一种肿瘤细胞的荧光成像方法与流程

本发明涉及肿瘤细胞的荧光成像，具体涉及一种肿瘤细胞内透明质酸酶haase的荧光成像方法，属于光电化学生物传感分析及生物医学临床诊断领域。

背景技术：

膀胱癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均占泌尿生殖系统肿瘤的首位。由于传统的膀胱癌临床诊断方法多以膀胱镜检查为主，不但存在创伤和痛苦，对于临床早期诊断也明显不足。据报道，透明质酸酶haase与许多恶性肿瘤密切相关，该酶是由frost在1997年首先分离纯化得到。研究表明，haase的表达水平在癌细胞中大大增加，而在正常细胞中的分布较少。特别是，haase浓度在膀胱癌患者的尿液中显著增高，使其成为膀胱癌早期诊断与治疗的重要生物标志物之一。作为一种膀胱癌肿瘤标志物，haase具备蛋白水解酶的特性，能够通过特异性地切割透明质酸ha结构内部β-n-乙酰基-d-葡萄糖胺键来降解ha。除此之外，haase还与广泛的生理和病理过程有关，包括受精、胚胎发生、炎症和肿瘤生长，除膀胱癌之外，其过表达已被报道与许多恶性肿瘤相关，包括前列腺癌、脑癌、结肠癌等多种癌症，日益成为一种重要的肿瘤标志物而得到广泛关注和研究。因此，开发灵敏检测haase的技术对于肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。但是，传统的检测方法，例如粘度测定法，比浊法，比色法和酶谱法等通常缺乏灵敏度和选择性。而免疫测定法因其昂贵的抗体和繁琐的检测步骤限制了它的实际应用。与其他方法相比，荧光检测技术因其具有操作简便、灵敏度高、实时监测能力强、适合于高通量检测等优点得到广泛研究。因此，为了克服传统技术的缺点和不足，迫切需要开发出既无创伤、无痛苦、又简单、灵敏、特异及准确度高的荧光检测方法来满足生物医疗领域对膀胱癌等多种相关癌症的早期诊断及早期治疗的需求。

本发明根据haase能够特异性地切割并降解ha的这一特性，利用ha作为生物识别分子，采用细胞毒性低、生物相容性好的金纳米材料载带信号分子，通过表面组装将生物识别分子与载有信号分子的纳米载体组装为一体，构建形成具有生物识别作用的荧光纳米金复合材料。为了获得比传统技术更高的灵敏度和特异性，本发明采用具有特殊结构的多孔金纳米材料用于荧光信号分子的载带，即将信号分子负载于空心金纳米材料中，为了抑制信号分子的泄露而产生假阳性信号，通过简单有效的表面修饰技术将生物识别分子组装到纳米材料表面，使得纳米金表面被生物识别分子包被，起到分子锁的作用，有效抑制了信号分子的泄露，从而构建获得了基于haase-ha生物识别作用的荧光纳米复合材料。利用构建获得的荧光纳米复合材料，可实现对haase的高灵敏检测及肿瘤细胞的荧光成像。

基于该检测机理，不但实现了生物识别分子对于靶标的特异性识别和响应，释放出大量的信号分子从而获得显著增强的荧光信号，而且由于haase的特性，靶标可以被循环利用，因此，即便很微量的haase，也能够通过不断地剪切-循环-再剪切的循环方式打开更多的分子锁，不断释放出更多的信号分子，使荧光信号呈指数型增强，最终实现靶标的超灵敏检测。在该体系中，荧光信号的循环放大无需外加生物酶进行催化，而靶标分子haase通过与ha构建的分子锁发生生物识别作用的同时就可以依靠自身启动催化循环反应，使更多的分子锁被打开，不断释放出大量的信号分子，因此，该体系的检测策略是基于生物识别的自催化反应，使haase得到循环利用，最终使检测信号得到循环放大，为haase的高灵敏检测提供了特异、高效的自催化循环放大检测技术。迄今为止，利用空心金纳米材料构建基于haase-ha生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于haase细胞荧光成像及检测的文献还未见报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的不足，针对基于haase-ha生物识别作用、利用空心金纳米材料负载信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应用于haase细胞荧光成像及检测的技术未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的基于haase-ha生物识别作用、利用空心金纳米材料载带信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应、用于haase细胞荧光成像及检测的纳米复合材料，具体是利用空心金纳米材料负载信号分子，通过表面修饰技术将生物识别分子组装到多孔的空心金纳米材料表面，形成生物分子锁。该分子锁一方面能够封锁孔口，起到防止纳米材料内部负载的信号分子的泄漏作用，另一方面能够在靶标存在时，与靶标发生特异性地识别反应而被剪切，使封闭信号分子的分子锁被打开，导致大量的信号分子被释放出来，通过对增强的荧光信号的检测实现对靶标haase的活性检测。在本发明中，由于haase的特性，靶标可以被循环利用，因此，即便很微量的haase，也能够通过不断地剪切-循环-再剪切的循环往复的方式打开更多的分子锁，结果释放出更多的信号分子，使荧光信号呈指数型增强，最终实现对靶标的超灵敏检测。正是由于靶标的自催化循环放大作用，使检测体系得到优化和改进，避免了传统方法依赖各种外加工具酶产生催化循环放大作用提高检测灵敏度，这对活体、细胞检测及应用具有重要意义。本发明带来的优点是，最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有潜在的应用价值；本发明的第二目的：提供一种基于haase-ha生物识别作用、利用空心金纳米材料负载信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应的纳米复合材料的制备方法；本发明的第三目的：提供一种利用空心的金纳米材料构建基于haase-ha生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于肿瘤细胞内haase的荧光成像方法。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的基于haase-ha生物识别作用、利用空心金纳米材料负载信号分子进行靶循环-自催化循环放大反应的纳米复合材料，不但能够显著提高检测灵敏度，还可以实现细胞成像等活体研究。具体是利用空心金纳米载体的特殊结构，在其内部载带大量信号分子；为了防止信号分子的泄露，通过表面修饰技术将haase的生物识别分子ha组装到多孔的空心金纳米材料表面，构建形成生物分子锁。该分子锁一方面能够封锁孔口，起到防止纳米材料内部载带的信号分子的泄漏作用，另一方面能够在靶标物质haase存在时，与靶标发生特异性地识别反应而被剪切和降解，降解后的ha从载体表面脱落，使封闭信号分子的分子锁被打开，导致大量的信号分子被释放出来，产生增强的荧光信号，通过检测增强的荧光信号实现对靶标haase的活性检测。在本发明中，由于ha构建的分子锁可被haase特异性地识别而被剪切、降解，因此，每个靶标分子可以被循环利用，即便很微量的haase，也能够通过不断地剪切-循环-再剪切的循环往复的方式打开更多的分子锁，使荧光信号呈指数型增强，最终实现对靶标的超灵敏检测。正是由于靶标的自催化循环放大作用，使检测体系得到优化和改进，无需任何外部条件如温度、激光照射等刺激，避免了传统方法依赖各种外加工具酶而产生催化循环放大作用，这对活体、细胞检测及应用尤其具有重要意义，特别是可以省略工具酶的使用而获得信号的循环放大效果。本发明的优点是，最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有潜在的应用价值。

为了降低空白信号，达到最佳的封锁效果，通过实验探索，本发明最终通过两端分别带有氨基和巯基的聚乙二醇nh2-peg-sh的共价连接作用在载体表面进行分子锁的构建，不但简化了组装过程，而且获得了最佳的封堵效果。组装的分子锁仅对靶标分子haase具有生物识别作用，产生特异性的响应，使ha的结构被haase破环后从载体表面降解脱落，导致分子锁被打开，产生增强的荧光信号。除此之外，分子锁对其它物质如nacl、kcl、l-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖或牛血清白蛋白均没有响应，具有优良的选择性和特异性。当加入不同浓度的haase时，荧光信号的增强与加入haase的浓度存在强的相关性。因此，根据测得的荧光信号强度就可以实现对haase的活性检测。本发明通过实验选择荧光染料罗丹明b作为信号分子，使检测性能表现出荧光强、stokes位移大、溶解性好、光学性质稳定、信噪比高、无光漂白、生物相容性好、受环境影响小等优良性能。结果表明，该检测体系能够获得远高于传统技术的灵敏度，最重要的是，本发明提出的检测体系不但可以进行特异性的生物识别，而且由于体系的自催化循环放大特性，无需任何外加工具酶、无需任何外部条件刺激就可以产生信号的循环放大，为活体及细胞成像等应用提供了新的方法和技术。

一种制备本发明提出的用于细胞内haase荧光成像的、基于haase-ha生物识别作用、利用空心金纳米材料载带信号分子进行自催化循环放大反应的纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)在200μl空心金纳米载体溶液中加入2μl终浓度为1.0×10^-5mol/l的rhb溶液，37℃摇床反应12.0h，离心、清洗后保存备用；

(2)在0.5ml100mg/mlha水溶液中加入200μl13mg/ml羰基二咪唑的dmf溶液，室温反应2.0h后，加入100μl含有25mgnh2-peg-sh的水溶液和10μl三甲胺溶液，搅拌过夜；

(3)经透析膜纯化，冷冻干燥后制得复合物ha-peg-sh；

(4)将0.5ml2.4mg/mlha-peg-sh的水溶液加入到步骤(1)制得的纳米载体复合物中，常温搅拌2.0h；

(5)离心、清洗，最终制得本发明用于肿瘤细胞内haase的荧光成像的纳米复合材料。

本发明的有益效果：本发明提出的纳米复合材料，为haase的高灵敏检测提供了特异、高效的自催化循环放大检测技术，可以对靶标物质haase进行高灵敏和高特异性的检测，能够用于肿瘤细胞内haase的荧光成像。与传统技术相比，无需任何外部条件如温度、激光照射等刺激，避免了传统方法依赖各种外加工具酶而产生催化循环放大作用，这对活体、细胞检测及应用尤为重要。本发明的优点在于：不但使检测体系得到优化和改进，而且，最大程度地提高了检测灵敏度、简化了检测过程、降低了检测成本、拓宽了应用领域，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，尤为重要的是，本发明无需采用任何工具酶就能获得信号的循环放大效果，在体内外检测、活体及细胞成像等领域发挥潜在的应用价值，同时，也为活体及细胞成像等应用提供新的方法和技术。

本发明提出的用于细胞内haase荧光成像的纳米复合材料具有高效、灵敏、结构简单、易制备、性能优异、稳定、细胞毒性低、生物相容性好、适用范围广等优点，并且不会受到其它物质如nacl、kcl、l-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖或牛血清白蛋白的影响，表现出高的特异性和选择性。实验结果表明，采用本发明提出的纳米复合材料检测haase，不但显示了远高于文献值的灵敏度和优异的选择性，而且，还获得了更宽的线性检测范围；其中，在低浓度检测区间0.005-1.00u/ml，haase的浓度与荧光强度比值f/f0的线性方程为f/f0＝1.00+6.70×chaase(u/ml)，线性相关系数为0.9984，检测限为0.0042u/ml(s/n＝3)；在高浓度检测区间20.00-100.00u/ml，haase的浓度与荧光强度比值f/f0的线性方程为f/f0＝8.80+0.04×chaase(u/ml)，线性相关系数为0.9906；f为荧光强度，f0为荧光空白值。

与文献值相比，不但灵敏度得到显著提高，而且，还获得了包括低浓度区和高浓度区在内的、更宽的线性检测范围，能够很好地满足对常量及微量样品的高灵敏检测。可以预见，本发明提出的纳米复合材料及其制备方法和检测技术在体内外检测、活体及细胞成像等领域具有广阔的应用前景，为重大疾病的早期诊断与治疗发挥重要作用。

附图说明

图1.hela细胞的荧光显微成像图。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：thz-82a气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；f-4600荧光分光光度计(日立，日本)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)；tdl-40b4000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂)；tgl-16b10000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂)；sciewtz-10n冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)；leicatcssp5ii激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。

实验试剂：罗丹明b(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；3-4μm巯基磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；乙烯吡咯烷酮k-30(pvp，中国国药化学公司)；pbs缓冲溶液(ph＝7.4)；透明质酸(ha，青岛云山生物科技有限公司)；羰基二咪唑(cdi，青岛云山生物科技有限公司)；nh2-peg-sh(华腾制药有限公司)；三甲胺(青岛云山生物科技有限公司)；透明质酸酶(haase，青岛云山生物科技有限公司)；4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，青岛云山生物科技有限公司)；健康人、膀胱癌病人尿液(高密市人民医院)；hela细胞(青岛大学)；二次水等，所用试剂均为分析纯。

实施例1：

一种制备本发明提出的用于细胞内haase荧光成像的、基于haase-ha生物识别作用、利用空心金纳米材料载带信号分子进行自催化循环放大反应的纳米复合材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)在200μl空心金纳米载体溶液中加入2μl终浓度为1.0×10^-5mol/l的rhb溶液，37℃摇床反应12.0h，离心、清洗后保存备用；

(2)在0.5ml100mg/mlha水溶液中加入200μl13mg/ml羰基二咪唑的dmf溶液，室温反应2.0h后，加入100μl含有25mgnh2-peg-sh的水溶液和10μl三甲胺溶液，搅拌过夜；

(3)经透析膜纯化，冷冻干燥后制得复合物ha-peg-sh；

(4)将0.5ml2.4mg/mlha-peg-sh的水溶液加入到步骤(1)制得的纳米载体复合物中，常温搅拌2.0h；

(5)离心、清洗，最终制得本发明用于肿瘤细胞内haase的荧光成像的纳米复合材料；

所述的空心金纳米载体按文献方法获得(sun,y.；xia,y.science2002,298,2176.)。

实施例2:

一种采用本发明提出的利用空心金纳米载体构建基于haase-ha生物识别作用的纳米复合材料进行自催化循环放大反应用于肿瘤细胞内haase的荧光成像方法，包括如下步骤：

(1)将实施例1中制得的纳米复合材料的pbs稀释液加入到已经培养好的hela细胞的培养皿中，37℃孵育2.0h；

(2)作为对照实验，将另一份hela细胞提前用0.02g/mlhaase抑制剂4-甲基伞形酮孵育2.0h后进行相同实验；

(3)将实验组与对照组做激光共聚焦扫描成像，激发波长选择559nm，发射波长为580-630nm。

由图1a，b可见，与纳米复合材料孵育后的hela细胞中的荧光信号清晰可见，表明本发明制备的纳米复合材料成功进入活细胞，在没有任何外部条件刺激、无需对细胞载入任何工具酶的情况下对hela细胞内的haase产生响应，通过自催化的循环放大反应释放出大量荧光分子。作为对照，经抑制剂4-甲基伞形酮提前孵育过的hela细胞中仅观察到很弱的荧光信号(c，d)，表明细胞中的haase活性被抑制，无法降解载体表面的ha，荧光分子最终没有得到释放。细胞成像结果表明，基于haase-ha生物识别作用及自催化循环放大策略构建的纳米复合材料在没有任何外部刺激的条件下对细胞内的生物分子产生响应，尤为重要的是，本发明无需对细胞载入任何工具酶就能获得信号的循环放大效果，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，为体内外检测、活体及细胞成像等领域提供新的技术和方法。