一种抑制胰腺癌进展的dCas9-sgLINC00261系统、构建方法及应用与流程

本发明涉及肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种抑制胰腺癌进展的dcas9-sglinc00261系统、构建方法及应用。

背景技术：

胰腺癌(pancreaticductaladenocarcinoma，pdac)是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，由于其起病隐匿，进展迅速，大多数患者在首诊时已出现局部浸润和远处转移，成为胰腺癌高死亡率的主要因素。有研究预测，到2030年胰腺癌将上升至恶性肿瘤致死原因的第2位。因此，探讨胰腺癌侵袭转移过程的相关分子机制，对提高胰腺癌诊治具有重要的理论指导意义和临床应用价值。

crispr/cas9是一种能够对任何物种基因组的特定位点进行精确编辑的技术。使用该技术能够进行细胞水平单基因或多基因敲除。其原理是核酸内切酶cas9蛋白通过导向性rna(guiderna，grna)识别特定基因组位点并对双链dna进行切割。dcas9蛋白是cas9蛋白的突变体，即cas9内切酶的ruvc1和hnh两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此，dcas9蛋白的内切酶活性全部消失，只保留由grna引导进入基因组的能力。crispr-dcas9系统提供了一个研究定点转录调控的平台，在这个平台中，dcas9主要是与其他效应蛋白融合(如gfp、转录因子、组蛋白修饰等)，进行基因调控、基因组成像、染色质或dna修饰以及染色质免疫沉淀等。最新研究发现，dcas9系统介导的靶向去甲基化治疗已经在癌症的研究中显示出良好的作用。针对关键抑癌基因的dcas9系统去甲基化治疗可能有助于pc的缓解。

近年来发现，长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)在肿瘤的发生发展过程具有重要作用，lncrna的表观遗传调控被认为是导致癌症进展的重要机制。研究表明lncrnas可在肿瘤进展中发挥抑癌作用，同时其中部分lncrnas可能由于其启动子区域的甲基化而丧失其抑癌能力。由于甲基化介导的lncrnas在pdac功能方面的研究尚未见报道，因此，利用靶向去甲基化技术激活lncrnas的抑癌潜力可能有助于探索胰腺癌的创新疗法并阐明相关分子调控机制，如表观遗传靶向药物的开发。因此，发明人在前期linc00261(geneid:140828)的研究基础上，研发了一种抑制胰腺癌进展的dcas9-sglinc00261系统、构建方法及应用。

技术实现要素：

基于以上问题，本发明提供一种抑制胰腺癌进展的dcas9-sglinc00261系统、构建方法及应用，本发明为胰腺癌新型靶向药物的研发和临床诊治提供了创新思路。

为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

dcas9-sglinc00261系统的构建方法，包括如下步骤：

s1：利用慢病毒构建稳转的crispr-dcas9细胞系，获得crispr-dcas9胰腺癌细胞；

s2：筛选linc00261的启动子区域的差异dna甲基化位点，针对筛选得到的差异dna甲基化位点构建sgrna慢病毒载体，将构建的sgrna慢病毒载体转染进入步骤s1中获得的crispr-dcas9胰腺癌细胞中，获得转染成功的dcas9-sglinc00261系统；

进一步的，步骤s2中筛选获得的linc00261的启动子区域的差异dna甲基化位点为cg12179011位点，cg12179011位点的基因序列为：cgcccagccagcagatgtcctgggcaaaaccaacaccagactcccctttg。

进一步的，步骤s2中构建的sgrna慢病毒载体中的差异位点是针对cg12179011位点构建的，针对差异dna甲基化位点cg12179011位点设计并构建了三个位点序列：sgrna1、sgrna2、sgrna3；sgrna1、sgrna2和sgrna3的基因序列分别为：

sgrna1：tttaggccagcgaggtcgtc；

sgrna2：accaaggccgacagcgcaaa；

sgrna3：gcccaggacatctgctggct。

为解决以上技术问题，本发明还提供了dcas9-sglinc00261系统在制备预防或检测或治疗胰腺癌的药物、标志物或试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次探索了linc00261的靶向去甲基化修饰在胰腺癌中的作用，丰富了胰腺癌的调控机制，具有创新性；本发明通过靶向去甲基化修饰抑癌基因linc00261，使其内源性表达量上升，提升其发挥抑制胰腺癌增殖和转移的能力，可为胰腺癌新型靶向药物研发和临床诊治提供创新思路。

附图说明

图1为本发明的实施例中的cg1279011甲基化位点的筛选，其甲基化水平与linc00261的表达水平以及与患者的不良预后的相关性实验结果图；

图2为本发明的实施例中的三种靶向cg1279011位点的sgrnas分布情况图；

图3为本发明的实施例中的dcas9-sglinc00261细胞系的流式分选及pcr验证实验结果图；

图4为本发明的实施例中评估载体在胰腺癌细胞系中的脱靶效应的实验结果图；

图5为本发明的实施例中的dcas9-sglinc00261系统的靶向去甲基化抑制胰腺癌增殖的实验结果图；

图6为本发明的实施例中的dcas9-sglinc00261系统的靶向去甲基化抑制胰腺癌肝转移的实验结果图；

图7为本发明的实施例中的dcas9-sglinc00261系统的靶向去甲基化修饰在胰腺癌中的信号分子表达情况结果图；

图8为本发明的dcas9-sglinc00261系统作用示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

dcas9-sglinc00261系统的构建方法，包括如下步骤：

s1：利用慢病毒构建稳转的crispr-dcas9胰腺癌细胞系；所述慢病毒实际元件顺序为ef1a-dcas9-tet1cd-cmv-egfp，相关步骤如下：

a.细胞铺板

将生长90％汇合的胰腺癌细胞(cfpac-1和panc-1细胞系)进行胰酶消化，制成细胞悬液，将细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6-well中，于37℃、5％co2的培养箱中培养；

b.目的细胞慢病毒感染

将步骤a中的细胞培养24h后，待细胞融合度达到约30％时，根据细胞的moi值(即感染复数值，胰腺癌不同细胞株的moi值不一样，panc-1的moi值为10，bxpc-3和cfpac-1moi值为50)情况加入适宜量的crispr-dcas9慢病毒载体，培养12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，则继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，则立即更换培养基；

c.经步骤b感染3天后，对于表达绿色荧光的慢病毒，通过流式细胞分选技术对感染成功的细胞进行分选，获得最终的crispr-dcas9胰腺癌细胞；

s2：筛选linc00261的启动子区域的差异dna甲基化位点，针对所述差异dna甲基化位点构建sgrna慢病毒载体，将构建的sgrna慢病毒载体转染进入步骤s1c中获得的crispr-dcas9胰腺癌细胞中，相关步骤如下：

(1)明确关键的linc00261的启动子区域的差异dna甲基化位点：前期通过甲基化芯片筛选并分析linc00261的启动子区域的差异dna甲基化位点，本实施例选取获得与胰腺癌患者的预后明显相关的甲基化位点(cg12179011,附图1a)，cg12179011位点的序列为：cgcccagccagcagatgtcctgggcaaaaccaacaccagactcccctttg；并用临床样本对cg12179011位点的甲基化修饰水平进行实验验证，同时评估cg12179011位点甲基化水平与linc002611的表达及临床患者的预后关系；本部分的实验结果见附图1b/c，结果显示：胰腺癌患者cg12179011的甲基化水平与linc00261的表达水平以及患者的不良预后相关；

(2)构建差异位点的sgrna慢病毒载体：针对步骤(1)中确定的关键甲基化位点cg12179011位点，发明人在其上下游的位置，根据结合能力和脱靶效应，设计并构建了3个位点序列：sgrna1、sgrna2、sgrna3，三种靶向cg12179011位点的sgrnas分布情况见附图2；sgrna1、sgrna2和sgrna3的基因序列分别为：

sgrna1：tttaggccagcgaggtcgtc；

sgrna2：accaaggccgacagcgcaaa；

sgrna3：gcccaggacatctgctggct；

针对靶基因序列，设计sgrna靶点序列，合成单链dnaoligo，其两端含酶切位点粘端，经退火处理形成双链dna，连入lenti-sgrna-tag载体(u6-sgrna-sv40-cherry)；将连接好的产物使用top10感受态转化，菌落pcr得到阳性克隆后测序，从而得到sgrna慢病毒载体；

(3)胰腺癌细胞系的sgrna转染：将构建的sgrna1-3和sgrna-nc慢病毒载体分别转染进入步骤s1c中获得的crispr-dcas9胰腺癌细胞系中，转染步骤同步骤s1中的步骤abc；通过流式细胞术对感染成功的阳性细胞进行分选，分选完成后继续培养细胞，获得转染成功的细胞：dcas9-sglinc00261细胞(dcas9-sgnc作为对照细胞)；

(4)确定载体的构建完成：将步骤(3)中获取的dcas9-sglinc00261细胞培养48h后，收集细胞并提取rna和dna，检测载体是否有靶向去甲基化修饰作用；利用q-pcr检测linc00261的表达情况，发现linc00261显著上调；进一步的甲基化测序发现靶向linc00261的dcas9系统，可以发挥去甲基化作用，可以精确特异地将靶基因linc00261的启动子cg12179011位点的甲基化水平降低，从而激活抑癌基因linc00261的表达；dcas9-sglinc00261细胞系的代表性流式分选及pcr验证结果见附图3；

(5)评估载体的脱靶效应：脱靶效应是任何基于cas9或者dcas9技术的实际应用中主要关注的问题，评估基于dcas9的去甲基化系统的脱靶效应是必要的；因此，发明人根据crisporweb工具(http://crispor.tefor.net/)选择了每个sgrna的前5位，共15个潜在的脱离靶点，以检测它们的转录水平mrna是否因crispr/dcas9的干扰或随机去甲基化修饰而改变；载体在胰腺癌细胞系中的脱靶效应结果显示载体是安全的，无明显脱靶效应；相关实验结果见附图4，；

s3：评估载体的抑癌作用：开展裸鼠皮下成瘤实验，验证crispr-dcas9-sglinc00261去甲基化系统对胰腺癌细胞cfpac-1的成瘤能力的影响；开展裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型，验证crispr-dcas9-sglinc00261去甲基化系统对胰腺癌细胞cfpac-1的原位肝转移能力的影响；动物实验发现转染后的胰腺癌细胞的皮下成瘤能力明显减弱，并且能够抑制胰腺肿瘤细胞的原位肝转移能力；基于dcas9-sglinc00261系统的靶向去甲基化抑制胰腺癌增殖的实验结果见附图5，基于dcas9-sglinc00261系统的靶向去甲基化抑制胰腺癌肝转移的实验结果见附图6。

基于dcas9-sglinc00261系统的靶向去甲基化修饰在胰腺癌中的信号分子表达情况的实验结果见附图7。

本实施例的dcas9-sglinc00261系统的作用示意图见附图8。

本实施例构建的dcas9-sglinc00261系统可应用于制备预防或检测或治疗胰腺癌的药物、标志物或试剂盒中。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>陆军军医大学

<120>一种抑制胰腺癌进展的dcas9-sglinc00261系统、构建方法及应用

<130>2020.07.19

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

cgcccagccagcagatgtcctgggcaaaaccaacaccagactcccctttg50

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tttaggccagcgaggtcgtc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

accaaggccgacagcgcaaa20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcccaggacatctgctggct20