一种小分子活性化合物及其抗体偶联物、其制备方法和医药用途与流程

[0001]
本发明属于医药技术领域，具体涉及小分子生物活性化合物与抗体的偶联物，及其用于预防和/或治疗肿瘤，自身免疫性疾病，代谢等相关疾病中的用途。


背景技术：

[0002]
抗体-药物偶联物(adc)融合了抗体的靶向作用和生物活性分子的活性，抗体引导adc结合到靶细胞，随后释放生物活性药物分子或被细胞内化，释放药物，治疗疾病。由于抗体对肿瘤或相关疾病靶点具有特异性和靶向性，其应用价值不仅体现在治疗方面，同时还成为药物靶向输送的理想载体，降低了药物的副作用。
[0003]
目前，已经上市的adc有四种：mylotarg(gemtuzumab ozogamicin，吉妥珠单抗奥唑米星)，adcetris(brentuximab vedotin，cd30单抗-mmae)，kadcyla (trastuzumab emtansine，曲妥珠单抗-美登素生物碱)和besponsa(inotuzumabozogamicin，cd22单抗-卡奇霉素)。
[0004]
抗体药物偶联物一般由抗体(mab)、连接子(linker)和药物(payload) 三部分组成。通常，adc中抗体和小分子药物通过两种方式偶联：
[0005]
1.通过赖氨酸的ε-氨基与连接体的活化羧基反应，形成酰胺键，如已上市 adc药物mylotarg，kadcyla和besponsa。这种偶联方式由于存在太多的不同赖氨酸的ε-氨基，往往产生复杂的混合物，混合物中不同组成的adc分子的亲和力不同，药效难以保证，毒性大。同时此类酰胺键，在体内酶的作用下，易发生水解，导致生物活性分子与抗体在未达到靶细胞时即发生脱落，在丧失adc的靶向性的同时，增加毒性。
[0006]
2.抗体半胱氨酸的巯基，都是以二硫键的形式存在。打开抗体中的二硫键，可以提供多个自由的巯基作为偶联位点。与抗体巯基进行偶联，一种方法是抗体上自由的巯基与马来酰亚胺发生michael加成反应，如adcetris。但有较多文献报道，通过巯基michael加成方法得到的adc会在体循环中发生逆michael加成，由此产生的马来酰亚胺可以和体内很多蛋白或体内含巯基小分子物质再发生 michael加成反应，不但降低adc的有效率，同时还会产生毒性反应(markfrigerio,current topics in medicinal chemistry,2017,17,3393-3424)(式1)。
[0007][0008]
式1
[0009]
在专利wo2016142049中，公开了以鹅膏毒素为生物活性分子，包含甲磺酰基取代的苯联噁二唑结构的生物活性分子和连接子结构，但与抗体偶联内容无具体描述。


技术实现要素：

[0010]
通过深入研究，本发明人发现了一类如式2所示的新颖抗体和小分子的偶联方式。本发明发现了一种新的如式(i)所示的linker-payloads，这种linker一方面能有效的和抗体的巯基(sh，由抗体经还原得到)进行偶联。另一方面，由这种新的偶联方式生成的新的偶联物式(ii)化合物具有很高的化学稳定性，阻止adc中毒素脱落而产生的毒副作用。所述偶联方式具有极高的偶联效率(90％) 和高的载药量(dar值为6-8)，本发明即是基于以上发现而完成。
[0011]
式2
[0012][0013]
本发明一个方面提供式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0014][0015]
其中：
[0016]
r1选自烷基、环烷基、芳基或杂芳基，所述烷基、环烷基、芳基和杂芳基，任选地可以被下列一个或多个相同或不同的取代基取代：氘、卤素、氰基、硝基、氨基、羟烷基、烷氧基烷基或烷氧基；
[0017]
m1和m2独立地选自n或cr
a
；
[0018]
r
a
选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、氨基、烷基、烷氧基、羟烷基、卤代烷基、卤代烷氧基或卤代羟烷基；
[0019]
环a选自环烷基，或者含有1-6个选自o、s、so、so2、n或p杂原子的杂环基，所述环烷基和杂环基，任选可以被一个或多个下列取代基取代：氘、卤素、氧代基、-oh、-nr2r3、r2r3n-烷基-、烷基、芳基、杂芳基、氰基、硝基、叠氮基、烷基砜基、烷基亚砜基、-(ch2)
k
coo(ch2)
s
ch3、羰基烷氧基、
ꢀ-
c(＝o)nr2r3，-s(＝o)2nr2r3或-(ch2)
s
co2h；
[0020]
r2和r3各自独立地选自氢、氘、烷基、芳基或杂芳基，所述烷基、芳基和杂芳基，任选地可以被一个或多个下列取代基取代：氘、卤素、羟基、氰基、硝基、叠氮基、烷基砜基、烷基亚砜基、酯基或烷氧基羰基；
[0021]
l1选自键、氧原子、硫原子、炔基、-o(ch2)
k
c(o)-、-(ch2)
k
(och2ch2)
u
(ch2)
s-、芳基、杂芳基、杂环基、-nh(ch2)
k
chr4c(o)-、-o(ch2)
k
chr4c(o)-、
ꢀ-
s(ch2)
k
chr4c(o)-、-(ch2)
k
c(o)nr
2-、-(ch2)
k
r2c＝cr2(ch2)
s-、
ꢀ-
nhc(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-c(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-(chr2r3)
t-、
或它们的任意组合；
[0022]
l2选自键、氧原子、硫原子、炔基、-o(ch2)
k
c(o)-、-(ch2)
k
(och2ch2)
u
(ch2)
s-、芳基、杂芳基、杂环基、-nh(ch2)
k
chr4c(o)-、-o(ch2)
k
chr4c(o)-、
ꢀ-
s(ch2)
k
chr4c(o)-、-(ch2)
k
c(o)nr
2-、-(ch2)
k
r2c＝cr2(ch2)
s-、
ꢀ-
nhc(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-c(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-(chr2r3)
t-、、或它们的任意组合，
[0023]
l3选自键、氧原子、硫原子、炔基、-c(o)-、-o(ch2)
k
c(o)-、
ꢀ-
(ch2)
k
(och2ch2)
u
(ch2)
s-、芳基、杂芳基、杂环基、-nh(ch2)
k
chr4c(o)-、
ꢀ-
o(ch2)
k
chr4c(o)-、-s(ch2)
k
chr4c(o)-、-(ch2)
k
c(o)nr
2-、
ꢀ-
(ch2)
k
r2c＝cr2(ch2)
s-、-nhc(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-c(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、
ꢀ-
(chr2r3)
t-、、或它们的任意组合；
[0024]
l4选自键、氧原子、硫原子、炔基、-o(ch2)
k
c(o)-、-(ch2)
k
(och2ch2)
u
(ch2)
s-、芳基、杂芳基、杂环基、-nh(ch2)
k
chr4c(o)-、-o(ch2)
k
chr4c(o)-、
ꢀ-
s(ch2)
k
chr4c(o)-、-(ch2)
k
c(o)nr
2-、-(ch2)
k
r2c＝cr2(ch2)
s-、
ꢀ-
nhc(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-c(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-c(o)-、-(chr2r3)
t-、
或它们的任意组合；
[0025]
l5选自键、氧原子、硫原子、炔基、-o(ch2)
k
c(o)-、-(ch2)
k
(och2ch2)
u
(ch2)
s-、芳基、杂芳基、杂环基、-nh(ch2)
k
chr4c(o)-、-o(ch2)
k
chr4c(o)-、
ꢀ-
s(ch2)
k
chr4c(o)-、-(ch2)
k
c(o)nr
2-、-(ch2)
k
r2c＝cr2(ch2)
s-、
ꢀ-
nhc(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-c(o)(ch2)
k
o(ch2)
s
c(o)-、-(chr2r3)
t-、、或它们的任意组合；
[0026]
r4选自天然或非天然氨基酸残基、烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，所述烷基、芳基烷基和杂芳基烷基，任选地可以被1-3个卤素、氨基、脲基、羟基、co2h 或烷基所取代；
[0027]
m、n，p，q，r，u和t各自独立地选自0-20的整数；可选地m、n、p、q、r不同时为0；
[0028]
k和s各自独立地选自0-10的整数；
[0029]
d为毒素或药物活性分子。
[0030]
在本发明优选的方案中，提供一种式(ii)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0031][0032]
其中：
[0033]
r1选自c
1-8
烷基、c
3-8
环烷基、c
6-10
芳基或3-10元杂芳基，所述烷基、芳基和杂芳基，任选地可以被下列一个或多个相同或不同的取代基取代：氘、卤素、氰基、硝基、c
1-8
烷氧基烷基或c
1-8
烷氧基；优选的，r1为c
1-4
烷基，更优选为甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。
[0034]
环a选自5-12元碳环，优选5-8元碳环，或者含有1-3个选自o、s、n、p 杂原子的杂
环，所述碳环和杂环，任选可以被一个或多个下列取代基取代：氘、卤素，氧代基(和环碳形成羰基，或者和环硫原子形成so或so2)、-oh、-nr2r3、 r2r3n-烷基-、c
1-10
烷基、c
6-10
芳基、c
1-5
杂芳基、氰基、硝基、叠氮基、c
1-8
烷基砜基、c
1-8
烷基亚砜基、酯基、c
1-8
烷氧基羰基、-c(＝o)nr2r3、-s(＝o)2nr2r3、 co2h或c
1-8
烷基羧基；
[0035]
r2和r3各自独立地选自氢，氘，c
1-8
烷基，c
6-10
芳基或3至10元杂芳基，所述烷基，芳基和杂芳基可以被一个或多个下列取代基取代：氘，卤素，羟基，氰基，硝基，叠氮基，c
1-8
烷基砜基，c
1-8
烷基亚砜基，酯基或c
1-8
烷氧基羰基。
[0036]
优选地，r2和r3各自独立地自氢，氘，c
1-4
烷基，c
6-10
芳基或5至7元杂芳基，所述烷基，芳基和杂芳基可以被一个或多个下列取代基取代：氘，卤素，羟基，氰基，硝基，叠氮基，c
1-4
烷基砜基，c
1-4
烷基亚砜基，酯基或c
1-4
烷氧基羰基。
[0037]
l1选自键、氧原子、硫原子、-o(ch2)
k
c(o)-、、、、或它们的任意组合。
[0038]
l2选自键、氧原子、硫原子、-o(ch2)
k
c(o)-、
或它们的任意组合。
[0039]
l3选自键、氧原子、硫原子、-c(o)-、-o(ch2)
k
c(o)-、、、、或它们的任意组合。
[0040]
l4选自键、氧原子、硫原子、-o(ch2)
k
c(o)-、
或它们的任意组合。
[0041]
l5选自键、氧原子、硫原子、-o(ch2)
k
c(o)-、、、、或它们的任意组合。
[0042]
其中，r4选自天然或非天然氨基酸残基，c
1-8
烷基，c
6-10
芳基c
1-8
烷基或 c
3-10
杂芳基c
1-8
烷基，所述c
1-6
烷基，c
6-10
芳基c
1-8
烷基和c
3-10
杂芳基c
1-8
烷基，任选地可以被1-3个卤素、氨基、脲基、羟基、-co2h或c
1-8
烷基取代；
[0043]
优选地，所述r4选自天然及非天然氨基酸残基，c
1-4
烷基，c
6-10
芳基c
1-4
烷基，5-7元
杂芳基c
1-4
烷基。所述c
1-6
烷基，c
6-10
芳基c
1-4
烷基和5-7元杂芳基c
1-4
烷基可以被1-3个卤素，氨基，脲基，羟基，-co2h或c
1-4
烷基取代。
[0044]
m、n、p、q、r、u和t各自独立地选自0-20的整数，优选0-10的整数。
[0045]
d为毒素或药物活性分子，包括，但不限于：auristatin衍生物，maystasionoids 衍生物，dna破坏剂，amanitins，拓扑异构酶抑制剂，喜树碱衍生物，选择性或非选择性激酶抑制剂，bcl-xl抑制剂和bcl-2/bcl-xl抑制剂；优选：
[0046][0047][0048]
作为优选的方案，环a选自5元或6元杂环，所述杂环优选至少包含一个n 原子；进
一步优选地所述杂环被氧代，与杂环的环碳形成羰基，或者当杂环包含s原子时，与环硫原子形成so或so2，例如，环a可以选自以下结构：
[0049][0050]
在本发明优选的方案中，提供一种式(ii-b)、(ii-c)、(ii-d)、(ii-e)、(ii-f) 和(ii-g)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0051][0052]
在本发明一种优选的实施方式中，l1选自氧原子、
[0053]
u、t独立选自0-10的整数；优选地，r2和r3为氢。
[0054]
在本发明一种优选的实施方式中，l2选自键、选自键、
[0055]
t独立地选自0-10的整数。
[0056]
在本发明一种优选的实施方式中，l3选自键、选自键、
[0057]
在本发明一种优选的实施方式中，l4选自键、、
[0058]
在本发明一种优选的实施方式中，l5选自键、、
[0059]
在本发明优选的方案中，提供一种式(ii)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0060]
[0061]
在本发明一种优选的实施方式中，d选自
[0062]
其中，r5选自氢、优选氢、优选氢、
[0063]
r6选自氢或c
1-6
烷基；优选氢、甲基或乙基；
[0064]
m3选自c＝o或so2；
[0065]
n1为0、1、2或3；优选1或2。
[0066]
在一些优势方案中，所述化合物选自：
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072][0073]
本发明的另一方面在于提供由式(i)化合物或其盐和抗体偶联得到的式(iii) 所示的抗体药物偶联化合物或其药学上可接受的盐，
[0074][0075]
式iii中a环，l1，l2，l3，l4，l5，m，n，p，q，r，u、t如前所述，mab 代表抗体或小分子配体。
[0076]
在本发明优选的方案中，提供一种式(iii-a)所示抗体药物偶联化合物或其药学上可接受的盐，
[0077][0078]
其中：
[0079]
mab为抗体或小分子配体；
[0080]
l是接头单元，优选键、硫或
[0081]
y表示药物抗体比值(dar)的平均值，为2～12，可以为整数或小数；优选4～6。
[0082]
在本发明优选的方案中，所述化合物或其可药用盐的抗体药物偶联物，式 (iii-a)进一步如式(iii-b)所示：
[0083][0084]
其中：
[0085]
mab为抗体，选自利妥昔单抗rituximab、替伊莫单抗ibritumomab tiuxetan、托西莫单抗tositumomab、本妥昔单抗brentuximab、阿仑单抗alemtuzumab、阿达木单抗
krt33a、kiss1r、ifng、igfbp3、ifi6、igf-1r、il-6、il10ra1、il20r α、irta2、lox、lrrc15、ly64、ly6e、ly86、lypd3、lum、mcpt8、 mdp、mesothelin、mfi2、mmp9、mmp10、mmp14、mmp16、mpf、ms4a7、 msg783、mucin 1、mucin16、napi2b、napi3b、nca、nectin 4、nog、p2x5、 p2x7、pcad、pgf、pik3ap1、pik3cd、pd-l1、pdgfra、pdk1、pdk4、 pfkfb3、pgk1、plod2、psca、psca hlg、rnf43、ror1、sema 5b、serpinel、 slc39a6、sltrk6、steap1、steap2、sodium phosphate cotransporter 2b、 stat1、stat3、stc2、tacstd2、tenb2、tissue factor、tcf4、tenb2、tgf、 tgfb1、tgfb2、tgfbr1、tnfr2、tnfrsf21、tnfsf9、trpm4、trop-2、 trophoblast glycoprotein、tyro7、psma、vegfa、vegfr2、wnt5a、upk1b、 e-cadherin、p-cadherin、整合素α5β6和整合素α4β7。
[0096]
在一些实施方案中，本发明所述的抗体药物偶联物中的抗体(mab)靶向细胞表面受体为egfr。
[0097]
在一些实施方案中，本发明所述的抗体药物偶联物中的抗体(mab)选自：利妥昔单抗(rituximab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗 (tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adecatumumab)、拉妥珠单抗(labetuzumab)、cc49(明瑞莫单抗； minretumomab)、贝伐单抗(bevacizuma b)、伊瑞西珠单抗(etaracizuma b)、伏洛昔单抗(volocixima b)、西妥昔单抗(cetuxima b)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、狄诺塞麦单抗 (denosumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依帕珠单抗(epratuzamab)和阿特朱单抗(atezolizumab)。
[0098]
在一些实施方案中，本发明所述的抗体药物偶联物中的抗体(mab)为尼妥珠单抗(nimotuzumab)。
[0099]
在一些实施方案中，本发明所述的抗体药物偶联物的药物抗体比值dar的平均值为2～8。
[0100]
在一些实施方案中，本发明所述的抗体药物偶联物的药物抗体比值dar的平均值为优选2～6，更优选4.3。
[0101]
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其含有式(iii)所示的抗体药物偶联物以及药学上可以接受的载体。
[0102]
在一些实施方案中，本发明所述的抗体药物偶联物用于制备治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病和代谢性疾病中的药物；其中所述癌症选自鼻咽癌、头颈部肿瘤、神经胶质瘤、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、非小细胞肺癌、胃癌、肾癌和乳腺癌等实体瘤，所述自身免疫性疾病选自免疫性血小板减少性紫癜、风湿性关节炎、重症肌无力和系统性红斑狼疮，所述炎症性疾病选自肺炎、支气管炎、肠炎、胃炎和肾小球肾炎，所述代谢性疾病选自肥胖、糖尿病和高血脂。
[0103]
在一些实施例中，本发明包括用于抑制或减少患有实体瘤的受试者中实体瘤生长的方法，所述方法包括向该患有实体瘤的受试者给予本发明所述的抗体药物偶联物，使得该实体瘤生长被抑制或减少。
[0104]
作为其中一种示例，实体瘤是egfr阳性肿瘤或表达egfr的实体瘤，进一步的，实体瘤是egfr扩增的实体瘤或egfr过表达的实体瘤，例如头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、三
阴性乳腺癌、结肠直肠癌和多形性胶质母细胞瘤等；更进一步的，实体瘤是可能展现出升高水平的egfr的晚期实体瘤类型。
[0105]
在一些优选实施方案中，抗体也可以由小分子配体代替，例如叶酸衍生物、谷氨酸脲衍生物、生长抑素衍生物、芳基磺酰胺类衍生物(例如碳酸酐酶ix抑制剂)、连接两个脂肪族吲哚的多烯、花青染料和ir-783或其衍生物。
[0106]
在一些优势方案中，所述化合物、抗体药物偶联化合物或其药学上可接受的盐选自：
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113][0114]
在进一步优势方案中，所述化合物、抗体药物偶联化合物或其药学上可接受的盐选自：
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122][0123]
其中，mab1为尼妥珠单抗nimotuzumab；y选自2～6，优选4.3。
[0124]
本发明的另一方面还在于提供所述的通式(ii)和通式(iii)所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐的合成方法，步骤如下：
[0125][0126]
发明的详细说明
[0127]
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
[0128]
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至8个碳原子的烷基，更优选1至6个碳原子的烷基，最更优选1至3个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、 2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3
-ꢀ
二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3
-ꢀ
乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、 1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、 3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、 1,2-二甲基丁
基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、 3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基，本发明优选甲基、乙基、异丙基、叔丁基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基取代的烷基和羟基取代的烷基。
[0129]
术语“亚烷基”是指烷基的一个氢原子进一步被取代，例如：“亚甲基”指-ch
2-、“亚乙基”指-(ch2)
2-、“亚丙基”指-(ch2)
3-、“亚丁基”指-(ch2)
4-等。术语“烯基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上定义的烷基，例如乙烯基、 1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
[0130]
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含 3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基，优选环丙基、环丁基、环己基、环戊基和环庚基。
[0131]
术语“螺环烷基”指5至20元的单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺环烷基、双螺环烷基或多螺环烷基，优选为单螺环烷基和双螺环烷基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺环烷基。螺环烷基的非限制性实例包括：
[0132][0133]
也包含单螺环烷基与杂环烷基共用螺原子的螺环烷基，非限制性实例包括：
[0134][0135]
术语“稠环烷基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。稠环烷基的非限制性实例包括：
[0136][0137]
术语“桥环烷基”指5至20元，任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。桥环烷基的非限制性实例包括：
[0138][0139]
所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0140]
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至 20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、c(o)、s(o)(＝nh)或s(o)
m
(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选包含3至 8个环原子；最优选包含3至8个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢吡喃基、氮杂环庚烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基、吡喃基等，优选氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环庚烷基、哌啶基和哌嗪基。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基；其中涉及到的螺环、稠环和桥环的杂环基任选与其他基团通过单键相连接，或者通过环上的任意两个或者两个以上的原子与其他环烷基、杂环基、芳基和杂芳基进一步并环连接。杂环基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自氢、烷基、羟基烷基、氨基、亚氨基、氰基、氧代基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基。
[0141]
术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、s(o)(＝nh)或s(o)
m
(其中m是整数 0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5 元/5元或5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：
[0142][0143]
术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或 s(o)
m
(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：
[0144][0145][0146]
术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)
m
(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：
[0147][0148]
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
[0149][0150]
杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0151]
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。更优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
[0152][0153]
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0154]
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元或6元，例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基、哒嗪基和噁二唑等，优选为三唑基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、哒嗪基和嘧啶基、噻唑基；更优选三唑基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、嘧啶基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、噻二唑、吡啶基、哒嗪基和噁二唑。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
[0155][0156]
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、
氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0157]
术语“烷氧基”指-o-(烷基)和-o-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0158]“卤代烷基”指被一个或多个卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。
[0159]“卤代烷氧基”指被一个或多个卤素取代的烷氧基，其中烷氧基如上所定义。
[0160]“羟烷基”指被羟基取代的烷基，其中烷基如上所定义。
[0161]“烯基”指链烯基，又称烯烃基，其中所述的烯基可以进一步被其他相关基团取代，例如：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0162]“炔基”指(ch≡c-或-c≡c-)，其中所述的炔基可以进一步被其他相关基团取代，例如：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0163]“羟基”指-oh基团。
[0164]“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0165]“氨基”指-nh2。
[0166]“氰基”指-cn。
[0167]“硝基”指-no2。
[0168]“羧基”指-c(o)oh。
[0169]“thf”指四氢呋喃。
[0170]“etoac”指乙酸乙酯。
[0171]“meoh”指甲醇。
[0172]“dmf”指n、n-二甲基甲酰胺。
[0173]“dipea”指二异丙基乙胺。
[0174]“tfa”指三氟乙酸。
[0175]“mecn”指乙晴。
[0176]“dma”指n,n-二甲基乙酰胺。
[0177]“et2o”指乙醚。
[0178]“dce”指1,2二氯乙烷。
[0179]“dipea”指n，n-二异丙基乙胺。
[0180]“nbs”指n-溴代琥珀酰亚胺。
[0181]“nis”指n-碘代丁二酰亚胺。
[0182]“cbz-cl”指氯甲酸苄酯。
[0183]“pd2(dba)
3”指三(二亚苄基丙酮)二钯。
[0184]“dppf”指1,1
’-
双二苯基膦二茂铁。
[0185]“hatu”指2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’-
四甲基脲六氟磷酸酯。
[0186]“khmds”指六甲基二硅基胺基钾。
[0187]“lihmds”指双三甲基硅基胺基锂。
[0188]“meli”指甲基锂。
[0189]“n-buli”指正丁基锂。
[0190]“mmt”指对甲氧基苯基二苯甲基。
[0191]“nabh(oac)
3”指三乙酰氧基硼氢化钠。
附图说明
[0192]
图1为产物c和尼妥珠单抗对肿瘤的生长抑制作用对比图。
具体实施方式
[0193]
术语
[0194]
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
[0195]
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem,243, p3558(1968)中所述。
[0196]
本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm，igd，igg，iga和ige，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1，igg2，igg3， igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中第每类ig都可以有κ链或λ链。
[0197]
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
[0198]
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人b7-h4的单克隆抗体。制备时用b7-h4抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源 b7-h4抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源igg1，igg2，igg3或igg4或其变体的重链恒定区。
[0199]
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异
grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
[0206]“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”) 可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如student t检验、卡方检验、依据mann和whitney的u检验、kruskal-wallis检验(h检验)、jonckheere-terpstra 检验和wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
[0207]
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由
……
组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
[0208]
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
[0209]
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在dna含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
[0210]“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
[0211]“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。常规的药物组合物的制备见中国药典。
[0212]“可药用盐”是指本发明抗体-药物偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，其具有应有的生物活性。本发明抗体-药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
[0213]“溶剂化合物”指本发明的抗体-药物偶联物化合物与一种或多种溶剂分子形成可
药用的溶剂化合物，溶剂分子的非限制性实例包括：水、乙醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯。
[0214]
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
[0215]
实施例
[0216]
本发明的化合物结构是通过核磁共振(nmr)或/和液质联用色谱(lc-ms) 来确定的。nmr化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。nmr的测定是用bruker avance-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6)，氘代甲醇(cd3od)和氘代氯仿(cdcl3)，内标为四甲基硅烷(tms)。
[0217]
液质联用色谱lc-ms的测定用agilent 1200infinity series质谱仪。hplc的测定使用安捷伦1200dad高压液相色谱仪(sunfire c18 150
×
4.6mm色谱柱) 和waters 2695-2996高压液相色谱仪(gimini c
18 150
×
4.6mm色谱柱)。
[0218]
薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，tlc采用的规格是0.15mm～0.20mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5 mm。柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
[0219]
本发明实施例中的起始原料是已知的并且可以在市场上买到，或者可以采用或按照本领域已知的方法来合成。
[0220]
在无特殊说明的情况下，本发明的所有反应均在连续的磁力搅拌下，在干燥氮气或氩气氛下进行，溶剂为干燥溶剂，反应温度单位为摄氏度。
[0221]
中间体1的制备
[0222]
2-(甲硫基)-6-(戊-4-炔-1-基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的制备
[0223][0224]
第一步：乙基4-甲基-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯的制备
[0225][0226]
将乙酰乙酸乙酯(20g，154mmol)，原甲酸三乙酯(51.1ml，307mmol)溶于乙酸酐中(43.5ml，461mmol)，加热到130℃搅拌5小时，冷至室温，减压浓缩除去多余的溶剂，减压蒸馏得到中间体乙基(z)-2-(乙氧基亚甲基)-3-羰基丁酸酯 (18.3g,产率64％)。用dmf(100ml)溶解，加入氨基甲酰亚胺基硫酸甲酯(13.7g, 49.2mmol)，乙酸钠(8g,97.7mmol)，加热到80℃搅拌4小时，冷至室温，将反应液缓慢加入搅动的冰水中，有固体析出，过滤，用水洗涤滤饼，干燥得到目标产物乙基4-甲基-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯(16.1g，产率49％)。
[0227]
ms m/z(esi):213.1[m+h]
+
.
[0228]
第二步：乙基4-(溴甲基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯的制备
[0229]
[0230]
将乙基4-甲基-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯(10.5g，49.5mmol)溶于40ml乙酸中，滴加液溴(2.29ml,44.5mmol)，加热到60℃搅拌2.5小时。反应结束，浓缩，用乙酸乙酯/thf(3/1)萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，用甲苯共沸蒸馏得到黑棕色液体目标产物乙基4-(溴甲基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯(12g，产率84％)。
[0231]
第三步：2-(甲硫基)-6-(戊-4-炔-1-基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的制备
[0232][0233]
将乙基4-(溴甲基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯(10g，34.6mmol)溶于thf(100 ml)中，氮气保护下，加入4-戊炔-1-胺盐酸盐(4.2g，34.6mmol),dipea(13.4g， 103.8mmol),反应液在50℃条件下，搅拌15小时。乙酸乙酯(100ml)萃取三次。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩浓缩得到粗品，柱层析(etoac/petro ether＝3： 1)纯化得到目标产物2-(甲硫基)-6-(戊-4-炔-1-基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶
ꢀ-
5-酮(6.6g，产率77％)。
[0234]
ms m/z(esi):248.1[m+h]
+
.
[0235]
中间体2的制备
[0236]
6-(3-(1-(26-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的制备
[0237][0238]
第一步：6-(3-(1-(26-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的制备
[0239][0240]
将2-(甲硫基)-6-(戊-4-炔-1-基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮(6.2g， 25.1mmol)溶于thf(100ml)中，加入26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷-1-胺(22.5g，50.2mmol),dipea(43.6ml，251mmol),cui(6g，31.3mmol),氮气保护下，反应液在室温条件下，搅拌13小时。反应结束，加入氯仿稀释，用饱和氯化铵水溶液洗涤(3*50ml),有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品，柱层析(ch2cl2/meoh＝10：1)纯化得到目标产物6-(3-(1-(26-氨基
ꢀ-
3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮(12.2g，产率71％)。
[0241]
ms m/z(esi):686.1[m+h]
+
.
[0242]
中间体3的制备
[0243]
(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧苯基)二苯甲基)氨基)-2-(14-(4-(32-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂十四烷酰氨基)己酰胺的制备
[0244][0245]
第一步：32-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂十四烷酸的制备
[0246][0247]
将6-(3-(1-(26-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-1h-1,2,3-三唑-4
-ꢀ
基)丙基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮(5g，7.3mmol)溶于thf(50ml)中，加入dipea(3.8ml，21.9mmol),室温下滴加1,4-二噁烷-2,6-二酮(847mg，7.3mmol)的thf(10ml)溶液,氮气保护下，搅拌3小时。加入水淬灭，用乙酸乙酯(3*100ml)萃取，1m盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得到粗品32-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酸(5.2g)。
[0248]
ms m/z(esi):800.1[m-h]
+
.
[0249]
第二步：(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧苯基)二苯甲基)氨基)-2-(32-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酰氨基)己酰胺的制备
[0250][0251]
将32-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酸(5g，6.25mmol)溶于dmf(50ml)中，加入dipea(4ml)和hatu(2.6g，6.9 mmol)，室温搅拌0.5小时。加入(s)-2-氨基-n-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧苯基) 二苯甲基)氨基)己酰胺(3.9g，7.45mmol)，继续搅拌5小时，加入水，用二氯甲烷萃取(3*50ml)，水洗(50ml)，饱和食盐水(50ml)洗。有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧苯基)二苯甲基)氨基)-2-(32-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酰氨基)己酰胺(6.1g，产率75％)。
[0252]
ms m/z(esi):1307.1[m+h]
+
；
[0253]
中间体4的制备 (s)-4-乙基-4-羟基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7] 中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0254][0255]
第一步：(s)-4-乙基-4-羟基-11-(羟甲基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并 [1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0256][0257]
将(s)-4-乙基-4-羟基-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉
ꢀ-
3,14(4h)-二酮(3.48g，1mmol)溶于meoh/h2o(80ml/60ml)中，冷却到0℃，滴加入浓硫酸(32ml)，然后加入feso4.7h2o(3g，10.8mmol)，冷却到-10℃，缓慢加入h2o2水溶液(3g，9.3ml)，逐渐升至室温搅拌过夜，过滤，滤饼用水，甲醇和乙醚洗涤，干燥得到产物(1.1g)。滤液倒入冰水，析出的固体过滤，滤饼用水，甲醇和乙醚洗涤，干燥得到产物(1.5g)(s)-4-乙基-4-羟基-11-(羟甲基)-1,12
-ꢀ
二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(2.6g，产率69％)。
[0258]
ms m/z(esi):379.1[m+h]
+
.
[0259]
第二步：(s)-4-乙基-4-羟基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-1,12-二氢-14h-吡喃并 [3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0260][0261]
将(s)-4-乙基-4-羟基-11-(羟甲基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并 [1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(1g，2.6mmol)，吡咯烷-2-酮(450mg,5.3mmol)， dipea(1g,7.8mmol)，pph3(1.1g，3.9mmol)，和diad(580mg，3.9mmol)溶于thf(20ml),室温搅拌10小时。加入水，用乙酸乙酯萃取(3*20ml)，水洗(50 ml)两次，饱和食盐水(50ml)洗三次。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到目标产物(s)-4-乙基-4-羟基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(650mg，产率56％)。
[0262]
ms m/z(esi):446.1[m+h]
+
.
[0263]
中间体5的制备
[0264]
(s)-11-((1,1-二羟基异噻唑烷-2-基)甲基)-4-乙基-4-羟基-1,12-二氢-14h-吡喃并 [3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0265][0266]
第一步：(s)-11-((1,1-二羟基异噻唑烷-2-基)甲基)-4-乙基-4-羟基-1,12-二氢-14h
-ꢀ
吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0267][0268]
将(s)-4-乙基-4-羟基-11-(羟甲基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并 [1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(1g，2.6mmol)，1,1-二氧化异噻唑烷(640mg,5.3 mmol)，dipea(1g,7.8mmol)，pph3(1.1g，3.9mmol)，和diad(580mg，3.9 mmol)溶于thf(20ml),室温搅拌10小时。加入水，用乙酸乙酯萃取(3*20ml)，水洗(50ml)两次，饱和食盐水(50ml)洗三次。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到目标产物(s)-11-((1,1-二羟基异噻唑烷-2-基)甲基)-4-乙基
ꢀ-
4-羟基-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(680 mg，产率54％)。
[0269]
ms m/z(esi):482.1[m+h]
+
.
[0270]
中间体6的制备
[0271]
(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并 [3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基) 氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫砜基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯的制备
[0272][0273]
第一步：(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢
ꢀ-
1h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶
ꢀ-
6-基)丙基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯的制备
[0274][0275]
将三光气(74mg，0.27mmol)溶于无水二氯甲烷(10ml),冷却到-10℃，滴加入(s)-n-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧苯基)二苯甲基)氨基)-2-(32-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酰氨基)己酰胺(200mg，0.15 mmol)和吡啶(120mg，1.5mmol)的无水二氯甲烷(10ml)溶液，室温搅拌6小时。加入水淬灭，用水(50ml)，饱和碳酸钠溶液(50ml)，饱和食盐水(50ml)洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到目标产物(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并 [1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1氢
ꢀ-
1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(150mg，产率56％)。
[0276]
ms m/z(esi):1779.1[m+h]
+
.
[0277]
第二步：(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢
ꢀ-
1h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫砜基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9
-ꢀ
三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯的制备
[0278][0279]
将(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢-1h
-ꢀ
吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基) 丙基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(100mg，0.06mmol)溶于氯仿与甲醇的混合溶剂中(15ml:1 ml)，置于冰浴下，加入mcpba(34mg，0.17mmol)，于0℃反应30分钟。反应液旋干后柱层析，所得粗产物经制备hplc纯化得(s)-4-乙基-3,14-二羰基
ꢀ-
11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b] 喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫砜基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1氢-1,2,3-三唑-1
-ꢀ
基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(48 mg，产率47％)。
[0280]
ms m/z(esi):1810.1[m+h]
+
.
[0281]
中间体7的制备
[0282]
(s)-n-(2-(4-乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4'：6,
7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)-n-甲基甲磺酰胺的制备
[0283][0284]
第一步：(s)-4-乙基-4-羟基-11-甲基-1,12-二氢-14h-吡喃并[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b] 喹啉-3,14(4h)-二酮
[0285][0286]
室温下将(s)-4-乙基-4-羟基-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b] 喹啉-3,14(4h)-二酮(1g，2.9mmol)溶于cf3cooh/h2so4(35ml/12ml)中，依次加入feso
4.
7h2o(2.1g，7.6mmol)和水(60ml)。冷却到0℃后，依次滴加 hconh2(2ml)和65％(ch3)3cooh(1ml)，0℃下继续搅拌1小时。之后将反应液倒入冰水中，析出的固体过滤，滤饼用水洗涤，干燥得到产物(s)-4-乙基-4
-ꢀ
羟基-11-甲基-1,12-二氢-14h-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮 (0.8g，产率77％)。
[0287]
ms m/z(esi):363.1[m+h]
+
.
[0288]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.23(d,j＝8.5hz,1h),8.14(d,j＝8.4hz, 1h),7.84(t,j＝7.7hz,1h),7.71(t,j＝7.8hz,1h),7.32(s,1h),6.50(s,1h),5.43 (s,2h),5.26(s,2h),2.77(s,3h),1.88(hept,j＝7.9,7.4hz,2h),0.89(t,j＝7.3hz, 3h).
[0289]
第二步：(s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(甲胺基)乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3'， 4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮
[0290][0291]
将(s)-4-乙基-4-羟基-11-甲基-1,12-二氢-14h-吡喃并[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b] 喹啉-3,14(4h)-二酮(0.8g，2.2mmol)，甲胺盐酸盐(2.9g,44mmol)和多聚甲醛 (3g)依次加入到乙醇(20ml),水(20ml)和浓盐酸(5ml)的混合溶剂中。反应加热回流20小时后冷却至室温。将反应液浓缩后，经反向柱层析纯化得到目标产物 (s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(甲胺基)乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3'，4'：6,7] 吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(150mg，产率17％)。
[0292]
ms m/z(esi):406.1[m+h]
+
.
[0293]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.73(s,1h),8.32(d,j＝8.5hz,1h),8.21(d, j＝8.4hz,1h),7.90(t,j＝7.6hz,1h),7.78(t,j＝7.6hz,1h),7.35(s,1h),6.56(s, 1h),5.45(s,2h),5.40(s,2h),3.59
–
3.53(m,2h),3.31-3.27(m,2h),2.65(s,3h), 1.88(hept,j＝7.1hz,2h),0.88(t,j＝7.3hz,3h).
[0294]
第三步：(s)-n-(2-(4-乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3'， 4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)-n-甲基甲磺酰胺
[0295][0296]
将(s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(甲胺基)乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3'， 4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(150mg，0.37mmol)溶于二氯甲烷(10 ml)，加入三乙胺(187mg,1.85mmol)后反应液降至0℃，再滴加甲磺酰氯(63mg, 0.56mmol)。逐渐升至室温，搅拌1小时。将反应液浓缩后，经制备色谱纯化得到目标产物(s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(甲胺基)乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃并[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(15mg，产率8％)。
[0297]
ms m/z(esi):484.1[m+h]
+
.
[0298]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.32(d,j＝8.4hz,1h),8.19(d,j＝8.4hz, 1h),7.88(t,j＝7.6hz,1h),7.77(t,j＝7.6hz,1h),7.35(s,1h),6.53(s,1h),5.44 (s,2h),5.38(s,2h),3.56
–
3.49(m,2h),3.44(dd,j＝8.8,5.8hz,2h),2.89(s,3h), 2.87(s,3h),1.88(hept,j＝7.0hz,2h),0.89(t,j＝7.3hz,3h).
[0299]
中间体8的制备
[0300]
32-(2-(甲磺酰)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-5-羰基
ꢀ-
3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酸的制备
[0301][0302]
第一步：6-(26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢
ꢀ-
5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的制备
[0303][0304]
将乙基4-(氯甲基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸酯(200mg，0.81mmol)、叠氮-九聚乙二醇-氨基(355mg，0.81mmol)和n,n-二异丙基乙胺(314mg，2.43mmol)溶解在1,4-二氧六环
中，微波130℃条件下反应2小时。浓缩，反相柱层析(乙腈/水(+ 0.1％氨水)＝5％～60％)纯化得黄色油状物(200mg，产率41％)。
[0305]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.88(s,1h),4.59(s,2h),3.80(t,j＝5.2hz,2h), 3.73(t,j＝5.2hz,2h),3.69-3.62(s,30h),3.39(t,j＝5.2hz,2h),2.63(s,3h).
[0306]
ms m/z(esi):603.3[m+h]
+
.
[0307]
第二步：6-(26-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢
ꢀ-
5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的制备
[0308][0309]
将6-(26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢
ꢀ-
5h-吡咯[3,4-d]嘧啶-5-酮(200mg，0.33mmol)溶解在四氢呋喃(3ml)和水(1.5ml) 中，加入三苯基膦(174mg，0.66mmol)，室温反应16小时。lcms显示原料反应完全。该反应无后处理，直接用于下一步。
[0310]
ms m/z(esi):577.3[m+h]
+
.
[0311]
第三步：32-(2-(甲硫基)-5-氧代-5,7-二氢-6h-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)-5-氧代
ꢀ-
3,9,12,15,18,21,24,27,30-八氧代-6-氮杂三乙酸的制备
[0312][0313]
将二甘醇酐(153mg，1.32mmol)加入到6-(26-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)-2-(甲硫基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮的四氢呋喃和水的反应液中，室温反应3小时。浓缩，过滤，反相柱层析(乙腈/水(+0.1％氨水)＝ 2％～60％)纯化得无色油状物(160mg，产率70％)。
[0314]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.89(s,1h),4.60(s,2h),4.17(s,2h),4.12(s, 2h),3.83-3.79(m,2h),3.75-3.62(m,2h),3.70-3.62(m,28h),3.59-3.56(m, 2h),3.54-3.50(m,2h),2.63(s,3h).
[0315]
ms m/z(esi):693.3[m+h]
+
.
[0316]
第四步：32-(2-(甲磺酰)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-5-羰基-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷酸的制备
[0317][0318]
将32-(2-(甲硫基)-5-氧代-5,7-二氢-6h-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)-5-氧代
ꢀ-
3,9,12,15,18,21,24,27,30-八氧代-6-氮杂三乙酸(60mg，0.087mmol)溶解在乙腈(3 ml)和水(1.5ml)中，加入1,4-二氧六环(80mg，0.130mmol)，室温反应6小时。浓缩，过滤，反相柱层析(乙腈/水(+0.1％氨水)＝2％～60％)纯化得紫色油状物 (55mg，产率90％)。
[0319]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.26(s,1h),7.74(s,1h),4.87(s,2h),4.17(s, 2h),4.12(s,2h),3.90-3.87(m,2h),3.78-3.75(m,2h),3.69-3.61(m,28h),3.58
ꢀ-
3.56(m,2h),
甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸酯(140mg，0.125mmol)溶解在无水二氯甲烷(4ml)中，加入乙二胺(274mg，3.75mmol)，室温搅拌反应6小时。倒入60ml水中，二氯甲烷(30ml*2)萃取，有机相合并后水洗(30ml*2)，饱和食盐水(30ml)洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得粗品白色固体产物(130mg，产率93％)。
[0331]
ms m/z(esi):898.4[m+h]
+
.
[0332]
第三步：(s)-4-乙基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并 [1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯的制备
[0333][0334]
将32-(2-(甲磺酰)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-5-羰基
ꢀ-
3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十二烷(40mg,0.055mmol)溶解在 dmf(1.5ml)中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(31 mg，0.083mmol)，室温搅拌30分钟。加入4-((s)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺基)苄基((s)-4-乙基-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃 [3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯(50mg，0.055mmol)，室温搅拌1小时。反相hplc制备，得白色固体产物(45mg，产率51％)。
[0335]
ms m/z(esi):1604.7[m+h]
+
.
[0336]
第四步：4-((s)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-(3-(-2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二羰基
ꢀ-
6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-三十五烷酰氨基)苄基((s)-4-乙基-3,14-二羰基-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃酮[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0337]
将(s)-4-乙基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b] 喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(45mg， 0.028mmol)溶解在乙腈(2ml)中，加入三氟乙酸(0.5ml)，室温搅拌反应1小时。浓缩，反相制备纯化得白色固体产物(25mg，产率68％)。
[0338]
ms m/z(esi):1332.5[m+h]
+
.
[0339]
化合物i-5的制备
[0340]
4-((s)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-(3-(2-(甲磺酰)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,
33-九氧杂
ꢀ-
3,9-三十五烷酰氨基)苯甲基((s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基) 甲基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0341][0342]
将(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-((2-羰基吡咯烷-1-基)甲基)-3,4,12,14-四氢-1h
-ꢀ
吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-(3-(2-(甲硫砜基)-5-羰基-5,7-二氢-6氢-吡咯[3,4-d]嘧啶-6
-ꢀ
基)丙基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(40mg，0.022mmol)溶解在乙腈(2ml)中，加入三氟乙酸(0.5ml)，室温搅拌反应1小时。浓缩，反相制备纯化得白色固体产物(17mg，产率50％)。
[0343]
ms m/z(esi):1539.1[m+h]
+
。
[0344]
化合物i-33的制备
[0345]
4-((s)-2-(4-氨基丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯[3,4-d]嘧啶-6
-ꢀ
基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基((s)-4
-ꢀ
乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-吡咯烷-1-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7] 吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0346][0347]
第一步：3-(2-氧吡咯烷-1-基)丙醛的制备
[0348][0349]
将二甲亚砜(1.64g，21.0mmol)溶解于无水二氯甲烷(20ml)中，冷却至-78℃，缓慢滴加草酰氯(2.66g，21.0mmol)，滴加完后在该温度下反应30分钟。将1-(3
-ꢀ
羟丙基)吡咯烷-2-酮(2.0g,14.0mmol)的无水二氯甲烷(5ml)溶液缓慢滴加到上述反应液中，滴完在-78℃下反应1小时。滴加三乙胺(4.24g，42.0mmol)，并在
ꢀ-
78℃下反应15分钟，然后缓慢升至室温反应2小时。加入50ml水，二氯甲烷萃取(50ml*6)，饱和食盐水(50ml)洗有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状物(1.6g，产率81％)。
[0350]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.80(s,1h),3.61(t,j＝6.4hz,2h),3.42(t,j＝ 6.8hz,2h),2.75(t,j＝6.8hz,2h),2.37(t,j＝8.0hz,2h),2.09-1.99(m,4h).
[0351]
第二步：(s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(2-氧吡咯烷-1-基)乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃[3'， 4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0352][0353]
将七水合硫酸亚铁(639mg，2.30mmol)溶于水(6ml)和乙酸(6ml)中，冷却至0℃，加入(s)-喜树碱(400mg,1.15mmol)，滴加浓硫酸(6ml)，控制温度不超过5℃，加完再搅拌30分钟。缓慢滴加30％的双氧水(652mg，5.75mmol)，加完再在0℃下反应1小时，然后升到室温过夜。将反应液倒入200ml水中，二氯甲烷萃取(100ml*2)，有机相合并后饱和食盐水(100ml)洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(甲醇/二氯甲烷＝0～10％)纯化得黄色固体产物(480mg，产率91％)。
[0354]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.31(d,j＝8.4hz,1h),8.24(d,j＝8.4hz,1h), 7.85-7.81(m,1h),7.75-7.71(m,1h),7.68(s,1h),5.76(d,j＝16.3hz,1h),5.32 (d,j＝16.0hz,1h),5.31(s,2h),3.78(s,1h),3.66-3.63(m,2h),3.46
–
3.42(m, 2h),3.37-3.34(m,2h),2.41-2.31(m,2h),2.00-1.87(m,4h),1.05(t,j＝7.2hz, 3h).
[0355]
ms m/z(esi):460.2[m+h]
+
.
[0356]
第三步：(9-芴基)-甲基((s)-1-((4-((s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-氧代吡咯烷-1
-ꢀ
基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3'，4'：6,7]吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)氧基)羰基) 氧基)甲基)苯基)氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸酯的制备
[0357][0358]
将4-二甲氨基吡啶(74mg，0.60mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，加入三光气(179mg，0.60mmol)，室温搅拌10分钟。冷却至0℃，加入(s)-4-乙基-4
-ꢀ
羟基-11-(2-(2-氧吡咯烷-1-基)乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b] 喹啉-3,14(4h)-二酮(185mg，0.40mmol)，搅拌15分钟后，加入三乙胺(203mg， 2.01mmol)和(s)-2-fmoc-氨基-n-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺(300mg，0.40mmol)，0℃下继续反应2小时。反应液倒入50ml水中，二氯甲烷萃取(30ml*2)，有机相合并后水洗(30ml)，饱和食盐水洗(30ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝8：2：0.5) 纯化得黄色固体产物(180mg，产率36％)。
[0359]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.16(d,j＝8.4hz,2h),7.78-7.71(m,3h),7.63
ꢀ–
7.53(m,3h),7.43(d,j＝7.2hz,4h),7.40
–
7.29(m,7h),7.25
–
7.10(m,10h), 6.76(d,j＝8.8hz,2h),5.69
–
5.45(m,2h),5.28
–
4.98(m,4h),4.39(s,2h),4.22
ꢀ–
4.15(m,1h),3.87
–
3.77(m,1h),3.72(s,3h),3.64
–
3.40(m,5h),3.35
–
3.21(m, 1h),2.37
–
2.19(m,4h),2.13
–
1.99(m,4h),1.79
–
1.59(m,6h),1.00(t,j＝7.2hz, 3h).
[0360]
ms m/z(esi):1231.5[m+h]
+
.
[0361]
第四步：4-((s)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺基)苄基((s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-氧吡咯烷-1-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3'，4'：6,7] 吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0362][0363]
将9-芴基甲基((s)-1-((4-((s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-氧代吡咯烷-1-基) 乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3'，4'：6,7]吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)氧基)羰基)氧基) 甲基)苯基)氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸酯 (70mg，0.057mmol)溶解在无水二氯甲烷(5ml)中，加入乙二胺(2ml)，室温搅拌反应2小时。tlc(二氯甲烷：甲醇＝20:1)显示原料反应完全。倒入60ml水中，二氯甲烷(30ml*2)萃取，有机相合并后水洗(30ml*2)，饱和食盐水(30ml)洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得粗品白色固体产物(55mg，产率96％)。
[0364]
ms m/z(esi):1009.4[m+h]
+
.
[0365]
第五步：(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-羰基吡咯烷-1-基)乙基)-3,4,12,14-四氢
ꢀ-
1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯[3,4-d]嘧啶-6
-ꢀ
基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯的制备
[0366][0367]
参照化合物i-4第三步，以4-((s)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基) 己酰胺基)苄基((s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-氧吡咯烷-1-基)乙基)-3,4,12,14
-ꢀ
四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯(70mg，0.058mmol)为原料，得到黄色固体产物(60mg，产率61％)。
[0368]
ms m/z(esi):1715.7[m+h]
+
.
[0369]
第六步：4-((s)-2-(4-氨基丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯[3,4-d] 嘧啶-6-基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基((s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-吡咯烷-1-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并 [3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0370][0371]
参照化合物i-4第四步，以(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(2-羰基吡咯烷-1-基) 乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4
-ꢀ
甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯 [3,4-d]嘧啶-6-基)-4,8-二氧-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(60mg，0.035mmol)为原料，得到黄色固体产物(37mg，产率71％)。 ms m/z(esi):1443.6[m+h]
+
.
[0372]
化合物i-34的制备
[0373]
4-((s)-2-(4-氨基丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6
-ꢀ
基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基 ((s)-11-(2-(1,1-二羟基异噻唑烷-2-基)-4-乙基-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃酮[3',4':6,7] 吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0374][0375]
第一步：2-(3-羟丙基)异噻唑烷1,1-二氧化物的制备
[0376][0377]
将异噻唑烷1,1-二氧化物(1.0g，8.25mmol)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(20ml) 中，加入3-溴-1-丙醇(1.37g，9.90mmol)和碳酸铯(4.03g，12.4mmol)，100℃下反应16小时。冷却至室温，倒入100ml水中，二氯甲烷萃取(50ml*3)，有机相合并后饱和食盐水洗(50ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得无色液体产物(1.3g，产率88％)。
[0378]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ3.74(t,j＝6.0hz,2h),3.29(t,j＝6.8hz,2h), 3.22
–
3.15(m,4h),2.40
–
2.33(m,2h),1.86
–
1.80(m,2h).
[0379]
第二步：3-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)丙醛的制备
[0380][0381]
参照化合物i-33第一步，以2-(3-羟丙基)异噻唑烷1,1-二氧化物(1.3g，7.26 mmol)为原料，得微黄色液体产物(1.0g，产率77％)。
[0382]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.80(s,1h),3.41(t,j＝6.4hz,2h),3.28(t,j＝6.8hz,2h),3.15(t,j＝7.6hz,2h),2.83(t,j＝6.4hz,2h),2.38
–
2.30(m,2h).
[0383]
第三步：(s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)乙基)-1,12-二氢-14h
-ꢀ
吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮的制备
[0384][0385]
参照化合物i-33第二步，以(s)-喜树碱(500mg，1.44mmol)和3-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)丙醛(508mg，2.87mmol)为原料，得淡黄色固体产物(240mg，产率 34％)。
[0386]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.32(d,j＝8.4hz,1h),8.20(d,j＝8.4hz, 1h),7.90
–
7.86(m,1h),7.79
–
7.75(m,1h),7.35(s,1h),6.52(s,1h),5.45(s,2h), 5.38(s,2h),3.53
–
3.50(m,2h),3.37
–
3.32(m,4h),3.21
–
3.16(m,2h),2.25
–ꢀ
2.17(m,2h),1.93
–
1.84(m,2h),
0.89(t,j＝7.2hz,3h).
[0387]
ms m/z(esi):496.2[m+h]
+
.
[0388]
第四步：(9-芴基)-甲基((s)-1-((4-((s)-4-乙基-3,14-二氧-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2
-ꢀ
基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸酯的制备
[0389][0390]
参照化合物i-4第一步，以(s)-4-乙基-4-羟基-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基) 乙基)-1,12-二氢-14h-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-3,14(4h)-二酮(150mg，0.20 mmol)为原料，得白色固体产物(130mg，产率40％)。
[0391]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(d,j＝8.4hz,1h),8.12(d,j＝8.4hz,1h), 7.80
–
7.74(m,3h),7.70
–
7.64(m,1h),7.62
–
7.31(m,14h),7.25
–
7.15(m,9h), 6.77(d,j＝8.8hz,2h),5.65(d,j＝16.8hz,1h),5.33
–
5.23(m,3h),5.09
–
5.00 (m,2h),4.33(s,2h),4.12(q,j＝7.2hz,2h),3.71(s,3h),3.55
–
3.41(m,3h),3.35
ꢀ–
3.27(m,2h),3.11(t,j＝7.2hz,2h),2.37
–
2.30(m,2h),2.27
–
2.22(m,1h), 2.14
–
2.09(m,1h),1.88
–
1.56(m,8h),1.44
–
1.35(m,2h),0.99(t,j＝7.2hz, 3h).
[0392]
ms m/z(esi):1627.5[m+h]
+
.
[0393]
第五步：4-((s)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺基)苄基((s)-4
-ꢀ
乙基-3,14-二氧基-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3'， 4'：6,7]吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0394][0395]
参照化合物i-4第二步，以(9-芴基)-甲基((s)-1-((4-((s)-4-乙基-3,14-二氧
ꢀ-
11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚基 [1,2-b]喹啉-4-基)氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸酯(70mg，0.055mmol)为原料，得淡黄色固体(56 mg，产率80％)。
[0396]
ms m/z(esi):1045.4[m+h]
+
.
[0397]
第六步：(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)乙基)-3,4,12,14
-ꢀ
四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基(4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基
苯基) 二苯甲基)氨基)丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯[3,4-d]嘧啶-6
-ꢀ
基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯的制备
[0398][0399]
参照化合物i-4第三步，以4-((s)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基) 己酰胺基)苄基((s)-4-乙基-3,14-二氧基-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷-2-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚基[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯(56mg，0.044 mmol)为原料，得到黄色固体(23mg，产率30％)。
[0400]
ms m/z(esi):1751.7[m+h]
+
.
[0401]
第七步：4-((s)-2-(4-氨基丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7-二氢-6h-吡咯并[3,4-d] 嘧啶-6-基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9-三十五烷酰氨基)苄基((s)-11-(2-(1,1-二羟基异噻唑烷-2-基)-4-乙基-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃酮 [3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的制备
[0402][0403]
参照化合物i-4第四步，以(s)-4-乙基-3,14-二羰基-11-(2-(1,1-二氧异噻唑烷
ꢀ-
2-基)乙基)-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-4-基 (4-((s)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-35-(2-(甲磺酰基)-5-羰基-5,7
-ꢀ
二氢-6h-吡咯[3,4-d]嘧啶-6-基)-4,8-二羰基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧代-3,9
-ꢀ
三十五烷酰氨基)苄基)碳酸酯(23mg，0.013mmol)为原料，得到黄色固体产物 (10.2mg，产率54％)。
[0404]
ms m/z(esi):1479.6[m+h]
+
.
[0405]
尼妥珠抗体的制备
[0406]
尼妥珠抗体的重链序列如下(含信号肽)：
[0407]
mewswvflfflsvttgvhsqvqlqqsgaevkkpgssvkvsckasgytf tnyyiywvrqapgqglewigginptsggsnfnekfktrvtitvdestntaym elsslrsedtafyfcarqglwfdsdgrgfdfwgqgstvtvssastkgpsvfpl apsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglys lssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapel lggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhn aktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektisk akgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenn ykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksls lspgk
[0408]
尼妥珠抗体的轻链序列如下(含信号肽)：
[0409]
mewswvflfflsvttgvhsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqniv hsngntyldwyqqtpgkapklliykvsnrfsgvpsrfsgsgsgtdftftissl qpediatyycfqyshvpwtfgqgtklqitrevaapsvfifppsdeqlksgtasv vcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlska dyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0410]
根据以上尼妥珠抗体轻链和重链的氨基酸序列合成cdna片段，插入到 pcdna3.1表达载体(life technologies cat.no.v790-20)中。将表达载体和转染试剂pei(polysciences,inc.cat.no.23966)以1:2的比例转染hek293细胞(life technologies cat.no.11625019)，细胞密度为1x106个/ml，培养体积为1l。将转染后的细胞并置于co2孵育箱中孵育4-5天。收取细胞培养液，离心过滤后上样到抗体纯化亲和柱，经磷酸缓冲液洗柱、甘氨酸盐酸缓冲液(ph2.7 0.1m gly-hcl) 洗脱、1m tris盐酸ph 9.0中和、以及磷酸缓冲液透析，得到尼妥珠抗体蛋白100.5 mg，纯度97％。
[0411]
抗体偶联药物的制备
[0412]
第一步，将硫代乙酸s-(3-羟基丙基)酯(0.7mg，5.3mol)溶解于0.9ml 乙腈溶液备用。向尼妥珠抗体ph＝4.3的乙酸/乙酸钠缓冲液(10.35mg/ml,9.0ml， 0.97mol)加入上述预制的硫代乙酸s-(3-羟基丙基)酯的乙腈溶液，然后滴加 1.0ml的氰基硼氢化钠(14.1mg，224mol)的水溶液，于25℃下振荡反应2小时。反应结束后，用sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph6.5的0.05m的pbs溶液)后，得产物a溶液，浓缩到10mg/ml后直接进行下一步反应。
[0413]
第二步，向a溶液(11.0ml)中加入0.35ml的2.0m盐酸羧胺溶液，于25℃下振荡反应30分钟后，将反应液用sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph6.5 的0.05m的pbs溶液)后，得到产物b溶液(浓度6.17mg/ml，14.7ml)。
[0414]
第三步，将化合物i-5溶解于0.3ml乙腈中，加入b溶液(浓度6.17mg/ml， 3.0ml)中，于25℃下振荡反应4小时后，将反应液用sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph6.5的0.05m的pbs溶液)后，在无菌条件下用滤器过滤后得到产物c(adc-5)抗体-药物偶联物的pbs缓冲液(3.7mg/ml，4.7ml)，于4℃冷藏。
[0415]
采用紫外法测定药物载量(dar值)。将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
[0416]
数据处理：
[0417]
通过建立标准曲线，测定280nm波长下的吸收，确定抗体含量c
mab
，测定370 nm波长下的吸收，确定小分子含量c
drug
。
[0418]
药物载量平均值＝c
drug
/c
mab
[0419]
通过以上方法测定产物c的药物载量为4.3。
[0420][0421]
产物c(adc-5)(其中mab1为尼妥珠单抗，y＝4.3)
[0422]
抗体偶联药物adc-1～adc-4和adc-6～adc-34参考adc-5的方法制备。
[0423]
癌症细胞杀伤试验
[0424]
将egfr表达阳性的nci-h1650(atcc保藏号crl-5883)，nci-h1975 (atcc保藏号crl-5908)，hcc827(atcc保藏号crl-2868)，fadu(atcc 保藏号htb-43)，cal33(atcc保藏号htb-31)细胞维持在含有10％胎牛血清(英杰公司(invitrogen)目录编号10082)的rpmi培养基(英杰公司(invitrogen) 目录编号22400)中。用胰蛋白酶从平板上除去细胞，并将其以300个细胞/孔铺板于corning 384孔球状体板(corning目录编号3830)中的25μl相同培养基中。将板以500
×
g离心5分钟，并将其放置于37℃，5％co2和95％湿度条件下培养。向细胞中加入指定浓度的抗体偶联药物产物c或者尼妥珠单抗，孵育3天后，添加40μl的promega celltiter-glo试剂(promega目录编号g968b)。随后读取来celltiter-glo试剂的化学发光读数确定ic50(50％抑制浓度)。
[0425]
结果显示产物c(adc-5)比尼妥珠单抗具有更强的杀伤癌症细胞的作用(如表1所示)。
[0426]
表1
[0427][0428]
*n/a：经检测无活性。
[0429]
肿瘤生长抑制试验
[0430]
使用鼠异种移植非小细胞肺癌(nsclc)模型评估抗体偶联药物的体内抗肿瘤活性。具体地，将egfr阳性nci-h1650细胞(atcc保藏号crl-5883)细胞在rpmi-1640中以单层培养，其补充有10％胎牛血清。为了产生异种移植肿瘤，将5x106个活细胞分别皮下接种到免疫缺陷雌性scid/bg小鼠的右肋腹中。注射体积为0.2ml。肿瘤尺寸匹配在大约200mm3。将抗体偶联药物产物c和尼妥珠单抗配制在注射用0.9％氯化钠中并腹膜内注射。注射量不超过200μl，注射剂量为2 mg/kg体重。治疗在肿瘤尺寸匹配后24小时内开始。在治疗开始时，小鼠体重大约22g。以每三天一次施用总共六次剂量(q3dx6)，经腹膜内(ip)施用。每周对肿瘤体积进行两到三次评估。通过电子卡尺测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)，并根据以下等式
计算体积：v＝l
×
w2/2。当肿瘤体积达到3,000mm3或发生皮肤溃疡时，对小鼠实施安乐死。为了指示治疗剂的效力，使用肿瘤抑制率(tgi)参数。 tgi是实验过程中最大的肿瘤生长抑制。通过100％*(1-tv/cv)(其中tv和cv分别是治疗组和对照组的平均肿瘤体积)计算肿瘤生长抑制率。
[0431]
结果显示产物c(adc-5)比尼妥珠单抗有更强的肿瘤生长抑制作用(如附图1和表2所示)。
[0432]
表2
[0433]
样品第14天tgi尼妥珠单抗29.9％产物c82.7％