ggcccggcgatcagcaccattagcaaagatatcttcggtgaatggaacgtgattcgtgac1080

aagtggaacgcggagtatgacgatatccacctgaagaaaaaggcggtggttaccgaaaag1140

tacgaggacgatcgtcgtaaaagcttcaaaaagattggcagctttagcctggaacagctg1200

caagagtacgcggacgcggatctgagcgtggttgaaaaactgaaggagatcattatccag1260

aaggttgatgaaatctacaaagtgtatggtagcagcgagaagctgttcgacgcggatttt1320

gttctggagaagagcctgaaaaagaacgacgcggtggttgcgatcatgaaggacctgctg1380

gatagcgtgaaaagcttcgaaaactacattaaggcgttctttggtgaaggcaaagagacc1440

aaccgtgacgagagcttctatggcgattttgttctggcgtacgacatcctgctgaaggtg1500

gaccacatctacgatgcgattcgtaactatgttacccaaaaaccgtacagcaaggataag1560

ttcaagctgtacttccagaacccgcaattcatgggtggctgggacaaggataaagagacc1620

gactatcgtgcgaccatcctgcgttacggtagcaagtactatctggcgattatggataaa1680

aagtacgcgaaatgcctgcagaagatcgacaaagacgatgttaacggtaactacgaaaag1740

atcaactacaagctgctgccgggcccgaacaagatgctgccgaaagtgttctttagcaaa1800

aagtggatggcgtactataacccgagcgaggacatccaaaagatctacaagaacggtacc1860

ttcaaaaagggcgatatgtttaacctgaacgactgccacaagctgatcgacttctttaaa1920

gatagcattagccgttatccgaagtggagcaacgcgtacgatttcaactttagcgagacc1980

gaaaagtataaagacatcgcgggtttttaccgtgaggttgaggaacagggctataaagtg2040

agcttcgaaagcgcgagcaagaaagaggtggataaactggtggaggaaggtaaactgtac2100

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