一种抗衰老动物双歧杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，特别的为一种抗衰老动物双歧杆菌及其应用。

背景技术：

随着我国人口老龄化加剧，与衰老相关的疾病(帕金森，阿尔兹海默症，恶性肿瘤等)发病率不断上升，给国家及患者家属造成了沉重的经济负担。因此，寻找或开发抗衰老活性物质并探索其机制已成为当前应对人口老龄化问题的研究热点。尽管目前亦有多种药物如二甲双胍，白藜芦醇、雷帕霉素等被证实具有抗衰老作用，但由于成本高昂，提取困难，副作用较大等问题而未得到大范围推广。

越来越多的研究表明，益生菌在延缓人体衰老方面具有重要的作用。人体衰老过程中由于免疫力下降往往伴随着肠道菌群的恶性变化，肠道中革兰阴性菌和内毒素脂多糖(lps)释放增加导致全身慢性炎症，进而诱导多种疾病的发生。而补充益生菌可以调节肠道菌群的种类和数量,抑制致病菌感染肠道,维持肠道菌群结构稳定性，同时产生抗炎、抗氧化、改善肠道代谢等作用，从而提高机体免疫力，在一定程度上可以延缓衰老,增加寿命。

益生菌作为一种潜在的抗衰老物质，来源广泛，价格低廉且安全性高。尽管国内外微生物制剂有许多种，但普遍被用来治疗肠道性疾病如胃肠炎，便秘，腹泻等，很少用来治疗其他疾病。随着人们对自身健康的关注度不断提升和科学技术的不断进步，探索益生菌在人体非肠道疾病方面的应用具有重要的现实意义及经济价值。

技术实现要素：

本发明的目的在提供一种能够耐酸，耐胆盐，清除自由基，抗氧化，延缓衰老的动物双歧杆菌。

本发明的另一个目的在于提供所述动物双歧杆菌在抗氧化和延缓衰老方面的用途。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种抗衰老动物双歧杆菌及其应用，所述动物双歧杆菌株是从百岁老人粪便中分离得到，具有优秀耐酸、耐胆盐、抗氧化和抗炎能力。

优选地，所述动物双歧杆菌作为发酵菌种的应用。

优选地，所述动物双歧杆菌制备的发酵剂。

优选地，所述动物双歧杆菌发酵制备的发酵酸奶产品。

优选地，所述动物双歧杆菌制备的益生菌菌片。

优选地，所述动物双歧杆菌在抗衰老方面的应用。

本发明涉及的动物双歧杆菌菌株从百岁老人的粪便中分离得到。本该菌株经菌种测序分析，其序列如seqidno.1所示，将得到的序列经ncbi核酸序列对比，结果显示菌株为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)952。

本发明涉及的动物双歧杆菌在胃酸抵抗能力，dhhp自由基清除能力，抵抗机体炎症方面具有明显的优势。能够显著逆转d-半乳糖诱导的衰老小鼠焦虑样行为、不协调运动和记忆衰退，降低大脑炎症因子，提高肝脏超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性。

本发明涉及的动物双歧杆菌为益生菌产品的开发提供了基础。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明的动物双歧杆菌的耐酸测定结果；

图2为本发明的动物双歧杆菌的耐胆盐测定结果；

图3为本发明的动物双歧杆菌的抗氧化测定结果；

图4为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠爬杆实验结果；

图5为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠旷场实验结果；

图6为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠巴恩斯迷宫测试结果；

图7为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性的影响；

图8为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定；

图9为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠脑中il-6mrna水平的影响；

图10为本发明的动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导的衰老小鼠脑中tnf-αmrna水平的影响；

图11为本发明的pcr条件图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：动物双歧杆菌的获取及鉴定

一、动物双歧杆菌的获取及鉴定

百岁老人的粪便采用50％的甘油保存，以无菌磷酸盐缓冲液(pbs)做梯度稀释，选取3-5个合适梯度，吸取0.1ml于mrs培养基中进行划线分离，每个稀释梯度做两个重复。将培养皿放入37℃培养箱中厌氧培养48小时后挑选光滑、凸圆、边缘整齐、白色菌落镜检。对疑似菌落按上述步骤在mrs培养基中进行再次分离纯化，直到菌落完全纯化。将纯化的动物双歧杆菌连续传代3次，然后以50％甘油与菌液1：1混合保存于-80℃。

二、动物双歧杆菌的鉴定

将挑选的菌落连续培养后，取部分菌液离心，根据细菌基因组dna提取试剂盒说明书(天根生化，中国)提取dna，然后送于测序公司(上海生工，中国)进行16srdna序列扩增、纯化，然后测序。

动物双歧杆菌的16srdna的核苷酸序列为序列表中的序列1。

实施例2：动物双歧杆菌的耐酸实验

从-80℃超低温冰箱中取出动物双歧杆菌接种于mrs培养基中，37℃厌氧培养过夜，再按2％接种至新鲜mrs培养基中，37℃培养24h，用pbs缓冲液梯度稀释101，102，103，104，105倍，2500rpm离心4min，弃掉上清。加入ph为2、3、4、5、7的pbs缓冲液，放置4小时，混匀取10ul涂板，37℃培养箱厌氧培养过夜，活菌计数。

结果如图1所示，动物双歧杆菌能耐受ph＝3以上的pbs孵育，具有良好的耐酸能力。

实施例3：动物双歧杆菌的耐胆盐实验

预先配制胆盐浓度为0％、0.1％、0.2％、0.3％和0.5％胆盐的mrs液体培养基。将冻存的动物双歧杆菌接种于mrs培养基中，37℃厌氧培养过夜，再按2％分别接种于不同浓度的胆盐mrs培养基中培养24h，经pbs梯度稀释后震荡混匀，取10ul涂板，37℃培养箱厌氧培养过夜，活菌计数。

结果如图2所示，动物双歧杆菌在各浓度的胆盐培养基都能存活，表现出对胆盐良好的耐受能力。

实施例4：动物双歧杆菌的抗氧化实验

溶液配制：mrs液体培养基，去离子水，0.2mmol/ldpph甲醇溶液，2mmol/l硫酸亚铁溶液，6mmol/l过氧化氢溶液，6mmol/l水杨酸溶液，150mmol/lph＝8.0的tris-hcl溶液，1.2mmol/l邻苯三酚溶液，0.4％的硫酸亚铁溶液，1％的维生素c，0.2mol/l的氢氧化钠溶液，10％的三氯乙酸溶液，0.1％邻二氮菲溶液，ph＝6.6pbs冲液，1％铁氰化钾溶液，0.1％的三氯化铁溶液。

灭菌：对以上溶液进行高压蒸汽灭菌

活化：取100ul的动物双歧杆菌菌液加到装有5ml的mrs培养基的玻璃试剂管内，37℃培养箱培养过夜。第二天，离心，取上清液。

(1)dpph自由基清除能力的测定

取2ml的上清液加到玻璃试管内，再加2ml配制好的dpph甲醇溶液，黑暗下室温反应30min，离心取上清。另一根玻璃试管内加入2ml的去离子水和2ml的dpph甲醇溶液作为对照。517nm测od值。记录对照组和实验组数据。

dpph自由基清除率＝[1-a517(样品)/a517(空白)]×100％。

(2)羟基自由基清除能力

取1ml的细菌上清液加到玻璃试管内，加入1ml的硫酸亚铁溶液，1ml的过氧化氢溶液，1ml的水杨酸溶液，静置30min。另一根玻璃管内加入上述溶液，并加入1ml的去离子水。30min后，510nm处测吸光度。记录对照组和实验组数据。

羟基自由基清除率＝[1-a510(样品)/a510(空白)]×100％。

(3)超氧自由基清除能力

取0.5ml细菌上清液加到玻璃试管1号内，加入2ml的tris-hcl溶液，1ml邻苯三酚溶液，室温反应30min，2号试管加0.5ml的去离子水，1ml邻苯三酚和2ml的2mltris-hcl溶液，3号试管加1.5ml的去离子水，2mltris-hcl溶液，4号试管加1ml的去离子水，0.5ml细菌上清和2mltris-hcl溶液。

超氧自由基清除率＝[1-(a11-a10)/(a01-a00)]×100％

a00:不含样品和邻苯三酚(3)；a01：不含样品含邻苯三酚(2)；

a10：含样品不含邻苯三酚(4)；a11：含样品和邻苯三酚(1)。

(4)对亚铁离子的螯合能力

取0.5ml细菌上清液加到玻璃管内，加入0.1ml的硫酸亚铁溶液混合均匀，再加入0.1ml的维生素c和1ml的氢氧化钠溶液，37度烘箱内反应20min，然后加入三氯乙酸，离心去除蛋白，4℃条件下6000r离心10min。取0.4ml的上清，加入4ml邻二氮菲。另一根试管加0.5ml的水，其他相同。室温反应10min，536nm处测吸光度。记录对照组和实验组数据。

fe2+的螯合能力＝(a空白-a样/a空白)×100％。

(5)总还原力测定

取1ml的细菌上清液，加入1ml的磷酸缓冲液和1ml的铁氰化钾，混匀，50℃下保温2min，加入1ml的三氯乙酸，震荡混匀后取1ml的混合液，加入4ml的去离子水和0.4ml的三氯化铁溶液，静置10min。另一根试管加1ml的去离子水，其他加的试剂和处理情况相同。静置后拿去测吸光度，用去离子水作为空白。700nm测吸光度，记录对照组和实验组数据。

结果如图3所示，动物双歧杆菌具有优秀的抗氧化能力，尤其是在dpph自由基的清除率(96.28％)和总还原力(251.2μg/l)方面，对羟自由基、超氧自由基的清除率也能达到50％以上。

实施例5：动物双歧杆菌对d-半乳糖诱导小鼠延缓衰老的作用

一、实验菌株的制备

将动物双歧杆菌接种于mrs培养基，37℃厌氧培养过夜，按2％接种mrs培养基，继续37℃培养至od600＝0.6，3000rpm离心5min收集菌体，用无菌pbs清洗2次，再用含0.1％的明胶生理盐水重悬，调整菌数为1×109cfu/ml。

二、实验动物及分组治疗

balb/c小鼠(6周龄雄性)购自湖南斯莱克实验动物有限公司。将33只小鼠随机分为3组：对照组c组(n＝11)、模型组(n＝11)、动物双歧杆菌组(n＝11)。模型组和动物双歧杆菌组小鼠腹腔注射d-半乳糖(150mg/kg/d)，连续12周。同时，对照组和模型组灌胃生理盐水，动物双歧杆菌组灌胃1×109cfu/ml动物双歧杆菌。12周后，分别进行旷场实验、爬杆实验和巴恩斯迷宫实验，然后处死小鼠，收集肝脏和脑组织。

三、实验动物爬杆实验

爬杆实验被用来检测小鼠肢体运动协调性，各组小鼠于实验前3d进行行为训练(3～5min/次/d)。实验时，将小鼠面朝上放置在直径10mm、高55cm的粗木杆顶端，木杆上缠两层纱布以防打滑，正式实验时，记录小鼠爬完杆全长所需时间。

结果如图4所示，模型组小鼠运动迟缓，爬杆平均时长为9.0s，而服用动物双歧杆菌的小鼠运动迟缓明显减轻，爬杆平均时长为6.1s。

四、实验动物旷场实验

旷场实验被用来检测小鼠焦虑样行为。将每只小鼠置于(90cm×90cm×30cm)暗箱活动室驯化10min，然后使用activitymonitor视频跟踪软件测量小鼠行为参数10min(运动的总距离及停留中央区域的时间)。设备在每次运行后都要用75％乙醇清洁，以最大程度减少气味干扰。

结果如图5所示，模型组小鼠平均活动距离(2251cm)和在中心停留时间(41s)显著短于对照组(距离＝4217cm，时间＝89s)，而动物双歧杆菌治疗的小鼠焦虑样行为得到显著缓解，平均活动距离(3413cm)和在中心停留时间(67s)显著增加。

五、实验动物巴恩斯迷宫实验

巴恩斯迷宫被用来检测小鼠的空间学习记忆能力，测试是在一个明亮的，直径为1.0米的白色圆板上进行的，圆板周围有20个等间距的孔，一个17×13×7cm的黑色逃生盒位于其中一个洞的下面。实验开始前1天，将小鼠置于起跑室圆桶和逃生盒中适应3min，首先将动物置于迷宫中央的塑料圆桶(直径20cm，高27cm)内限制活动5s。然后移开圆桶，启动计时器，实验者在挡帘后进行观察。动物四肢均进入逃生盒，则计为一次逃避(escape),并让动物在箱内停留30s。在此期间如果动物仍然找不到逃生盒，则将引导动物从迷宫进入逃生盒内并停留30s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练两次，连续7d。记录每只小鼠到达逃生盒所需时间。

结果如图6所示，与对照组小鼠相比(40s)，模型组小鼠到达逃生盒所需时间显著增加(81s)，而动物双歧杆菌显著缩短了d-半乳糖诱导的衰老小鼠到达逃生盒所需时间(57s)，增强了小鼠空间学习记忆能力。

六、实验动物肝脏中超氧化物歧化酶活性测定

实验具体操作步骤根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。

测定结果如图7所示，与对照组小鼠相比(634umgprot-1)，模型组小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性显著降低(220umgprot-1)，而动物双歧杆菌显著增强了d-半乳糖诱导小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性(504umgprot-1)。

七、实验动物肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定

实验具体操作步骤根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。

测定结果如图8所示，与对照组小鼠相比(63.2ul-1)，模型组小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性显著降低(38.5ul-1)，而动物双歧杆菌显著增强了d-半乳糖诱导小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性(53.7ul-1)。

八、实验动物脑组织中炎症因子测定

1.脑组织rna的提取

(1)将脑组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用trizol体积的10％，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞，在室温15～30℃下放置5min；

(2)以每1mltrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s，在室温下放置2～3min；

(3)12000rpm，4℃，离心15min；

(4)取上层水相于一新的离心管，按每1mltrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min；

(5)12000rpm，4℃，离心15min；

(6)弃去上清液，按每1mltrizol液加入1ml的75％乙醇进行洗涤，涡旋混匀，12000rpm，4℃，离心15min，重复两次；

(7)弃去上清液，让沉淀的rna在室温下自然干燥或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会使rna失去溶解性，导致a260/280<1.6；

(8)加适量rnase-freewater溶解rna沉淀，用枪头反复吸取混匀；

(9)65℃水浴15min，保存于-80℃备用；

(10)紫外吸收法测定rna浓度和纯度。

2.realtimepcr：

根据takara逆转录及实时定量荧光试剂盒说明书进行rna的实时定量荧光测定。

pcr条件：如图11所示：

表1，引物名称和引物序列表

3.结果如图9-10所示，与对照组小鼠相比(tnf-α，0.91；il-1β，0.99)，模型组小鼠脑组织中炎症因子tnf-α(1.62)和il-1β(1.96)表达水平显著增加，而动物双歧杆菌逆转了d-半乳糖诱导的小鼠脑组织中炎性因子表达水平(tnf-α，1.23；il-1β，1.60)。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。