基于毛细管电泳的同时检测七种人冠状病毒的引物组及其应用的制作方法

本发明涉及基于毛细管电泳的同时检测七种人冠状病毒的引物组及其应用，特别涉及基于毛细管电泳的用于检测hcov-oc43/hcov-229e/sars-cov/hcov-nl63/hcov-hku1/mers-cov/covid-19七种人冠状病毒的特异性引物组，本发明还涉及基于毛细管电泳的同时检测上述七种人冠状病毒的分子marker，以及待检样本的处理、rt-pcr反应体系及反应条件、结果分析，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

冠状病毒是自然界中广泛存在的一大类家族，人和其他哺乳类动物及禽类普遍易感。人冠状病毒(humancoronaviruses,hcovs)目前已知共有七种，人冠状病毒感染是引起人类呼吸道疾病的重要病原之一，在常见呼吸道病原体中冠状病毒检出率为3％-10％，是感染婴幼儿、老人及免疫功能低下的成人引发咳嗽、发热、喉炎、支气管炎以及肺炎等临床症状的重要病原体。流行病学研究表明，hcov-hkui、hcov-229e、hcov-nl63和hcov-oc43这四种人冠状病毒呈全球性分布，临床症状主要表现为发热、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支气管炎、肺炎等，给人类生命健康造成一定的负担。sars-cov和mers-cov以及covid-19这三种冠状病毒感染人后能造成急性呼吸道症状，严重者引发呼吸系统和肾功能系统衰竭并造成死亡。

早期防控是防止传染病输入播散、保障公共卫生安全、维护人类生命健康的前提条件，而开发快速、灵敏、特异的分子检测技术方法是早期防控的关键，同时也为指导临床、合理选择抗病毒药物提供重要依据。目前，针对人冠状病毒的检测技术方法主要包括病毒分离培养、血清学检测法、普通pcr法、等温扩增法以及荧光定量rt-pcr法。病毒分离培养、血清学检测法以及普通pcr法是比较常规的检测方法，这些方法在实验过程中面临检测灵敏度较低、检测时间过长、对实验室硬件要求高、对操作人员技术要求较高等诸多缺点，无法保证检测的时效性和结果的准确性。等温扩增法和荧光定量rt-pcr法是目前大多数实验室经常用到的分子检测技术方法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。荧光定量rt-pcr法目前同样面临仅能实现单管单重(最多两重)病原体检测的问题，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。hcovs快速、准确的检测不仅对监测和防控hcovs的流行具有重要意义，也为临床早期诊断，合理选择抗病毒药物治疗等提供可靠实验室依据。

技术实现要素：

本发明的目的是克服hcovs检测过程中耗时较长、检测效率较低、检测成本较高、检测时效性不强等缺陷，提供基于毛细管电泳的同时检测七种人冠状病毒的引物组及其应用，具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速精准检测、操作简单、应用方便等突出的优点。

本发明的技术方案，根据hcov-oc43、hcov-229e、sars-cov、hcov-nl63、hcov-hkui、mers-cov和covid-19七种人冠状病毒基因组序列，分别寻找各个冠状病毒的保守序列，作为优选，分别设计了适用于pcr的特异性引物对。

基于毛细管电泳的同时检测七种人冠状病毒的引物组，所述引物组包括七对引物对，分别是引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7；

所述引物对1针对人冠状病毒hcov-oc43，具体包括上游引物f1，序列如seqidno.1所示；下游引物r1，序列如seqidno.2所示；

所述引物对2针对人冠状病毒hcov-229e，具体包括上游引物f2，序列如seqidno.3所示；下游引物r2，序列如seqidno.4所示；

所述引物对3针对人冠状病毒sars-cov，具体包括上游引物f3，序列如seqidno.5所示；下游引物r3，序列如seqidno.6所示；

所述引物对4针对人冠状病毒hcov-nl63，具体包括上游引物f4，序列如seqidno.7所示；下游引物r4，序列如seqidno.8所示；

所述引物对5针对人冠状病毒hcov-hku1，具体包括上游引物f5，序列如seqidno.9所示；下游引物r5，序列如seqidno.10所示；

所述引物对6针对人冠状病毒mers-cov，具体包括上游引物f6，序列如seqidno.11所示；下游引物r6，序列如seqidno.12所示；

所述引物对7针对人冠状病毒covid-19，具体包括上游引物f7，序列如seqidno.13所示；下游引物r7，序列如seqidno.14所示。

所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7，分别特异性检测上述七种人冠状病毒，对应检测靶片段长度分别为122bp、152bp、107bp、205bp、162bp、143bp和99bp。

具体如表1所示。

表1

本发明提供的同时检测hcov-oc43/hcov-229e/sars-cov/hcov-nl63/hcov-hku1/mers-cov/covid-19七种人冠状病毒rt-pcr扩增反应体系，反应条件、检测步骤如下：

(1)样本制备：样本核酸可从鼻咽式子、肺泡灌洗液、痰液等样本中直接提取，可手动提取，也可用全自动核酸提取仪提取，提取的核酸直接用于下一步扩增反应。

(2)作为优选，选用one-stepqrt-pcrkit(toyobo)以25μl反应体系为例具体配置如下，使用量终浓度：

2х反应液12.5μl；dna聚合酶0.5μl；rt逆转录酶0.5μl；上游引物1μl2.5μm；下游引物1μl2.5μm；病毒模板rna5μl；ddh2o4.5μl；upto25μl；

(3)作为优选，pcr反应程序如下表2所示：

表2

(4)结果分析与判定：对pcr扩增产物采用全自动毛细管电泳仪(qseq100，光鼎生物科技(江苏)有限公司(苏常械备20180095号))，选择高分辨率卡夹s1(c105102)，alignmentmarker选择ma1(c109100)，sizemarker选择ma2(c109200)，样本注入电压4kv10s，分离压6kv330s。将pcr扩增产物用dilutionbuffer(c104405)作10倍稀释后进行毛细管电泳，操作过程按照设备说明书进行。

本发明的有益效果：本发明提供的引物组及其应用具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速精准检测、操作简单、应用方便等突出的优点，为临床诊断、疾病监测检测、检验检疫等领域的病原体快速检测提供了切实可行的技术方法。

附图说明

图1实施例1七种人冠状病毒毛细管电泳信号图谱。

图2实施例1七种人冠状病毒毛细管电泳凝胶成像图谱

图3七种人冠状病毒毛细管电泳分子marker的建立。

图4hcov-nl63/covid-19/mers-cov毛细管电泳信号图谱。

图5分子marker对covid-19毛细管电泳结果判定。

图6分子marker对mers-cov毛细管电泳结果判定。

图7分子marker对hcov-nl63毛细管电泳结果判定。

具体实施方式

实施例1：

本发明实施例中，本发明提供的同时检测hcov-oc43/hcov-229e/sars-cov/hcov-nl63/hcov-hku1/mers-cov/covid-19七种人冠状病毒rt-pcr扩增反应体系，反应条件、检测步骤如下：

(1)样本制备：样本核酸可从鼻咽式子、肺泡灌洗液、痰液等样本中直接提取，可手动提取，也可用全自动核酸提取仪提取，提取的核酸直接用于下一步扩增反应。

(2)作为优选，选用one-stepqrt-pcrkit(toyobo)以25μl反应体系为例具体配置如下，使用量终浓度：

2х反应液12.5μl；dna聚合酶0.5μl；rt逆转录酶0.5μl；上游引物1μl2.5μm；下游引物1μl2.5μm；病毒模板rna5μl；ddh2o4.5μl；upto25μl；

(3)作为优选，pcr反应程序如下表3所示：

表3

(4)结果分析与判定：

对pcr扩增产物采用全自动毛细管电泳仪(qseq100，光鼎生物科技(江苏)有限公司(苏常械备20180095号))，选择高分辨率卡夹s1(c105102)，alignmentmarker选择ma1(c109100)，sizemarker选择ma2(c109200)，样本注入电压4kv10s，分离压6kv330s。将pcr扩增产物用dilutionbuffer(c104405)作10倍稀释后进行毛细管电泳，操作过程按照设备说明书进行。

七种人冠状病毒毛细管电泳信号图谱如图1所示。其中，七种冠状pcr产物经毛细管电泳后均能精确判读出预期大小的单一目的片段(误差不超过5bp)，具备较好的特异性和检测灵敏性、精确性。

七种人冠状病毒毛细管电泳凝胶成像图谱如图2所示。其中，ma-2:sizemarker,a01-a07representcovid-19,sars-cov,hcov-oc43,mers-cov,hcov-229e、hcov-hku1andhcov-nl63。图2中，七种人冠状病毒pcr扩增产物经电泳后均能扩增出特异性目的条带。

七种人冠状病毒毛细管电泳分子marker的建立如图3所示。由于不同靶基因线性结构的不同，毛细管电泳目标基因判读信号偏差不超过5bp，根据实验数据，将covid-19、sars-cov靶基因判读信号置信区间分别设置在99(±3)bp和107(±3)bp，其它四种人冠状病毒靶基因判读信号置信区间均设置在靶片段±5bp。通过建立上述针对冠状病毒的分子marker，即可同步实现针对七种人冠状病毒的精准检测。

实施例2

分别以hcov-nl63阳性样本及covid-19、mers-cov假病毒颗粒作为筛查对象，以建立的分子marker作为参照，按照实施例1中说明，通过核酸提取、rt-pcr反应体系配置及毛细管电泳分析，结果如图4所示。图4中，以分子marker为参照，经核酸提取、pcr扩增及电泳后均能精确检测出对应的靶片段，从而实现同时精准鉴定冠状病毒的目的。

分子marker对covid-19毛细管电泳结果判定如图5所示：分子marker识别covid-19的靶目的片段，即target片段大小为99(+3/-3)bp(置信区间内)，经毛细管电泳后结果片段大小为99bp，在置信区间内，即可判定该待检测样本为检出covid-19病毒核酸。

分子marker对mers-cov毛细管电泳结果判定如图6所示：分子marker识别mers-cov的靶目的片段，即target片段大小为143(+5/-5)bp(置信区间内)，经毛细管电泳后结果片段大小为142bp，在置信区间内，即可判定该待检测样本为检出mers-cov病毒核酸。

分子marker对hcov-nl63毛细管电泳结果判定如图7所示:分子marker识别nl63的靶目的片段，即target片段大小为205(+5/-5)bp(置信区间内)，经毛细管电泳后结果片段大小为201bp，在置信区间内，即可判定该待检测样本为检出nl63病毒核酸。

本发明具备市场上独一无二的创新性，即实现同时检测七种人冠状病毒，具有检测精准、特异性强、灵敏度高、检测时间快等突出优点，避免了逐个检测所带来的耗时长、检测成本高、容易交叉污染等缺点。目前市场上未见有类似相关技术及产品报道，本发明在疾病检测、传染病防控、指导临床治疗等方面具有广阔应用前景。

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>中华人民共和国无锡海关

新疆国际旅行卫生保健中心（乌鲁木齐海关口岸门诊部）

新疆环疆绿源环保科技有限公司

<120>基于毛细管电泳的同时检测七种人冠状病毒的引物组及其应用

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