重组转氨酶及其在合成（R）-2-（2,5-二氟苯基）吡咯烷中的应用的制作方法

重组转氨酶及其在合成（r）-2-（2,5-二氟苯基）吡咯烷中的应用
技术领域
1.本发明属于生物酶进化及医药制造技术领域，涉及重组转氨酶及其在合成拉罗替尼关键手性中间体(r)
ꢀ-
2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷中的应用。


背景技术：

2.拉罗替尼(larotrectinib)是由array biopharma公司研发、由拜耳公司与loxo oncology公司共同临床开发的一种选择性原肌球蛋白受体激酶(trk)抑制剂，是一种广谱抗癌药。结构式如下：
[0003][0004]
目前，larotrectinib的制备通常是先合成其关键手性中间体(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，再利用 (r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷继续合成，最终制得larotrectinib。(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的 cas号为：1218935-59-1，分子式为c
10h11
f2n，分子量为：183.20，结构式如下：
[0005][0006]
目前，合成中间体(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷主要有化学合成法和生物合成法两类：
[0007]
化学合成法主要是通过有机合成手段合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。wo2010048314a1报道在低温条件下用醋酸钯和手性诱导剂(-)-sparteine诱导合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，但是该方法使用贵金属作为催化剂，成本较高，且存在污染环境等问题，因此不适用于大规模工业化生产。
[0008][0009]
cn107286070a采用手性试剂(s)-叔丁基亚磺酰胺及其类似物和格式试剂合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，格式试剂反应属于剧烈反应，对温度、加料速度以及物料和设备的干燥性均有严格要求，若未能有效控制上述参数，则可能造成反应失控，引起火灾爆
炸事故，因此亦不适用于大规模工业化生产。
[0010][0011]
生物合成法主要利用生物酶催化反应合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。cn108484361a利用羰基还原酶或醇脱氢酶先合成(s)-4-氯-1-(2,5)-二氟苯基丁-1-醇，再构型翻转合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。
[0012][0013]
现有技术中，化学合成法常使用昂贵的诱导剂或者危险的格式试剂，生物合成法需要先合成反构型的手性醇，再构型翻转，关环得到目的化合物，合成步骤冗长，均不适用于工业化生产。
[0014]
如何提供一种(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成方法，能够避免使用昂贵且危险的试剂，同时合成工艺简单，适用于工业化生产，成为了目前迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

[0015]
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了重组转氨酶及其在合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷中的应用，所述转氨酶突变体能够高效催化4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，工艺简单、成本低廉、安全性高，适用于大规模工业化生产。
[0016]
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0017]
第一方面，本发明提供了一种转氨酶突变体，所述转氨酶突变体包括与seq id no:1具有80％以上同一性、且具有相同或相似转氨酶活性的氨基酸序列；
[0018]
seq id no:1：
[0019]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidptvknlqwgdlvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegsgfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmcttaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0020]
本发明中，通过对seq id no:1所示的野生型转氨酶进行突变，获得的与野生型转氨酶具有80％以上同一性的转氨酶突变体具有显著提高的转氨酶活性，可以高效催化4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮合成 (r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，反应条件温和，成本低廉，在(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷以及拉罗替尼的工业化生产领域具有重要意义。
[0021]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列的第13～312位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
[0022]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列的第13～312位氨基酸经取代突变一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
[0023]
本发明中，对seq id no:1所示的野生型转氨酶的第13～312位氨基酸中的一个或几个氨基酸进行取代突变，突变后的转氨酶突变体的转氨酶活性得到显著提高，能够更高效地催化(r)-2-(2,5-二氟苯基) 吡咯烷的合成，进而提高了生产效率，降低了生产成本。
[0024]
优选地，所述突变选自第180位、第181位、第187位、第216位或第275位中的任意一个或多个，进一步优选为突变选自第180位、第181位、第187位、第216位或第275位中的任意三个位点。
[0025]
优选地，所述突变选自k180r、n181y、l187y、g216l或t275w中的任意一个或多个，进一步优选为突变选自k180r、n181y、l187y、g216l或t275w中的任意三个位点。
[0026]
本发明中，对野生型转氨酶(seq id no:1)进行k180r、n181y、l187y、g216l或t275w突变，获得的转氨酶突变体的转氨酶活性有所提高。
[0027]
优选地，所述突变进一步选自第177位。
[0028]
优选地，所述突变选自p177n、k180r、n181y、l187y、g216l、g216r或t275w中的任意一个或多个。
[0029]
本发明中，对野生型转氨酶(seq id no:1)进行p177n、k180r、n181y、l187y、g216l、g216r 或t275w突变，获得的转氨酶突变体的转氨酶活性明显提高。
[0030]
优选地，所述突变进一步选自第13位和/或第301位。
[0031]
优选地，所述突变选自a13l、a13r、p177n、k180r、n181y、l187y、g216w、g216r、t275w、 k301r或k301f中的任意一个或多个。
[0032]
优选地，所述突变进一步选自第284位和/或第312位。
[0033]
优选地，所述突变选自a13l、a13r、p177n、k180r、n181y、l187y、g216w、g216r、t275w、 t284f、k301r、k301f或d312f中的任意一个或多个。
[0034]
本发明中，对野生型转氨酶(seq id no:1)进行a13l、a13r、p177n、k180r、n181y、l187y、 g216w、g216r、t275w、t284f、k301r、k301f或d312f突变，获得的转氨酶突变体具有明显提高的转氨酶活性。
[0035]
优选地，所述突变进一步选自第138位，即所述取代突变包括第13位、第138位、第177位、第180 位、第181位、第187位、第216位、第275位、第284位、第301位或第312位中的任意一个或至少两个氨基酸被取代。
[0036]
优选地，所述取代突变的位点包括a13l、a13r、n138w、n138r、p177n、k180r、n181y、l187y、 g216l、g216r、g216w、t275w、t284f、t284w、k301r、k301f、d312f、d312l或d312r中的任意一种或至少两种的组合。
[0037]
本发明中，对野生型转氨酶(seq id no:1)进行a13l、a13r、n138w、n138r、p177n、
k180r、 n181y、l187y、g216l、g216r、g216w、t275w、t284f、t284w、k301r、k301f、d312f、d312l 或d312r突变，获得的转氨酶突变体具有显著提高的转氨酶活性。
[0038]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经l187y、g216l和t275w取代突变获得的氨基酸序列。
[0039]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:3所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性有所提高；
[0040]
seq id no:3：
[0041]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidptvknlqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegslfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0042]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经n181y、g216l和t275w取代突变获得的氨基酸序列。
[0043]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:5所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性有所提高；
[0044]
seq id no:5：
[0045]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidptvkylqwgdlvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegslfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0046]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经k180r、l187y和g216l取代突变获得的氨基酸序列。
[0047]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:7所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性有所提高；
[0048]
seq id no:7：
[0049]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidptvrnlqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegslfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmcttaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0050]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经p177n、k180r、n181y、l187y 和t275w取代突变获得的氨基酸序列。
[0051]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:9所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性明显提高； seq id no:9：
[0052]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegsgf
nivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0053]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经p177n、n181y、l187y、g216l 和t275w取代突变获得的氨基酸序列。
[0054]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:11的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性明显提高；
[0055]
seq id no:11：
[0056]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvkylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegslfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0057]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经p177n、k180r、l187y、g216r 和t275w取代突变获得的氨基酸序列。
[0058]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:13所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性明显提高； seq id no:13：
[0059]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrnlqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegsrfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0060]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经p177n、k180r、n181y、l187y、 g216l和t275w取代突变获得的氨基酸序列。
[0061]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:15所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性显著提高； seq id no:15：
[0062]
masmdkvfagyaarqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegslfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkkiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0063]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经a13l、p177n、k180r、n181y、 l187y、g216w、t275w和k301r取代突变获得的氨基酸序列。
[0064]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:17所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性显著提高； seq id no:17：
[0065]
masmdkvfagyalrqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegswfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcde ifmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkriwdgywamhydaaysfeidynern。
[0066]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经a13r、p177n、k180r、n181y、 l187y、g216r、t275w、t284f和k301f取代突变获得的氨基酸序列。
[0067]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:19所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性显著提高； seq id no:19：
[0068]
masmdkvfagyarrqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegsrfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpitfldgmpvnggqigpitkfiwdgywamhydaaysfeidynern。
[0069]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经a13l、p177n、k180r、n181y、 l187y、g216w、t275w、k301r和d312f取代突变获得的氨基酸序列。
[0070]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:21所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性显著提高； seq id no:21：
[0071]
masmdkvfagyalrqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnnlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegswfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcde ifmctwaggimpittldgmpvnggqigpitkriwdgywamhyfaaysfeidynern。
[0072]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经a13r、n138w、p177n、k180r、 n181y、l187y、g216r、t275w、t284w、k301r和d312l取代突变获得的氨基酸序列。
[0073]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:23所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性显著提高； seq id no:23：
[0074]
masmdkvfagyarrqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnwlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegsrfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpitwldgmpvnggqigpitkriwdgywamhylaaysfeidynern。
[0075]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经a13l、n138r、p177n、k180r、 n181y、l187y、g216r、t275w、t284w、k301r和d312l取代突变获得的氨基酸序列。
[0076]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:25所示的氨基酸序列，较野生型转氨酶的活性显著提高； seq id no:25：
[0077]
masmdkvfagyalrqailestettnpfakgiawvegelvplaeariplldqgfmhsdltydvpsv wdgrffrlddhitrleasctklrlrlplprdqvkqilvemvaksgirdafvelivtrglkgvrgtrpedi vnrlymfvqpyvwvmepdmqrvggsavvartvrrvppgaidntvrylqwgdyvrgmfeaadrgat ypfltdgdahltegsrfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvinaaeafgievrvefvpvelayrcdei fmctwaggimpitwldgmpvnggqigpitkriwdgywamhylaaysfeidynern。
[0078]
优选地，所述转氨酶突变体包括seq id no:1所示的氨基酸序列经a13r、n138r、
ctataacgaacgtaactaa。
[0089]
seq id no:4为seq id no:3所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0090]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgatcc gaccgtgaagaacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgac cgaaggtagcctgtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0091]
seq id no:6为seq id no:5所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0092]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgatcc gaccgtgaagtacctgcagtggggcgacctggttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgacc gaaggtagcctgtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0093]
seq id no:8为seq id no:7所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0094]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtg
cgattgatcc gaccgtgcgtaacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgacc gaaggtagcctgtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcaccaccgcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0095]
seq id no:10为seq id no:9所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0096]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataa caccgtgcgttacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgacc gaaggtagcggctttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0097]
seq id no:12为seq id no:11所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0098]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataa caccgtgaagtacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgacc gaaggtagcctgtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0099]
seq id no:14为seq id no:13所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0100]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaac
caccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataa caccgtgcgtaacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgacc gaaggtagccgttttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0101]
seq id no:16为seq id no:15所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0102]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcggcgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtggg tggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccg tttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagat ggttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacat gtttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataa caccgtgcgttacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgacc gaaggtagcctgtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcgga ggcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccc tggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagaaaatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgac tataacgaacgtaactaa。
[0103]
seq id no:18为seq id no:17所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0104]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcgctgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtgggt ggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccgt ttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagatg gttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacatg tttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataac accgtgcgttacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgaccg aaggtagctggtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcggag g
cgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccct ggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagcgtatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgact ataacgaacgtaactaa。
[0105]
seq id no:20为seq id no:19所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0106]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcgcgtcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtgggt ggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccgt ttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagatg gttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacatg tttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataac accgtgcgttacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgaccg aaggtagccgttttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcggag gcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattacctttctg gatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagtttatctgggacggctactgggcgatgcactacgatgcggcgtatagctttgagattgactat aacgaacgtaactaa。
[0107]
seq id no:22为seq id no:21所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0108]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcgctgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtgggt ggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccgt ttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagatg gttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaacaacctgtacatg tttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataac accgtgcgttacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgaccg aaggtagctggtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcggag gcgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattaccaccct ggatggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagcgtatctgggacggctactgggcgatgcactactttgcggcgtatagctttgagattgacta taacgaacgtaactaa。
[0109]
seq id no:24为seq id no:23所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0110]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcgcgtcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtgggt ggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccgt ttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtg
acgaacgtaactaa。
[0115]
seq id no:30为seq id no:29所示的转氨酶突变体的编码基因：
[0116]
atggcgagcatggacaaagtgtttgcgggttatgcgctgcgtcaggcgatcctggagagcaccgaaaccaccaacccgtttgcgaaaggcattgcgtgggt ggaaggtgaactggttccgctggcggaggcgcgtatcccgctgctggaccaaggtttcatgcacagcgacctgacctatgatgtgccgagcgtttgggatggccgt ttctttcgtctggacgatcacatcacccgtctggaagcgagctgcaccaaactgcgtctgcgtctgccgctgccgcgtgaccaggtgaagcaaattctggtggagatg gttgcgaaaagcggtatccgtgatgcgttcgtggaactgattgttacccgtggtctgaaaggcgttcgtggtacccgtccggaggacatcgtgaactggctgtacatgt ttgttcagccgtatgtgtgggttatggaaccggatatgcagcgtgtgggtggcagcgcggtggttgcgcgtaccgtgcgtcgtgttccgccgggtgcgattgataaca ccgtgcgttacctgcagtggggcgactacgttcgtggcatgtttgaggcggcggatcgtggcgcgacctacccgtttctgaccgacggtgatgcgcacctgaccga aggtagctggtttaacatcgtgctggttaaggacggtgtgctgtataccccggatcgtggcgtgctgcaaggtgttacccgtaaaagcgttatcaacgcggcggagg cgtttggtattgaagtgcgtgttgaatttgtgccggttgagctggcgtaccgttgcgacgaaattttcatgtgcacctgggcgggtggcatcatgccgattacctttctgg atggcatgccggttaacggtggccagatcggtccgattaccaagtttatctgggacggctactgggcgatgcactacctggcggcgtatagctttgagattgactataa cgaacgtaactaa。
[0117]
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括本发明第二方面所述的核酸分子。
[0118]
第四方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞表达本发明第一方面所述的转氨酶突变体。
[0119]
优选地，所述重组宿主细胞的基因组中整合有本发明第二方面所述的核酸分子。
[0120]
优选地，所述重组宿主细胞含有本发明第三方面所述的重组表达载体。
[0121]
第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的转氨酶突变体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0122]
(1)将第二方面所述的核酸分子连接入表达载体，构建重组表达载体；
[0123]
(2)将所述重组表达载体转化感受态细胞，进行抗性筛选，获得阳性克隆菌体；
[0124]
(3)对阳性克隆菌体进行抗性筛选和诱导培养，收集菌体进行破碎，得到转氨酶突变体粗酶液。
[0125]
优选地，所述方法还包括对粗酶液进行纯化、得到纯化的转氨酶突变体的步骤。
[0126]
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括seq id no:1所示的野生型转氨酶、seq id no: 3所示的转氨酶突变体、seq id no:5所示的转氨酶突变体、seq id no:7所示的转氨酶突变体、seq idno:9所示的转氨酶突变体、seq id no:11所示的转氨酶突变体、seq id no:13所示的转氨酶突变体、 seq id no:15所示的转氨酶突变体、seq id no:17所示的转氨酶突变体、seq id no:19所示的转氨酶突变体、seq id no:21所示的转氨酶突变体、seq id no:23所示的转氨酶突变体、seq id no:25所示的转氨酶突变体、seq id no:27所示的转氨酶突变体或seq id no:29所示的转氨酶突变体中的任意一种或至少两种的组合。
[0127]
优选地，所述组合物包括酶粉、酶液或细胞中的任意一种。
[0128]
第七方面，本发明提供了一种(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的制备方法，所述方
法包括：
[0129]
将4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮、第六方面所述的组合物、磷酸吡哆醛(plp)、异丙胺和/或异丙胺盐酸盐、助溶剂和缓冲液混合，反应得到(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，反应机理如图1所示，在助溶剂和缓冲溶液混合液中，在转氨酶和磷酸吡哆醛(plp)的作用下，异丙胺的氨基转移至化合物1上形成化合物2，化合物2在该反应条件下自发关环，且在转氨酶和磷酸吡哆醛(plp)的作用下形成化合物3。
[0130]
优选地，所述反应的时间为12～48h，例如可以是12h、18h、24h、30h、36h、42h或48h。
[0131]
优选地，所述反应的温度为25～50℃，例如可以是25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃。
[0132]
优选地，所述4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮的浓度为1～100g/l，例如可以是1g/l、10g/l、20g/l、 30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l或100g/l。
[0133]
优选地，所述组合物的浓度为1～100g/l。
[0134]
优选地，当所述组合物为转氨酶酶粉时，浓度为1～10g/l，例如可以是1g/l、2g/l、4g/l、6g/l、 8g/l或10g/l；当所述组合物为转氨酶酶液时，浓度为3～40g/l，例如可以是3g/l、10g/l、15g/l、20 g/l、25g/l、30g/l、35g/l或40g/l；当所述组合物为含有转氨酶的细胞时，浓度为10～100g/l，例如可以是10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l或100g/l。
[0135]
优选地，所述磷酸吡哆醛的浓度为0.01～1g/l，例如可以是0.01g/l、0.05g/l、0.1g/l、0.15g/l、0.2 g/l、0.25g/l、0.3g/l、0.35g/l、0.4g/l、0.45g/l、0.5g/l、0.55g/l、0.6g/l、0.65g/l、0.7g/l、0.75g/l、 0.8g/l、0.85g/l、0.9g/l、0.95g/l或1g/l。
[0136]
优选地，所述异丙胺和/或异丙胺盐酸盐的浓度为1～110g/l，例如可以是1g/l、10g/l、20g/l、30g/l、 40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l或110g/l。
[0137]
优选地，所述助溶剂包括乙醇、乙腈或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合，优选为二甲基亚砜。
[0138]
优选地，所述二甲基亚砜的体积浓度为10～50％v/v，例如可以是10％vv、15％vv、20％vv、25％ vv、30％vv、35％vv、40％vv、45％vv或50％vv。
[0139]
优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和/或三乙醇胺-盐酸缓冲液。
[0140]
优选地，所述缓冲液的ph为7.0～9.0，例如可以是7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。
[0141]
第八方面，本发明提供了第一方面所述的转氨酶突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述的重组宿主细胞或第六方面所述的组合物在制备(r)-2-(2,5-二氟苯基) 吡咯烷中的应用。
[0142]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0143]
(1)本发明通过对野生型转氨酶第13～312位氨基酸进行取代突变，获得的转氨酶突变体具有显著增强的转氨酶活性，能够高效催化4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，提高了(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成效率；
[0144]
(2)本发明的转氨酶突变体的制备方法简单、产率较高，纯化前的粗酶液和纯化后的高纯度转氨酶突变体均具有高效的转氨酶活性，可用于(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成；
[0145]
(3)本发明的(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成方法无需使用昂贵或危险的化学催化剂，不需要构型翻转，反应条件温和，工艺简单，提高了生产效率及安全性，降低了生产成本，适合应用于大规模工业化生产，在制备拉罗替尼关键手型中间体(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷、以及制备拉罗替尼方面具有重要的应用前景。
附图说明
[0146]
图1为(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成路线图；
[0147]
图2为4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮标准品的反相非手性hplc图谱；
[0148]
图3为(r，s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷标准品的反相非手性hplc图谱；
[0149]
图4为(r，s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的正相手性hplc图谱；
[0150]
图5为(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的正相手性hplc图谱；
[0151]
图6为实施例2反应中控的反相非手性hplc图谱；
[0152]
图7为实施例5合成的(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的正相手性hplc图谱；
[0153]
图8为实施例5合成的(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的ms图谱。
具体实施方式
[0154]
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0155]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0156]
实施例1 r型-转氨酶的表达
[0157]
(1)将来源于土曲霉菌aspergillus terreus的野生型转氨酶的编码基因seq id no:2送至南京金斯瑞公司进行密码子优化和全基因合成，连接入质粒pet30a(+)中；将重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)获得含有转化成功的重组菌的菌液，将菌液涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板上，置于37℃下培养过夜；挑取转化子进行测序验证，将验证正确的转化子命名为e.coli bl21/pet30a-no.2。
[0158]
(2)将上述重组菌e.coli bl21/pet30a-no.2接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，置于37℃下培养过夜；取1ml菌液接种于125ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，置于37℃下培养6h，然后加入125μl 1m iptg，25℃下诱导过夜；离心(4000rpm，4℃，10min)收集菌体，加入4倍体积的pbs缓冲液(ph＝7.0)重悬，重悬后对细胞进行超声破碎，再将溶液进行冷冻干燥，获得野生型转氨酶酶粉，野生型转氨酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0159]
实施例2 r型-转氨酶的活力检测
[0160]
取10mg实施例1制备的野生型转氨酶酶粉，与1mg磷酸吡哆醛(plp)、11mg异丙胺盐酸盐(ata)、 100μl二甲基亚砜和900μl pbs缓冲液(ph＝8.0)混合，随后加入10mg 4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1
-ꢀ
酮(4-chloro-1-(2,5-difluorophenly)butan-1-one)，置于35℃下振荡过夜，反应路线图如图1所示；
no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq idno:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no: 23、seq id no:25、seq id no:27或seq id no:29所示。
[0175]
不同转氨酶突变体的活性检测结果见表1。
[0176]
表1转氨酶突变体的突变位点与活性检测
[0177][0178][0179]
注：在酶板筛选中，统计数据表示如下：
[0180]
+表示该突变体在酶板筛选中测得转化率为0～10％；
[0181]
++表示该突变体在酶板筛选中测得转化率为10％～20％；
[0182]
+++表示该突变体在酶板筛选中测得转化率为20％～30％；
[0183]
++++表示该突变体在酶板筛选中测得转化率为30％～40％；
[0184]
+++++表示该突变体在酶板筛选中测得转化率为40％～50％。
[0185]
实施例5转氨酶突变体的活力检测
[0186]
取0.2g实施例4筛选的转氨酶突变体seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27或seq id no: 29中的任一种酶粉，与10mg磷酸吡哆醛、1.1g异丙胺盐酸盐、4ml二甲基亚砜和16ml pbs缓冲液 (ph＝8.5)混合，随后加入1g 4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮，于40℃下振荡24～48h；
[0187]
取100μl反应液加入到900μl乙腈中充分振荡，使用0.22μm过滤膜过滤，进行hplc分析；
[0188]
转化率结果如表1所示。
[0189]
表1
[0190]
酶转化率％
seq id no:2396.7％seq id no:2598.3％seq id no:2798.9％seq id no:2997.3％
[0191]
以seq id no:27酶粉催化反应为例，待转化率大于95％后，用35％盐酸调节ph至2～3，室温搅拌 1h；过滤，滤液用2m naoh溶液调节ph至9～10，用1倍体积乙酸异丙酯萃取3次后合并有机相，用1 倍体积10％nacl溶液洗涤有机相，再经无水硫酸钠干燥后浓缩得0.8g油状液体，即为(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。
[0192]
取样送正相手性hplc分析，结果如图7所示，(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的保留时间为5.747 min，(s)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的保留时间为6.670min，(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度为99.37％；取样送lc-ms分析，结果如图8所示，ms中[m+1]＝184.1，(r)-2-(2,5-二氟苯基) 吡咯烷的分子量为183.20。
[0193]
综上所述，本发明对seq id no:1所示的野生型转氨酶的第13～312位氨基酸中的一个或几个氨基酸进行取代突变，获得的转氨酶突变体可以高效催化4-氯-1-(2,5-二氟苯基)丁-1-酮合成(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，在(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷以及拉罗替尼的工业化生产领域具有重要意义。
[0194]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。