一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域。更具体地，本发明涉及一种可特异性识别sars-cov-2病毒的n蛋白的单克隆抗体及其在新型冠状病毒检测中的应用，本发明的抗体在新型冠状病毒感染的筛查，检测和预后评价中具有重要应用价值。

背景技术：

sars-cov-2主要通过飞沫、直接接触和被感染的物体传播，其潜伏时间为1到14天，并且也由无症状感染者传播。大多数感染者仅表现出轻度至中度的呼吸道症状，或根本不表现任何症状。只有5-10％的感染者显示出完全的严重呼吸综合征，称为冠状病毒病(covid)-19。此外，在年轻健康的个体中，covid-19的死亡率为0.2％，但随着年龄和合并症而增加，在80岁以上患有心脏病的人中死亡率最高。总体来看sars-cov-2的平均死亡率约为2％-4％左右，低于sars-cov的10％死亡率和mers-cov的35％死亡率。

核酸检测是检测病毒感染的病原学“金标准”，但这种检测方式对环境、运输、操作要求较高，呈现出特异性较强，灵敏度偏弱的特点，对感染病例检测的准确度只有30％～50％。而血清抗体检测可以作为对核酸检测很好的补充，以加快对疑似案例的筛查速度。此外，对于新冠肺炎出院患者核酸检测复阳病例，也可通过抗体检测的方式辨别。

相较于核酸检测，抗原检测方便、快速和低价等优势，而相较于抗体检测，抗原检测无窗口期，可对刚出现感染症状的患者进行及时检测。对于这种传染性很强的新冠病毒感染，提高检测便利程度和敏感度格外重要，而抗原检测具有目前抗体检测所不能替代的优势，预期冠状病毒感染和防治的态势将会是长期的，高敏感检测方法需求强烈，这也是实践“应检尽检，愿检尽检”策略的基础，已有诊断企业布局新冠抗原检测领域，高亲和力的配对抗体在抗原检测产品开发中尤为重要。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种可特异性识别sars-cov-2病毒n蛋白而不识别sars病毒n蛋白的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种分泌上述特异性抗体的杂交瘤细胞制备方法。

本发明的再一个目的是利用上述抗体开发基于抗原抗体结合，针对sars-cov-2病毒n蛋白的免疫学检测方法，包括双抗体夹心的酶联免疫吸附法和胶体金试纸条法。

本发明的第四个目的是提供一种将本抗体用于新型冠状病毒肺炎的免疫学检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体，其组成为包括

(a)轻链可变区

(i)包含seqidno：01所示氨基酸序列的cdr-h1区。

(ii)包含seqidno：02所示氨基酸序列的cdr-h2区。

(iii)包含seqidno：03所示氨基酸序列的cdr-h3区。

(b)重链可变区

(i)包含seqidno：04所示氨基酸序列的cdr-l1区。

(ii)包含seqidno：05所示氨基酸序列的cdr-l2区。

(iii)包含seqidno：06所示氨基酸序列的cdr-l3区。

在本发明的第二方面，提供了一种dna分子编码选自下组的蛋白质:取自上述六个cdr区的抗体重链序列和抗体轻链序列及其组合。

在本发明的第三方面，提供了含有上述编码本发明抗体dna的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述dna直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了将本抗体应用于新型冠状病毒sars-cov-2的n蛋白检测的方法，包括但不限于基于双抗体夹心原理的elisa检测试剂盒和胶体金检测试纸条。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明通过大规模的细胞融合和筛选得到一株分泌抗sars-cov-2-n抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤:

1)按照公布的sars-cov-2病毒n蛋白编码序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择n蛋白全长区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，利用真核细胞进行分泌表达，在其c端融合有组氨酸标签便于纯化，经基因合成后克隆进表达质粒载体pcdna3.4，转染expi293细胞进行培养，从培养基上清中分离和纯化表达产物用作免疫原和抗体筛选。

2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的b细胞，按常规方法，将b细胞与骨髓瘤细胞sp2/0株融合，然后利用常规的融合细胞hat筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆。

3)用于特异性识别sars-cov-2的n蛋白的抗体制备和筛选：2003年发生的sars病毒引发的非典型性肺炎(俗称“非典”)与2019年底发生的sars-cov-2感染引起的新型冠状病毒感染的肺炎(俗称“新冠”)的病原物在核酸序列和主要结构蛋白序列组成上都具有高度相似性，这增加了研制可鉴别二种病毒蛋白抗体的研发困难，在附图1的蛋白质序列比对结果中，genbank编号为mn908947.3的是由感染者中分离sars-cov-2病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，长度为422个氨基酸，genbank编号为ay278489.2的是2003年由sars感染者中分离sars-cov病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，二者序列一致性为90.5％，仅有少量散在的差异氨基酸，且连续差异氨基酸的长度在两个之内，按照抗原表位长度是4-7个氨基酸的一般规律，要获得可鉴别两种蛋白的抗体存在制备困难。同时，n蛋白本身是一个富含磷酸化修饰的蛋白，在实际检测前需要对血液或咽拭子样本进行热灭活，蛋白也会经历结构改变、部分基团修饰改变，本发明利用真核表达n蛋白获得与天然样本相似的磷酸化和糖基化修饰，并且经加热处理取得和样本处理同样的加工过程，使之更接近实际检测蛋白的状态，以此经处理的蛋白进行免疫和筛选，获得了高亲和力、高特异性和可识别热处理n蛋白的优质抗体。

本发明从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种:

1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离纯化所需单克隆抗体。

2)在动物腹腔内接种64360-52d1杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗体。本发明用腹水法制备的抗体经proteina/g柱亲和层析纯化得到的n单抗。

本发明的优点及有益效果

本发明获得的杂交瘤64360-52d1分泌产生的单克隆抗体，能特异性识别sars-cov-2病毒n蛋白，而不识别2003年发生的sars病毒的n蛋白，具有很高的特异性，可以区分两种病毒蛋白，按照序列同源性比较，也可以区分2004年-2005年发生的新型人类冠状病毒hcov-hku1和2012年引起中东呼吸综合症(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus)的mers-cov的冠状病毒。另一方面，该抗体可特异识别经过60℃热灭活的sars-cov-2病毒n蛋白，能用于sars-cov-2引起的新冠肺炎的筛查和检测。

附图说明:

图1：sars-cov-2和sars-cov病毒n蛋白序列比较

genbank编号为mn908947.3的是由感染者中分离sars-cov-2病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，genbank编号为ay278489.2的是2003年由sars感染者中分离sars-cov病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，二者序列一致性为90.5％。

图2：在expi293细胞中进行无血清培养和纯化的sars-cov-2病毒n重组蛋白图中m为分子量标记，1为培养基上清原样，2为培养基上清上样流穿，3和4分别是15mm咪唑洗脱产物，5-6是60mm咪唑洗脱产物，表达产物的大小约为56kda，使用12％sds-page凝胶分离。

图3：64360#52d1单克隆抗体用于elisa方法检测n蛋白利用本发明的单克隆抗体作为包被抗体，hrp标记兔抗n蛋白抗体为检测抗体，可以实现的重组n蛋白抗原检测浓度为50pg/ml。

图4：64360#52d1单克隆抗体用于免疫胶体金试纸检测n蛋白以胶体金标记兔抗n蛋白多抗，本发明的单克隆抗体作为捕获抗体，，三个示例的n蛋白浓度分别是0ng/ml，0.1ng/ml以及1ng/ml，本抗体方法可以检测的n蛋白最低浓度为0.1ng/ml。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1重组sars-cov-2病毒n蛋白免疫原制备

参照genbank中编号为mn908947.3的新型冠状病毒基因组序列中编码n蛋白的核苷酸序列合成完整的开放读码框区域，并将其克隆到质粒载体puc57之上(南京金斯瑞生物科技有限公司)，设计上游引物n-cov-nf:5’-ggatcgaattcgatgtctgataatg-3’和下游引物n-cov-nr:5’-acgctcgagttagtggtggtggtggtggtgggcctgagttgagtcagc-3’，通过上游引物引入ecori切点，通过下游引物引入组氨酸纯化标签和xhoi酶切位点，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。依照标准的核酸扩增过程，从质粒载体上扩增目的基因，经ecori/xhoi双酶切并回收后克隆入经同样双酶切的真核表达载体pcdna3.4(购自invitrogeninc)线性化片段，经测序鉴定后进行质粒制备，参照expi293^tmexpressionsystemkit(赛默飞舍尔科技(中国)有限公司，货号a14635)说明书进行expi293细胞转染和培养，维持细胞活力在70％以上，培养120小时后进行纯化。因重组的n蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样sds-page分离检测，附图2为融合有组氨酸标签的重组n蛋白的表达和纯化结果。重组n蛋白的纯度在90％以上，浓度约为1-1.5mg/ml，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2杂交瘤细胞系的建立和抗体筛选

一.动物免疫

将实施例1中的重组n蛋白，60℃灭活后用弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性balb/c小鼠六只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，依次编号为64360#a、64360#b、64360#c、64360#d、64360#e和64360#f。腹部皮下注射每只小鼠剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水温匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的peg1500(roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的imdm(sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min弃上清后，加入10ml血清(paa公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10×hat(sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％co2培养箱中培养。

三、阳性杂交瘤筛选及保存

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃培养箱中培养，co2浓度为5％。四、elisa筛选阳性杂交瘤细胞

在杂交瘤细胞培养3天后，细胞量大约占底面积2/3，加入200μl含饲养细胞和1％ht(sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次elisa筛选，得到与免疫原间接elisa检测od值高于0.5的杂交瘤作为阳性克隆进行后续培养。这些阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和ht)的24孔板培养。五天后取100μl上请进行第三次elisa筛选。筛选过程如下，取100μl上清用60℃热灭活的真核表达sars-cov-2病毒n蛋白(北京华大蛋白质研发中心有限公司，货号pt-00117)和原核表达的sars病毒n蛋白(北京华大蛋白质研发中心有限公司，货号pt-20304)为包被抗原进行elisa方法的特异性筛选。筛选时以pbs缓冲液稀释抗原蛋白至2μg/ml。每孔加入100μl抗原，4℃包被12小时，弃去溶液，洗涤液(含0.05％tween的pbs缓冲液)洗板3次后控干，每孔再加300μl的2％(v/w)牛血清蛋白作为封闭液，37℃温育3h,重复洗板3次，加入待鉴定的细胞培养上清，孵育筛选后封闭结束在酶标板孔内加入待测样本，37℃温育1h,洗板3次，每孔加入1：5000倍稀释的100μlhrp标记的羊抗小鼠抗体(购自)，37℃孵育1h后洗板3次，控干，每孔加入100μlltmb显色缓冲液，室温孵育8分钟后每孔加入50μl的h2so4(2m)终止反应，在酶标仪上读取450nm的吸光值。

六只小鼠经初步筛选获得可识别n蛋白的杂交瘤细胞260株，以64360#d的60个杂交瘤为例的筛选结果见表1，大多数杂交瘤细胞分泌的抗体可以同时识别两种不同的抗原，经过筛选惊异地发现两株杂交瘤细胞分泌的抗体可以特异性识别sars-cov-2病毒n蛋白，而不与sars病毒n蛋白结合。其中来自64360#d小鼠编号为52的杂交瘤具有最好的结合能力，此细胞株命名64360#52d1。

表1编号为64360#d小鼠制备杂交瘤特异性筛选

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

取对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵,1ml悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min小心吸出中间的腹水收集于离心管中用于纯化。抗体的纯化按照hitraprproteinaff(购自ge公司，货号17-5079-02)产品的说明书进行。

实施例4单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定

亚类鉴定时，用100mmpbs(ph7.4)稀释包被羊抗鼠igg(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/m1，每孔加100μl，4℃过夜后倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbs-t)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa和3％庶糖的pbs)，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加入100μl杂交瘤培养上清或纯化的抗体，37℃孵育1h后倾空液体，用pbs-t清洗3次。用封闭液1:1000稀释hrp标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或1:2000稀释hrp标记的羊抗鼠(igm，igg1,igg2a,igg2b，igg3，iga)抗体(southernbiotech公司)按照每孔100μl分别的体积分别加入待检抗体样品孔中，37℃孵育1h，倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加50μl含0.15％abts(southernbiotech公司，货号0202-1)和0.03％h2o2的柠檬酸缓冲液(ph4.0)显色，10min内测定405nm波长的吸光度值。结果显示，本发明单克隆抗体64360#52d1为igg1亚型，其轻链为κ轻链。

二、亲和常数测定

按照2μg/m1的浓度包被重组n蛋白，100μ1/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭，pbs-t洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp标记的羊抗鼠二抗1:20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl含0.1％tmb(sigma公司)和0.03％h2o2的柠檬酸磷酸缓冲液显色10min，加入50μl0.5m的硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值，利用数据分析作图软件graphpadprismv8绘出抗体稀释浓度和od450对应曲线，计算亲和力，得到64360#52d1抗体亲和常数为5.6×10¹⁰m^-1。

实施例5抗体的可变区序列测定

培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。trizol法提取杂交瘤细胞总rna，取9μl总rna，加入2.5μloligo(dt)12–18primer(10mm)，及5μldntps，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μlrtbuffer(5x)，2.5μldtt(0.1m)及1μl逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cdna保存在-20℃。将获得的第一链cdna进行pcr扩增，在50μl反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中mhv.b1直至mhv.b12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物mhc.f组合用于扩增重链可变区基因。

mhv.b1：5’-gatgtgaagcttcaggagtc-3’

mhv.b2：5’-caggtgcagctgaaggagtc-3’

mhv.b3：5’-caggtgcagctgaagcagtc-3’

mhv.b4：5’-aggttactctgaaagagtc-3’

mhv.b5：5’-gaggtccagctgcaacaatct-3’

mhv.b6：5’-gaggtccagctgcagcagtc-3’

mhv.b7：5’-caggtccaactgcagcagcct-3’

mhv.b8：5’-gaggtgaagctggtggagtc-3’

mhv.b9：5’-gaggtgaagctggtggaatc-3’

mhv.b10：5’-gatgtgaacttggaagtgtc-3’

mhv.b12：5’-gaggtgcagctggaggagtc-3’

mhc.f：5’-ggccagtggatagtcagatgggggtgtcgttttggc-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中mkv.b1直至mkv.b10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物mkc.f组合用于扩增kappa轻链的可变区基因。

mkv.b1：5’-gatgttttgatgacccaaact-3’

mkv.b2：5’-gatattgtgatgacgcaggct-3’

mkv.b3：5’-gatattgtgataacccag-3’

mkv.b4：5’-gacattgtgctgacccaatct-3’

mkv.b5：5’-gacattgtgatgacccagtct-3’

mkv.b6：5’-gatattgtgctaactcagtct-3’

mkv.b7：5’-gatatccagatgacacagact-3’

mkv.b8：5’-gacatccagctgactcagtct-3’

mkv.b9：5’-caaattgttctcacccagtct-3’

mkv.b10：5’-gacattctgatgacccagtct-3’

mkc.f：5’-ggatacagttggtgcagcatc-3’

其余dntps及缓冲液均按照常规加入，最后加入cdna模板1μl和1u热启动taqdna聚合酶。设置pcr扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行25个循环扩增，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μlpcr产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，将所得重链可变区和轻链可变区分别克隆至pmd18t质粒载体(takara)后测序，得到的抗体重链可变区的dna序列利用在线分析工具，分析其骨架区和抗原决定簇(cdr)序列和推导的氨基酸序列，此抗体可变区序列可以通过基因克隆的方式在其下游分别加入重链、轻链的恒定区，利用遗传重组方式获得可以重组表达抗体片段的表达载体在真核细胞中表达重组的完整抗体或片段，也可以将重链和轻链可变区利用一段链间连接肽(如ggggsggggsggggs)的编码序列连接后构建为单链抗体在适宜的宿主细胞中表达抗体片段。

实施例6本发明单克隆抗体的应用效果-双抗体夹心elisa方法检测新型冠状病毒

本发明的双抗夹心elisa试剂盒包括sars-cov-2n蛋白标准品、包被于酶标板上的64360#52d1单克隆抗体，作为检测抗体的hrp标记的兔抗sars-cov-2n蛋白多克隆抗体(购自北京华大蛋白质研发中心有限公司)，其他辅助试剂包括样本稀释液、封闭液、显色液及终止液。

经辣根过氧化物酶(hrp)标记的sars-cov-2检测抗体的制备方法:

1、称取6mghrp(辣根过氧化物酶，购自sigma)溶于1ml三蒸水中，每ml溶液逐滴缓慢加入0.30ml新配的0.1mnaio4溶液，4℃避光搅拌35min，活化hrp，颜色由棕色变为绿色。上述溶液装入透析袋中，用0.01m,ph4.4的醋酸钠缓冲液，4℃透析过夜，颜色变为棕绿色。在4℃，10000rpm离心10min去除产生的微量沉淀，将透析后的hrp加入0.16m乙二醇(每毫克酶加入0.1ml),4℃避光搅拌1h，然后加入纯化后的多抗，两者混匀后用0.05m的碳酸缓冲液(ph9.5)4℃透析过夜，得到hrp-抗体混合液。向hrp-抗体混合液中加入0.1ml的5mg/ml的nabh4溶液(每毫克酶加入0.1-0.2mg的nab4，4℃避光搅拌3h。逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃避光搅拌2h，4℃,10000rpm，离心10min，弃上清。pbs溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶标记的兔多抗。

二、sars-cov-2-n蛋白含量的检测方法

1、以包被缓冲液按照2μg/ml的浓度在96孔酶标板中每孔加入100μl本发明的64360#52d1单克隆抗体作为捕获抗体，4℃包被12h后用洗涤液(pbs-t)洗板3次，每孔再加300μl2％(v/w)牛血清蛋白作为封闭液，37℃温育3h进行封闭，封闭结束后倾去液体，用洗涤液(pbs-t)洗板3次，每孔内加入待测样本和依次为10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml及0ng/ml浓度的重组n蛋白作为标准品，37℃孵育1h后倾去液体，洗涤3次，按100μl/孔加入预先制备的辣根过氧化物酶标记的抗sars-cov-2n多抗作为检测抗体，37℃孵育1h，洗板6次，每孔加入100μl显色剂tmb溶液，室温孵育8min后按50μl/孔加入2m的h2so4终止反应，读取od450值，依据标准曲线计算待检样本中的n蛋白浓度，由附图3的标准曲线结果显示本发明单克隆抗体制备的elisa检测试剂盒检出浓度为50pg/ml。

实施例7、sars-cov-2病毒n蛋白检测免疫胶体金试纸条的制备

1、胶体金的制备

用5毫升微量移液器取3毫升1％四氯金酸于500ml的圆底烧瓶中，量取297ml的超纯水加入烧瓶中，配制成0.01％的四氯金酸反应液，充分搅拌混匀，置于磁力加热搅拌器上，加热煮沸。充分搅拌后快速加入3ml柠檬酸铵溶液，氯金酸水溶液由金色变为灰色，约2分钟后变成紫红色，继续煮沸5分钟后停止加热，待胶体金冷却后，分装于玻璃试剂瓶中。

2、免疫金的制备

根据需标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质质量。用0.1m的碳酸钾或0.1m盐酸调节胶体金的ph值为7.8，在电磁搅拌器下，将购自北京华大蛋白质研发中心有限公司的兔抗sars-cov-2病毒n蛋白多克隆抗体逐滴加入胶体金溶液中，抗体和胶体金反应约5分钟后，在磁力搅拌器下加入终浓度为1％的牛血清蛋白(bsa)，10分钟后，加入终浓度为0.3％的peg2000。继续反应1小时。将标记好的胶体金溶液于2000rpm，4℃离心10分钟，取上清在10000r/min，4℃离心30分钟，弃去上清，将沉淀以原体积的0.01m的pbs(ph8.2)溶解，重复离心三次，最后一次小心弃去上清，沉淀溶于原体积的1/50的pbs缓冲液(内含1％bsa)中，得到免疫金。

3、试纸条制备

将实施例3制备的64360#52d1单克隆抗体装入蛋白微量喷膜系统，在硝酸纤维素膜上按1μl/cm的量划线，得到检测线，将羊抗鼠igg抗体(sigma，m4280)包被液装入蛋白微量喷膜系统，在硝酸纤维素膜上按1μl/cm的量划线，得到质控线，37℃包被2小时，37℃封闭30分钟，包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，密闭保存待用。

制备结合垫时，调整免疫金的od值为30，将免疫金加入机器左边的塑料容器内，将免疫金喷涂在玻璃纤维结合垫上，喷完结合垫后，置于37℃烘箱中干燥30分钟，将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。

制备检测卡时，在塑料底板的中央撕去覆于上面的胶带，贴上包被好抗体的硝酸纤维素膜，撕去塑料板中央下面的宽为5毫米的胶带，贴上喷上胶体金的结合垫，结合垫前端的硝酸纤维素膜重叠2毫米，撕去塑料板最下面宽为20毫米的胶带，贴上经过预处理的样品垫，样品垫的前端与结合垫重叠约5毫米，撕去塑料底板的最上端约为25毫米的胶带，贴上吸水纸，吸水纸与硝酸纤维素膜重叠约2毫米，组装完成后，将各配件压实，将组装好的大卡用切条机切成3毫米宽的试纸条，装入测试卡中，得到sars-cov-2病毒n蛋白检测免疫胶体金试纸条，进行检测时对于来源于咽拭子或血液样本首先经过60℃保温30分钟灭活病毒。

配制抗原稀释液用于样本蛋白处理，称取磷酸氢二钠2.9克，磷酸二氢钠0.28克，加入纯化水1000ml，另称取酪蛋白2.5克，4ml曲拉通100加入上述溶液。待检样本和纯化的重组n蛋白以抗原稀释液进行稀释后滴加到试纸条的样品结合垫，数分钟后可以观测到在标准品测试试纸条和部分样本试纸条的检测线和质控线出现棕红色条带，表明检测结果为阳性，根据标准样品连续稀释的检测结果，本试纸条的检测敏感度为100pg/ml(附图4)。

序列表

<110>北京华大蛋白质研发中心有限公司

<120>一种用于检测sars-cov-2病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用

<130>2

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>musmusculus

<400>1

lysalaserglnservalasptyraspglyaspsertyrleuasn

151015

<210>2

<211>7

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15

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15

<210>4

<211>6

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15

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151015

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15

<210>7

<211>425

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<213>coronavirus

<400>7

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151015

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202530

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505560

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65707580

aspaspglnileglytyrtyrargargalathrargargilearggly

859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

serserargasnserthrproglyserserargglythrserproala

195200205

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210215220

aspargleuasnglnleugluserlysmetserglylysglyglngln

225230235240

glnglnglyglnthrvalthrlyslysseralaalaglualaserlys

245250255

lysproargglnlysargthralathrlysalatyrasnvalthrgln

260265270

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275280285

glngluleuileargglnglythrasptyrlyshistrpproglnile

290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

aspasppheserlysglnleuglnglnsermetserseralaaspser

405410415

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420425