一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法及应用与流程

1.本发明属于微生物低温培养技术领域，具体涉及一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法及应用。


背景技术：

2.近年来，随着我国对生态文明建设的高度重视及对城市绿化事业的大力支持，城市绿地建设如雨后春笋般的发展与壮大。
3.城市绿地不仅为居民休闲娱乐提供了活动的场所，而且还可以通过释放负离子、阻滞空气中的大气颗粒污染物、降温增湿、降噪、舒缓情绪、净化杀菌等生态保健方面改善城市环境条件、促进居民心理健康、提高环境质量，在城市生态环境建设中占据着不可取代的重要地位。目前，众所周知城市绿地对环境具有净化杀菌作用，但是对于不同的绿地类型对于周边环境实际存在的净化作用定量化的关系，以及结合微生物实验培养方法及对菌落数记录的方法改进上则鲜有少闻。
4.然而由于夏季高温，室内室外温差不大，若使用常规微生物细菌高温培养(37摄氏度，48小时)的模式，不仅会造成短时间内菌落生长过快，而且易成团成块状，不仅不易计数，而且无法满足大量样本同时检测需求，因此提供一种接种后培养基的低温培养方法，主要是通过采用低温培养使微生物菌落缓慢生长，并通过分批次的菌落计数方式来实现菌落数量记录清晰、准确的同时可满足于夏季大量样本同时检测的方法，进而提高了绿地减菌率计算的精度。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法及应用。
6.本发明所采用的技术方案为：一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法，所述培养方法主要包括以下步骤：
7.a、选取配制完成的备用培养基在预设高度下，将大气环境中的微生物进行接种采样，之后封闭培养皿；
8.b、将采样后的封闭培养皿置于25-26摄氏度下进行培养，培养过程中分批次统计菌落数。
9.作为优选地，所述步骤a中，选取配制完成的备用培养基在预设高度下，将大气环境中的微生物进行接种采样，预设高度为1.3-1.5m。
10.作为优选地，所述步骤a中，选取配制完成的备用培养基在预设高度下，将大气环境中的微生物进行接种采样，进行接种时长为3-8分钟，优选为5分钟。
11.作为优选地，所述步骤b中，将采样后的封闭培养皿置于预设低温下进行培养，所述培养时长为24-72小时，优选为36-48小时。
12.作为优选地，所述步骤a中，配制完成的备用培养基主要是由营养琼脂培养基和溶
剂混合配制而成。
13.作为优选地，所述营养琼脂培养基主要由以下质量份数的原料制备得到：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g和琼脂15g；
14.所述溶剂包括蒸馏水。
15.作为优选地，所述配制完成的备用培养基主要由营养琼脂培养基33g和水1000ml混合配制得到。
16.作为优选地，所述步骤a中，备用培养基在培养皿中的体积为25-30ml。
17.作为优选地，所述步骤b中，分批次统计菌落数时采用第一次记录时间为培养24小时，之后每批次相隔24小时进行记录。
18.权利要求1所述的一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法的应用，所述培养方法用于在城市绿地减菌效应的空气质量指标与生态保健功能指标的评价。
19.本发明的有益效果为：
20.本发明提供了一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法及应用，该种微生物实验的低温培养方法是通过采用低温培养使微生物菌落缓慢生长，并通过分批次的菌落计数方式来实现菌落数量记录清晰、准确的同时可满足于夏季大量样本同时检测的方法。上述方法不仅能实现菌落数量记录清晰，并保证了准确无误，在满足大量样本的数据检测的同时，进而提高了绿地减菌率计算的精度，为城市绿地减菌效应的空气质量指标与生态保健功能指标的评价提供了科学依据。
附图说明
21.图1是该种微生物实验的低温培养方法实验检测数据各样地平均菌落数的结果示意图；
22.图2是该种微生物实验的低温培养方法实验检测数据各样地减菌率结果示意图。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
24.实施例1：
25.一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法，该培养方法主要包括以下步骤：
26.a、选取营养琼脂培养基(蛋白胨10.0克/l，牛肉浸粉3.0克/l，氯化钠5.0克/l、琼脂15.0克/l)按33.0克与1000ml蒸馏水配比混匀加热后分装至灭菌消毒后的三角瓶中，封口对培养基在121摄氏度的高压灭菌锅中进行灭菌30分钟。选用直径为9厘米的无菌培养皿，在无菌操作台中将灭菌后的培养液倾倒进入培养皿中，培养皿中培养液体积为25ml，封闭培养皿留作备用；
27.b、选取备用的装有培养基的培养皿在所设绿地环境中，打开培养皿盖，在预设高度为1.3米的高度中进行接种3分钟，之后封闭培养皿；
28.c、将采样后的封闭培养皿置于25摄氏度下进行培养36小时，期间每一次菌落计数的记录时间为24小时，并将第一批长出来的细菌菌落用记号笔在培养皿的底部标上
“○”
记号标记，记录个数；第二次记录的时间为48小时，并将第二批长出来的细菌用记号笔
“×”
记号标识记并记录个数；第三次数菌记录的时间为72小时，并将第三批长出来的细菌用记号笔“√”记号标识记，记录个数。
29.实施例2：
30.一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法，该培养方法主要包括以下步骤：
31.a、选取营养琼脂培养基(蛋白胨10.0克/l，牛肉浸粉3.0克/l，氯化钠5.0克/l、琼脂15.0克/l)按33.0克与1000ml蒸馏水配比混匀。将上述营养琼脂培养基加热后分装至灭菌消毒后的三角瓶中，封口对培养基在121摄氏度的高压灭菌锅中进行灭菌30分钟。选用直径为9厘米的无菌培养皿，在无菌操作台中将灭菌后的培养液倾倒进入培养皿中，培养皿中培养液体积为30ml，封闭培养皿留作备用；
32.b、选取备用的装有培养基的培养皿在所设绿地环境中，打开培养皿盖，在预设高度为1.5米的高度中进行接种8分钟，之后封闭培养皿；
33.c、将采样后的封闭培养皿置于26摄氏度下进行培养72小时，期间每一次菌落计数的记录时间为24小时，并将第一批长出来的细菌菌落用记号笔在培养皿的底部标上
“○”
记号标记，记录个数；第二次记录的时间为48小时，并将第二批长出来的细菌用记号笔
“×”
记号标识记并记录个数；第三次数菌记录的时间为72小时，并将第三批长出来的细菌用记号笔“√”记号标识记，记录个数。
34.实施例3：
35.一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法，该培养方法主要包括以下步骤：
36.a、选取营养琼脂培养基(蛋白胨10.0克/l，牛肉浸粉3.0克/l，氯化钠5.0克/l、琼脂15.0克/l)按33.0克与1000ml蒸馏水配比混匀。将上述营养琼脂培养基加热后分装至灭菌消毒后的三角瓶中，封口对培养基在125摄氏度的高压灭菌锅中进行灭菌30分钟。选用直径为9厘米的无菌培养皿，在无菌操作台中将灭菌后的培养液倾倒进入培养皿中，培养皿中培养液体积为25ml，封闭培养皿留作备用；
37.b、选取备用的装有培养基的培养皿在所设绿地环境中，打开培养皿盖，在预设高度为1.3米的高度中进行接种5分钟，之后封闭培养皿；
38.c、将采样后的封闭培养皿置于25摄氏度下进行培养48小时，期间每一次菌落计数的记录时间为24小时，并将第一批长出来的细菌菌落用记号笔在培养皿的底部标上
“○”
记号标记，记录个数；第二次记录的时间为48小时，并将第二批长出来的细菌用记号笔
“×”
记号标识记并记录个数；第三次数菌记录的时间为72小时，并将第三批长出来的细菌用记号笔“√”记号标识记，记录个数。
39.实施例4：
40.一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法，该培养方法主要包括以下步骤：
41.a、选取营养琼脂培养基(蛋白胨10.0克/l，牛肉浸粉3.0克/l，氯化钠5.0克/l、琼脂15.0克/l)按33.0克与1000ml蒸馏水配比混匀。将上述营养琼脂培养基加热后分装至灭菌消毒后的三角瓶中，封口对培养基在125摄氏度的高压灭菌锅中进行灭菌30分钟。选用直径为9厘米的无菌培养皿，在无菌操作台中将灭菌后的培养液倾倒进入培养皿中，培养皿中
培养液体积为30ml，封闭培养皿留作备用；
42.b、选取备用的装有培养基的培养皿在所设绿地环境中，打开培养皿盖，在预设高度为1.5米的高度中进行接种5分钟，之后封闭培养皿；
43.c、将采样后的封闭培养皿置于26摄氏度下进行培养24小时，期间每一次菌落计数的记录时间为24小时，并将第一批长出来的细菌菌落用记号笔在培养皿的底部标上
“○”
记号标记，记录个数；第二次记录的时间为48小时，并将第二批长出来的细菌用记号笔
“×”
记号标识记并记录个数；第三次数菌记录的时间为72小时，并将第三批长出来的细菌用记号笔“√”记号标识记，记录个数。
44.实施例5：
45.一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法，该培养方法主要包括以下步骤：
46.a、选取营养琼脂培养基(蛋白胨10.0克/l，牛肉浸粉3.0克/l，氯化钠5.0克/l、琼脂15.0克/l)按33.0克与1000ml蒸馏水配比混匀。将上述营养琼脂培养基加热后分装至灭菌消毒后的三角瓶中，封口对培养基在121摄氏度的高压灭菌锅中进行灭菌30分钟。选用直径为9厘米的无菌培养皿，在无菌操作台中将灭菌后的培养液倾倒进入培养皿中，培养皿中培养液体积为30ml，封闭培养皿留作备用；
47.b、选取备用的装有培养基的培养皿在所设绿地环境中，打开培养皿盖，在预设高度为1.5米的高度中进行接种5分钟，之后封闭培养皿；
48.c、将采样后的封闭培养皿置于26摄氏度下进行培养72小时，期间每一次菌落计数的记录时间为24小时，并将第一批长出来的细菌菌落用记号笔在培养皿的底部标上
“○”
记号标记，记录个数；第二次记录的时间为48小时，并将第二批长出来的细菌用记号笔
“×”
记号标识记并记录个数；第三次数菌记录的时间为72小时，并将第三批长出来的细菌用记号笔“√”记号标识记，记录个数。
49.实验例
50.实验场地：
51.选择了长春健身园带状公园绿地的三类绿地结构类型(乔灌草结构、乔草结构、灌草结构)10种绿地植物景观配置模式ck、a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3(其中ck为空白对照)减菌单项因子外业所测数据处理结果(以夏季三天的数据为例，每天的监测时间段设置是：早8：00—晚6：00，每隔2小时整点记录)。每种绿地配制模式中心每个时间段放置装有培养基的培养皿接种，每次三个重复。
52.实验方法：
53.1、培养基溶液的配比：营养琼脂培养基(成分：蛋白胨10.0g/l，牛肉浸粉3.0g/l，氯化钠5.0g/l、琼脂15.0g/l)按33.0g配于1000ml蒸馏水烧杯中，并充分搅伴；
54.2、灌装：加热至透明液体(初步沸腾)分装在三角瓶中；套上封口膜与橡皮筋封好口；
55.3、灭菌：121℃高压灭菌锅灭菌，30分钟；
56.4、倒培养皿：选用直径9cm的无菌培养皿，在接种室无菌台上倒皿，体积大约每个在30ml左右，用封口膜封好口，备用；
57.5、野外微生物监测(采样)：在不同的绿地样点与空白对照样点中心地段，把装有培养基的培养皿(三个重复)用记号笔标上样地编号水平放置在支架上或可手持写字板上，
打开皿盖在空气中接种5min，采样高度为1.5m，采样后盖上皿盖，用封口膜封口带回实验室；
58.6、室内培养：将大量样品按时间点按顺序平放在实验室平台案面上，将室内温度控制在26℃，培养72小时；
59.7、数菌记录：第一次数菌记录的时间为培养24小时，并将第一批长出来的细菌菌落用记号笔在培养皿的底部标上
“○”
记号标记，记录个数；第二次记录的时间为培养48小时，并将第二批长出来的细菌用记号笔
“×”
记号标识记并记录个数；第三次数菌记录的时间为培养72小时，并将第三批长出来的细菌用记号笔“√”记号标识记，记录个数。
60.上述本技术提供的微生物培养方法适用于在培养箱或相应能控制温度的实验室平台上进行。关于通过任何方式将温度调节至本方案中的温度的方法均属于本发明的保护范围。
61.营养琼脂：生产厂商：青岛市高新区锦汇路1号，规格：250g。
62.实验结果检测数据计算方式：
63.菌落换算与绿地减菌率的计算：
64.菌落换算(奥梅梁基公式)c＝1000
×
50n(a
×
t)
65.其中c为空气微生物数，单位cfu/m3(读作每立方米细菌群落总数)
66.a为捕捉面积(cm2)
67.n菌落数
68.t为暴露时间(min)。
69.绿地减菌率y＝(n-ni)
×
100/n
70.其中y为绿地减菌率(％)
71.n为对照点空气微生物浓度(cfu/m3)
72.ni为绿地中空气微生物浓度(cfu/m3)。
73.实验检测时间：2019年7月。
74.实验微生物绿地室外第一次接种时间：2019年7月2日。
75.室内菌落计数时间：7月3日进行第一次菌落计数；7月4日进行第二次菌落计数；7月5日进行第三次菌落计数。
76.依次类推，实验微生物绿地室外第二次接种时间：2019年7月3日；
77.实验微生物绿地室外第三次接种时间：2019年7月12日；
78.实验地绿化带样地植被设置：
79.[0080][0081]
实验检测数据结果：
[0082][0083]
上述数据显示，数据显示如图2所示，各实验组的菌落数及减菌率均呈逐渐递增的趋势。
[0084]
如附图1表明，所测试样地中，所有绿地内含菌量均低于空白对照(水泥铺装地)；
[0085]
如附图2表明，在9类绿地配制模式中，a2减菌率最高，群落配制结构较优。
[0086]
本发明提供了一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法及应用，该一种微生物实验接种后培养基的低温培养方法是通过采用低温培养使微生物菌落缓慢生长，并通过分批次的菌落计数模式来实现菌落数量记录清晰、准确的同时可满足于夏季大量样本同时检测的方法。上述方法不仅能实现菌落数量记录清晰，并保证了准确无误，在满足大量样本的数据检测的同时，进而提高了绿地减菌率计算的精度，为城市绿地减菌效应的空气质量指标与生态保健功能指标的评价提供重要依据。
[0087]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。