本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种利用白酒糟生产胶冻样芽孢杆菌的技术方法。
背景技术：
胶冻样芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)是一种能分解硅酸盐矿物的细菌，国内一些学者也把它称为硅酸盐细菌。长期以来对于这个种的特性一直有不同的意见，因此其分类地位、名称直到1998年才得到国际上承认。其能分解长石、云母等铝硅酸盐类原生态矿物，使土壤中难溶性k、p、si等转变为可溶性的，供植物生长利用。同时还可以产生多种生物活性物质促进植物生长。大量田间试验表明，以胶冻样芽孢杆菌为主要成分的生物钾肥在缺钾土壤上对各种农作物表现出较好的增产效果。我国钾肥资源严重不足，国家每年需大量外汇进口无机钾肥。因此，开发利用生物钾肥不仅可以保护生态环境，也能带来较好的经济效益。近年来也有研究表明，该菌产生的荚膜多糖是很好的生物絮凝聚剂，0.1ml/l的多糖对高岭土可起到99.6％的絮凝效果。但目前对于胶冻样芽孢杆菌的研究主要集中在解钾强度及实际应用效果方面，而对于发酵条件的研究并不多。
微生物菌剂，绝大部分产品都是以活菌发挥作用的，有效的活菌数是衡量微生物菌剂品质的重要指标。产品中必须含有相当数量的活菌数才能达到相应的效果。我国对各种正式批准生产的菌剂都有明确的有效活菌数量和用量的规定。但是微生物菌剂随着保存时间的延长，活菌数量不断减少，在一定时期内，其有效活菌数降低，影响微生物制剂的使用效果。芽孢杆菌因其独特的营养体-芽孢-营养体的生活周期史，及其具有抵抗热、干燥、辐射、酸、碱等不良环境的生理特性，能延长微生物菌剂的保存期。因此，研究提高胶冻样芽孢杆菌芽孢率的发酵方法，对延长微生物菌剂的保藏期，具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的提供一种进一步降低成本、提高发酵单位、解决现有技术中发酵方法芽孢率低的问题的发酵方法。
本发明提供一种利用白酒糟生产胶冻样芽孢杆菌的技术方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将放置在4℃冰箱内保藏的胶冻样芽孢杆菌转接至含有白酒糟的固体基础培养基中，恒温培养；所述白酒糟为经过干燥处理过的白酒糟；
(2)液体培养：冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，按照液体基础培养条件进行培养。
作为本发明的进一步改进，步骤(1)中固体培养基的成分，按质量份数计，包括营养琼脂30-50份，无水氯化钙0.05-0.15份，七水硫酸镁0.1-0.5份，四水氯化锰0.2-0.7份，氯化钠0.5-1.5份，硫酸锰0.05-0.15份、白酒糟100-150份。
作为本发明的进一步改进，步骤(1)中接种量为4％。
作为本发明的进一步改进，固体培养基的初始ph为6，培养温度为40-60℃，培养20-30min。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中液体种子培养基的成分，按质量份数计，包括营养肉汤150-200份，蜜糖50-80份，无水氯化钙0.6-0.8份，七水硫酸镁1-4份，硫酸锰2-5份，磷酸二氢钾0.15-0.4份，蒸馏水100-150份。
作为本发明的进一步改进，液体基础培养条件为：转速100-150r/min，温度为50-70℃，初始ph为5.5。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中接种量为2％，装液量为100ml/250ml，培养3-5d。
本发明公开了以下技术效果：
无机盐对菌体数量和芽孢数量的影响十分明显。k+是细胞中重要的阳离子之一，它能参与细胞内许多物质运输系统的组成，同时也是多种酶的激活剂；ca2+存在于细胞中，控制细胞的生理状态，调节质膜通透性，维持细胞体内的渗透压，是一些酶的激活剂，在本发明中加入mg2+,能够促进芽孢的大量形成；mg2+能促进碳源分解，加速菌体能量代谢，且有助于细胞维持有氧氧化作用；mn2+能激活微生物细胞中许多酶反应。在本发明中，添加适量的k+、ca2+、mg2+、mn2+能促进胶冻样芽孢杆菌的菌体生长和芽孢的形成。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中所用的胶冻样芽孢杆菌保藏编号为cgmccno.4667，购自于中国微生物保藏中心。
本发明中所述份数如无特别说明，均按质量份数计。
实施例1
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在45℃恒温培养20min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂30g，无水氯化钙0.05g，七水硫酸镁0.1g，四水氯化锰0.2g，氯化钠0.5g，硫酸锰0.05g，白酒糟100g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤150g，蜜糖50g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁1g，硫酸锰2g，磷酸二氢钾0.15g，蒸馏水100ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速100r/min，温度为50℃，培养3d。
实施例2
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在45℃恒温培养20min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂40g，无水氯化钙0.1g，七水硫酸镁0.3g，四水氯化锰0.4g，氯化钠0.8g，硫酸锰0.08g，白酒糟110g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤180g，蜜糖80g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁3g，硫酸锰3g，磷酸二氢钾0.20g，蒸馏水120ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速120r/min，温度为60℃，培养3d。
实施例3
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，55℃恒温培养30min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂50g，无水氯化钙0.15g，七水硫酸镁0.5g，四水氯化锰0.7g，氯化钠1.5g，硫酸锰0.15g，白酒糟120g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤200g，蜜糖80g，无水氯化钙0.8g，七水硫酸镁4g，硫酸锰5g，磷酸二氢钾0.3g，蒸馏水150ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速130r/min，温度为70℃，培养5d。
实施例4
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在55℃恒温培养25min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂50g，无水氯化钙0.1g，七水硫酸镁0.5g，四水氯化锰0.7g，氯化钠1.5g，硫酸锰0.1g，白酒糟150g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤200g，蜜糖75g，无水氯化钙0.8g，七水硫酸镁1g，硫酸锰2g，磷酸二氢钾0.15g，蒸馏水150ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速100r/min，温度为70℃，培养4d。
实施例5
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在60℃恒温培养30min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂35g，无水氯化钙0.10g，七水硫酸镁0.4g，四水氯化锰0.6g，氯化钠1.2g，硫酸锰0.12g，白酒糟120g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤180g，蜜糖75g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁4g，硫酸锰4g，磷酸二氢钾0.35g，蒸馏水140ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速100r/min，温度为65℃，培养4d。
对比例1
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在45℃恒温培养20min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂30g，无水氯化钙0.05g，七水硫酸镁0.1g，氯化钠0.5g，白酒糟120g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤150g，蜜糖50g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁1g，硫酸锰2g，磷酸二氢钾0.15g，蒸馏水100ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速100r/min，温度为50℃，培养3d。
对比例2
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在45℃恒温培养20min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂45g，无水氯化钙0.08g，七水硫酸镁0.3g，四水氯化锰0.5g，氯化钠0.5g，硫酸锰0.05g，初始ph为7。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤150g，蜜糖50g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁1g，硫酸锰2g，磷酸二氢钾0.15g，蒸馏水100ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速100r/min，温度为50℃，培养3d。
对比例3
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在45℃恒温培养20min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂30g，无水氯化钙0.05g，七水硫酸镁0.1g，四水氯化锰0.2g，氯化钠0.5g，硫酸锰0.05g，白酒糟120g，初始ph为8。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤150g，蜜糖50g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁1g，硫酸锰2g，磷酸二氢钾0.15g，蒸馏水100ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为5.5，转速100r/min，温度为50℃，培养3d。
对比例4
将放置在4℃冰箱内保藏的枯草芽孢杆菌转接至固体基础培养基中，接种量为4％，在45℃恒温培养20min，所述固体基础培养基的成分为营养琼脂30g，无水氯化钙0.05g，七水硫酸镁0.1g，四水氯化锰0.2g，白酒糟120g，氯化钠0.5g，硫酸锰0.05g，初始ph为6。
冲洗固体平板，将活化后菌种转接至液体种子培养基中，液体种子培养基的成分为营养肉汤150g，蜜糖50g，无水氯化钙0.6g，七水硫酸镁1g，硫酸锰2g，磷酸二氢钾0.15g，蒸馏水100ml，接种量为2％，装液量为100ml/250ml锥形瓶，培养条件为摇床培养，初始ph为7，转速100r/min，温度为50℃，培养3d。
镜检：
利用五点取样法从固体平板中取菌至无菌离心管内，制备菌悬液摇匀待用。
液体培养：吸取200μl菌体至无菌离心管内，制成菌悬液摇匀待用。
蘸取菌悬液至载玻片上，火焰固定，滴适量孔雀石绿，染色5min，冲洗，待干后滴入适量番红染液染色5min，冲洗晾干待用。
在100倍油镜下记录细菌数与芽孢数，计算芽孢产率。芽孢产率计算方法见公式(1)。
式中：a为芽孢产率，％；a为芽孢个数，108cfu/ml；b为菌体个数，108cfu/ml。
实施例1-5和对比例1-4的芽孢产率见表1。
表1
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。