新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针的制作方法

1.本发明属于病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，尤其涉及一种将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的新型冠状病毒(2019-ncov)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，还涉及检测新型冠状病毒的方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒“2019-ncov”也称为sars-cov-2，与sars病毒属于同一家族，感染该病毒后，多数患者为中轻症，预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。
3.目前临床上多采用rt-pcr方法和测序的方法对sars-cov-2进行检测确认，测序的方法较为复杂，不适合筛查，也不适合应急检测。rt-pcr的方法在目前临床检测中较为普遍，例如文献cn111394511a公开的rt-pcr的方法同时利用新型冠状病毒sars-cov-2的s基因片段、orf1ab基因片段和n基因片段设计三组特异性引物，可以实现对新型冠状病毒的特异性检测，但其需要提前用rna提取试剂盒进行rna提取后检测，操作繁琐，耗时耗力，且操作过程中感染病毒的风险增加；该文献公开的反应体系同时采用三组特异性引物，对新型冠状病毒可检测至1000copies/ml，检测灵敏度欠佳，不能满足更高灵敏度检测的需要，特别是针对非临床样本，如来自河水、海水、污水、气溶胶的环境样本、物体表面附着物样本、和饮用水、食品等样本中的新型冠状病毒也需要进行检测；另外，rt-pcr方法的扩增产物为dna，由于dna不易降解，也增加了由检测引起的样本交叉污染或环境污染的风险，同时使用rt-pcr方法也对反应设备有较高要求，使用的设备价格较高，会大大增加检测成本。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
5.(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针a的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针a用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；
6.(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
7.(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物rna拷贝特异性结合；
8.(4)sat酶液：其包含至少一种rna聚合酶和m-mlv反转录酶；
9.所述检测序列选自新型冠状病毒orf1ab基因(简称o基因)中一段高度保守且与其他类型冠状病毒有较大差异的序列(优选seq id no:1)，和/或新型冠状病毒n基因中一段高度保守且与其他类型冠状病毒有较大差异的序列(优选seq id no:9)。
10.上述检测序列选自o基因，所述第一引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述
第二引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如seq id no:5所示；优选地，所述特异性捕获探针a的核苷酸序列如seq id no:2所示。
11.上述检测序列选自n基因，所述第一引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第二引物的核苷酸序列如seq id no:12所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如seq id no:13所示；优选地，所述特异性捕获探针a的核苷酸序列如seq id no:10所示。
12.上述检测序列选自o基因和n基因，所述第一引物包括引物a和引物b，其中所述引物a的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述引物b的核苷酸序列如seq id no:11所示；所述第二引物包括引物c和引物d，其中所述引物c的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述引物d的核苷酸序列如seq id no:12所示；所述靶标检测探针包括第一探针和第二探针，其中所述第一探针的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二探针的核苷酸序列如seq id no:13所示；优选地，所述特异性捕获探针a包括第一特异性捕获探针和第二特异性捕获探针，其中所述第一捕获探针的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第二特异性捕获探针的核苷酸序列如seq id no:10所示。
13.上述试剂盒还包括：
14.(5)洗涤液：其含有nacl和sds；和/或
15.(6)矿物油；和/或
16.(7)阳性对照：新型冠状病毒orf1ab基因和/或n基因转录rna的稀释物；和/或
17.(8)阴性对照：不含有新型冠状病毒核酸的体系。
18.上述核酸提取液的组分为：250～800mm hepes，4～10％lls，1～50μμ特异性捕获探针a，50～500mg/l磁珠，2.5～20pmol/反应的第一引物；所述检测液a的组分为：10-50mm tris，5-40mm kcl，10-40mm mgcl2，1-20mm ntp，0.1-10mm dntps，1-10％pvp40，10～30pmol/反应的第二引物；所述检测液b的组分为：10-50mm tris，5-40mm kcl，10-40mm mgcl2，1-20mm ntp，0.1-10mm dntps，1-10％pvp40，2.5～30pmol/反应的第一引物，5～30pmol/反应的靶标检测探针；所述sat酶液的组分为：400～4000u/反应的m-mlv反转录酶、200～2000u/反应的rna聚合酶、2～10mm hepes ph7.5、10～100mm n-acetyl-l-cysteine、0.04～0.4mm zinc acetate、10～100mm trehalose、40～200mm tris-hcl ph 8.0、40～200mm kcl、0.01～0.5mm edta、0.1～1％(v/v)triton x-100和20～50％(v/v)glycerol。
19.本发明另一方面提供一种新型冠状病毒检测的引物组合，其用于上述的试剂盒中，其包括第一组合、第二组合或第三组合；其中：
20.所述第一组合为：核苷酸序列如seq id no:3所示的第一引物，和核苷酸序列如seq id no:4所示的第二引物；
21.所述第二组合为：核苷酸序列如seq id no:11所示的第一引物，和核苷酸序列如seq id no:12所示的第二引物；
22.所述第三组合为：
23.第一引物，其由核苷酸序列如seq id no:3所示的引物a和核苷酸序列如seq id no:11所示的引物b组成；和
24.第二引物，其由核苷酸序列如seq id no:4所示的引物c和核苷酸序列如seq id no:12所示的引物d组成。
25.本发明再一方面提供一种检测新型冠状病毒核酸的非疾病诊断方法，其利用上述
的试剂盒，包括以下步骤：
26.1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；其中所述核酸提取液含有第一引物和特异性捕获探针a；
27.2)向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；其中所述检测液a中含有第二引物；
28.3)向所述第一步反应液中加入sat酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；
29.4)向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；其中所述检测液b含有第一引物和靶标检测探针；
30.5)根据步骤4)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
31.若dt≤35，则试样中含有新型冠状病毒核酸；若dt>35，则试样中不含有新型冠状病毒核酸。
32.上述方法中，步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min；步骤3)中所述sat酶液使用前事先预热，预热温度为41-43℃；步骤3)中所述第二步反应的条件为41℃-43℃反应3-15min；步骤4)中所述第三步反应的条件为41℃-43℃反应30-50min。
33.上述试样来源包括河水、海水、污水、物体表面附着物、饮用水、食品、气溶胶。
34.基于以上技术方案提供的新型冠状病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中包括核酸提取液、检测液a、检测液b和sat酶液等，其中在核酸提取液中可包含用于结合检测序列的特异性捕获探针和用于与靶标序列特异性结合的第一引物，在检测液a中可含有第二引物，在检测液b中可含有第一引物、靶标检测探针等，sat酶液则含有反应过程中所需要的rna聚合酶和反转录酶等，在使用过程中通过分步添加上述反应液分步反应，可以避免不同引物、探针之间的相互干扰，检测中体系反应较为简单，可以实现对新型冠状病毒的高灵敏度、高特异性检测。本发明除用于医学领域的新型冠状病毒检测，还可以用于对非医学诊断用样本，例如河水、海水、污水、气溶胶、物体表面附着物等环境样本、以及饮用水、食品等样本中新型冠状病毒的检测，适合大范围推广使用。
35.与现有的检测方法相比，本发明具有以下优点：
36.(1)本发明试剂盒中引物和探针组根据新型冠状病毒orf1ab基因和/或n基因进行优化设计获得，具有高准确度、高特异性的特点，可以用于对新型冠状病毒进行快速、准确、高灵敏度和高特异性检测。
37.(2)本发明采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing，简称sat)对新型冠状病毒进行检测，避免了现有技术(例如rt-pcr)中提取rna的加热、离心等操作，简化实验步骤和反应体系，易于实现自动化，对检测灵敏度有了较大提高，实施例结果表明，本发明提供的试剂盒和方法对新型冠状病毒检测的灵敏度可达250copies/ml，完全能够满足高灵敏度要求的检测环境。
38.(3)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，同时降低了对所用pcr仪的设计和生产成本。
39.(4)本发明扩增产物为rna，rna在自然界中极易降解，相对pcr扩增dna而言，污染易控，交叉影响小，不会引起样本交叉污染和环境污染。
附图说明
40.图1为实施例1中组1和组2引物和探针对系列浓度的新型冠状病毒阳性标准品的扩增曲线；
41.图2为实施例4中组1和组2引物和探针对系列浓度的新型冠状病毒阳性标准品的扩增曲线；
42.图3为实施例7中引物和探针对新型冠状病毒阳性标准品的扩增曲线。
具体实施方式
43.针对现有技术中存在的新型冠状病毒检测方法的缺陷，本发明利用核酸恒温同步放大检测的方法检测新型冠状病毒，并提供了用于新型冠状病毒检测的核酸恒温同步放大检测试剂盒及其专用引物和探针以及检测方法。
44.以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
45.在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
46.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《molecular cloning:a laboratory manual》sambrook，j.，russell，david w.，molecular cloning:a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor)。
47.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
48.本发明提及的所有引物、荧光探针和体外转录rna产物用已有技术合成。
49.实施例1：用于实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的orf1ab基因的专用引物和探针的设计
50.本发明人根据genbank数据库已公开的新型冠状病毒核酸序列，选择确定新型冠状病毒orf1ab基因(简称o基因)上其中一段高度保守且与其他类型冠状病毒有较大差异的序列作为检测序列(其核苷酸序列如seq id no:1所示，命名为o基因检测序列)，按照引物和探针设计原则进行引物和探针设计，以对新型冠状病毒进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
51.该实施例共设计了多组引物和探针，其中选择以下两组引物和探针(组1和组2)对新型冠状病毒阳性对照(命名为o基因阳性对照，以下详述)和阴性对照(不含有新型冠状病毒核酸的体系，例如去离子水)进行检测验证，从而筛选出特异性、灵敏度和重复性均较好的引物和探针组，用于检测新型冠状病毒。
52.组1：
53.o基因特异性捕获探针a：
[0054]5’-
ccgcauuaaucuucaguucaucaccaauuattttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3'(seq id no:2)；
[0055]
第一引物(命名为o基因第一引物)：5
’-
aatttaatacgactcactatagggagaagctacatgtgcattacc-3'(seq id no:3)；
[0056]
第二引物(命名为o基因第二引物)：5
’-
taatccgtttatgattgatgt-3'(seq id no:4)；
[0057]
靶标检测探针(命名为o基因探针)：5
’-
ccaggugaucuguauuguccugg-3'(seq id no:5)，5’端用fam荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记；
[0058]
其中orf1ab基因检测序列(seq id no:1)中o基因第一引物和o基因第二引物的扩增区域为orf1ab基因靶标序列，靶标检测探针与该靶标序列的扩增产物rna拷贝特异性结合。
[0059]
组2：
[0060]
o基因特异性捕获探针a-1，同组1中特异性捕获探针a(seq id no:2)；
[0061]
第一引物-1：
[0062]5’-
aatttaatacgactcactatagggagaatgattgcatcacaactagct-3'(seq id no:6)；
[0063]
第二引物-1：5
’-
gatttgattacgtctataat-3'(seq id no:7)；
[0064]
靶标检测探针-1：5
’-
ccugaucuguauugucagg-3'(seq id no:8)，其5’端用fam荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记。
[0065]
该实施例中o基因阳性对照的制备方式包括以下步骤：
[0066]
(1)用化学合成法合成一段orf1ab基因片段(seq id no:1)，构建到含有t7启动子序列的常用质粒载体上；
[0067]
(2)用商品化t7启动子体外转录试剂盒(sigma)转录出rna片段，纯化后，通过紫外计算rna拷贝数，作为o基因阳性对照。通过检测阳性对照，可保证检测结果的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及批次间的差异。
[0068]
利用上述两组引物和探针(组1和组2)分别对通过阴性对照系列稀释o基因阳性对照获得的阳性标准品(浓度分别为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、250copies/ml)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法如以下实施例3所述)。结果如图1所示，其中a幅为组1的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，b幅为组2的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，可见组1的引物和探针的检测灵敏度可达250copies/ml，而组2的引物和探针的检测灵敏度只达到103copies/ml，因此组1的引物和探针的检测灵敏度显著高于组2的引物和探针的检测灵敏度，选择组1所示的引物和探针用于以下实施例中对新型冠状病毒进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
[0069]
实施例2：用于检测orf1ab基因的实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的试剂盒
[0070]
该实施例提供的用于新型冠状病毒核酸检测的试剂盒是基于rna核酸恒温同步放大检测原理检测新型冠状病毒orf1ab基因的试剂盒，在实施例确定的组1所示的引物和探针基础上，具体包括以下组分：
[0071]
(1)病毒核酸提取液：用于提取和纯化样本中的新型冠状病毒核酸，其为含250～800mm hepes、4～10％lls、1～50μμ的特异性捕获探针a(实施例1中组1中所述，seq id no:2)、50～500mg/l磁珠、2.5～15pmol/反应的o基因第一引物(seq id no:3)的水溶液；
[0072]
(2)检测液a：其为含10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、
0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、10～30pmol/反应的o基因第二引物(seq id no:4)的水溶液；
[0073]
(3)检测液b：其为含10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、2.5～30pmol/反应的o基因第一引物(seq id no:3)、5～30pmol/反应的o基因探针(seq id no:5)的水溶液；
[0074]
(4)sat酶液：其主要含400-4000u/反应的m-mlv反转录酶和200-2000u/反应的rna聚合酶(例如t7 rna聚合酶)，具体含400～4000u/反应的m-mlv反转录酶、200～2000u/反应的rna聚合酶、2～10mm hepes ph7.5、10～100mm n-acetyl-l-cysteine(n-乙酰-l-半胱氨酸)、0.04～0.4mm zinc acetate(乙酸锌)、10～100mm trehalose(海藻糖)、40～200mm tris-hcl ph 8.0、40～200mm kcl、0.01～0.5mm edta、0.1～1％(v/v)triton x-100和20～50％(v/v)glycerol(丙三醇)。
[0075]
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒还包含以下组分：
[0076]
(5)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方为hepes 5～50mm、nacl 50～500mm、1％sds、edta 1-10mm；
[0077]
(6)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
[0078]
(7)o基因阳性对照；可以为2.5
×
105copies/ml的体外转录orf1ab基因的rna(实施例1中制备)的稀释物；
[0079]
(8)阴性对照：不含新型冠状病毒核酸的体系，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
[0080]
在该实施例提供的试剂盒中，特异性捕获探针a可与新型冠状病毒的orf1 ab基因检测序列(seq id no:1)特异性结合，用于提取样本中的新型冠状病毒核酸；o基因第一引物和o基因第二引物是一对用于在m-mlv反转录酶作用下产生orf1ab基因靶标序列的dna拷贝的检测引物，o基因探针则是一条用于与在rna聚合酶作用下根据产生的orf1ab基因靶标序列的dna拷贝产生的rna拷贝特异性结合的检测探针，这些引物和探针的组合使用实现对新型冠状病毒核酸的快速、准确、特异和高灵敏度检测，该实施例提供的试剂盒检测新型冠状病毒的灵敏度可达250copies/ml(如图1中a幅所示)。
[0081]
实施例3：实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的方法
[0082]
该实施例方法基于rna恒温同步放大检测原理检测新型冠状病毒的orf1ab基因，其利用上述实施例2提供的试剂盒对从受试者获取的口咽拭子/痰液样本中是否含有新型冠状病毒核酸进行检测，具体操作步骤为：
[0083]
3.1、样品准备
[0084]
分别取400μl o基因阳性对照(实施例2所述)、400μl阴性对照和400μl口咽拭子样本分别置于样品处理管中备用；
[0085]
3.2、核酸提取
[0086]
(1)在各样品处理管中加入100μl～800μl病毒核酸提取液(hepes 500mm、lls 8％、捕获探针a 15μμ、磁珠150mg/l、o基因第一引物浓度为10pmol/反应，混匀，60℃保温10分钟，室温放置5～10分钟；
[0087]
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置2～5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1ml洗涤液(hepes 25mm、
id no:10)；
[0105]
第一引物(命名为n基因第一引物)：
[0106]5’-
aatttaatacgactcactatagggagatgtgacttccatgccaatgcgcgaca-3'(seq id no:11)；
[0107]
第二引物(命名为n基因第二引物)：5
’-
gacaaggaactgattacaaac-3'(seq id no:12)；
[0108]
靶标检测探针(命名为n基因探针)：5
’-
ggaccagcgcuucagcguucuggucc-3'(seq id no:13)，5’端用fam荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记；
[0109]
将n基因检测序列(seq id no:9)中n基因第一引物和n基因第二引物的扩增区域作为n基因靶标序列，n基因探针与该靶标序列的扩增产物rna拷贝特异性结合；
[0110]
组2：
[0111]
特异性捕获探针a-2，同组1中特异性捕获探针a(seq id no:10)；
[0112]
第一引物-2：
[0113]5’-
aatttaatacgactcactatagggagacgaaggtgtgacttccatg-3'(seq id no:14)；
[0114]
第二引物-2：5
’-
aggaactaatcagacaaggaa-3'(seq id no:15)；
[0115]
靶标检测探针-2：5
’-
cagcgcuucagcguucuucgcug-3'(seq id no:16)，其5’端用fam荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记。
[0116]
该实施例中n基因阳性对照的制备方式包括以下步骤：
[0117]
(1)用化学合成法合成一段n基因片段(seq id no:10)，构建到含有t7启动子序列的普通质粒载体上；
[0118]
(2)用t7启动子体外转录试剂盒(sigma)转录出rna片段，纯化后，通过紫外计算rna拷贝数，作为n基因阳性对照。通过检测阳性对照，可保证检测结果的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及批次间的差异。
[0119]
利用上述两组引物和探针(组1和组2)分别对通过阴性对照系列稀释n基因阳性对照获得的阳性标准品(浓度分别为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml 、250copies/ml)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法如以下实施例6所述)。结果如图2所示，其中a幅为组1的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，b幅为组2的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，可见组1的引物和探针的检测灵敏度可达250copies/ml，而组2的引物和探针的检测灵敏度只达到103copies/ml，因此组1的引物和探针的检测灵敏度显著高于组2的引物和探针的检测灵敏度，选择组1所示的引物和探针用于以下实施例中对新型冠状病毒进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
[0120]
实施例5：用于检测n基因的实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的试剂盒
[0121]
该实施例提供的用于新型冠状病毒核酸检测的试剂盒是基于rna核酸恒温同步放大检测原理的检测新型冠状病毒n基因的试剂盒，具体包括以下组分：
[0122]
(1)病毒核酸提取液：用于提取和纯化样本中的新型冠状病毒核酸，其为含250～800mm hepes、4～10％lls、1～50μμ的n基因特异性捕获探针a(实施例4中组1中所述，seq id no:10)、50～500mg/l磁珠、2.5～20pmol/反应的n基因第一引物(seq id no:11)的水溶液；
[0123]
(2)检测液a：其为含10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、10～30pmol/反应的n基因第二引物(seq id no:12)的水溶液；
[0124]
(3)检测液b：其为含10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、2.5～30pmol/反应的n基因第一引物(seq id no:11)、5～30pmol/反应的n基因探针(seq id no:13)的水溶液；
[0125]
(4)sat酶液：其主要含400-4000u/反应的m-mlv反转录酶和200-2000u/反应的rna聚合酶(例如t7 rna聚合酶)，具体含400～4000u/反应的m-mlv反转录酶、200～2000u/反应的rna聚合酶、2～10mm hepes ph7.5、10～100mm n-acetyl-l-cysteine、0.04～0.4mm zinc acetate、10～100mm trehalose、40～200mm tris-hcl ph 8.0、40～200mm kcl、0.01～0.5mm edta、0.1～1％(v/v)triton x-100和20～50％(v/v)glycerol。
[0126]
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒还包含以下组分：
[0127]
(5)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方为hepes 5～50mm、nacl 50～500mm、1％sds、edta 1-10mm；
[0128]
(6)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
[0129]
(7)n基因阳性对照；可以为含2.5
×
105copies/ml新型冠状病毒n基因rna(实施例4中制备)的体系；
[0130]
(8)阴性对照：不含新型冠状病毒核酸的体系，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
[0131]
在该实施例提供的试剂盒中，n基因特异性捕获探针a可与新型冠状病毒的n基因检测序列(seq id no:9)特异性结合，用于提取样本中的新型冠状病毒核酸；n基因第一引物和n基因第二引物是一对用于在m-mlv反转录酶作用下产生n基因靶标序列的dna拷贝的检测引物，n基因探针则是一条用于与在rna聚合酶作用下根据产生的n基因靶标序列的dna拷贝产生的rna拷贝特异性结合的检测探针，这些引物和探针的组合使用实现对新型冠状病毒核酸的快速、准确、特异和高灵敏度检测，该实施例提供的试剂盒检测新型冠状病毒的灵敏度可达250copies/ml(如图2中a幅所示)。
[0132]
实施例6：实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的方法
[0133]
该实施例方法基于rna恒温同步放大原理检测新型冠状病毒的n基因，其利用上述实施例5提供的试剂盒对从受试者获取的口咽拭子/痰液样本中是否含有新型冠状病毒核酸进行检测，具体操作步骤为：
[0134]
6.1、样品准备
[0135]
分别取400μl n基因阳性对照(实施例5所述)、400μl阴性对照和400μl口咽拭子样本分别置于样品处理管中备用；
[0136]
6.2、核酸提取
[0137]
(1)在各样品处理管中加入100μl～800μl病毒核酸提取液(hepes 500mm、lls 8％、n基因捕获探针a 15μμ、磁珠150mg/l、n基因第一引物浓度为10pmol/反应)，混匀，60℃保温10分钟，室温放置5-10分钟；
[0138]
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置2～5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1ml洗涤液(hepes 25mm、
nacl150mm、1％sds、edta 2.5mm)振荡均匀后静置2～5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μl洗涤液和150μl矿物油，振荡均匀后静置2～5钟，弃液体，保留磁珠；
[0139]
(3)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
[0140]
6.3、sat扩增检测
[0141]
(1)向样品处理管中各加入40μl检测液a(tris 15mm、mgcl
2 15mm、dntp 2.5mm、ntp 3mm、pvp40 1％、kcl 10mm、n基因第二引物浓度为20pmol/反应)振荡重悬磁珠；
[0142]
(2)取振荡混匀的上述40μl反应检测液a加至洁净微量反应管，向每个反应管中加入50μl矿物油，42℃5-10min。向微量反应管中加入25μl sat酶液(事先42℃条件下预热，含有m-mlv反转录酶1500u/反应、t7 rna聚合酶1000u/反应、10mm hepes ph7.5、15mm n-acetyl-l-cysteine(n-乙酰-l-半胱氨酸)、0.15mm zinc acetate(乙酸锌)、20mm trehalose(海藻糖)、100mm tris-hcl ph 8.0、80mm kcl、0.25mm edta、0.5％(v/v)triton x-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇))，42℃5-10min；
[0143]
(3)向微量反应管中加入35μl的检测液b(tris15mm、mgcl
2 15mm、dntp 2.5mm、ntp 3mm、pvp40 1％、kcl 10mm、n基因第一引物)浓度为10pmol/反应，n基因探针浓度为15pmol/反应)，将反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择fam通道。
[0144]
6.4、结果判定
[0145]
根据sat扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
[0146]
阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点对应的横坐标读数。结果判定标准为：
[0147]
若fam通道dt≤35，则样本为阳性，即样本中含有新型冠状病毒；
[0148]
若fam通道dt＞35，则样本为阴性，即样本中不含有新型冠状病毒。
[0149]
参照本实施例，同样可以对其他临床诊断样本(如鼻拭子、肺泡关系液、血液、粪便等)进行检测，还可以对非临床诊断样本，例如河水、海水、污水、物体表面附着物(检测前先制成水样)、气溶胶等环境样本，以及饮用水、食品(检测前先制成水样)等样本中新型冠状病毒进行检测。
[0150]
实施例7：用于同时检测orf1ab基因和n基因的实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的试剂盒
[0151]
该实施例提供的试剂盒组合使用实施例1组1和实施例4的组1中的引物和探针，同时针对新型冠状病毒的orf1ab基因和n基因实现对新型冠状病毒进行检测，通过双基因同时检测达到检测新型冠状病毒的目的。
[0152]
该实施例提供的试剂盒具体包括以下组分：
[0153]
(1)病毒核酸提取液：用于提取和纯化样本中的新型冠状病毒核酸，其为含250～800mm hepes、4～10％lls、1～50μμ的o基因和n基因特异性捕获探针a(实施例1和实施例4中组1中所述，seq id no:2和seq id no:10)、50～500mg/l磁珠、2.5～15pmol/反应/第一引物(实施例1中o基因第一引物和实施例4中n基因第一引物，seq id no:3和seq id no:11)的水溶液；
[0154]
(2)检测液a：其为含10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、10～30pmol/反应/第二引物(实施例1中o基因第二引物和
实施例4中n基因第二引物，seq id no:4和seq id no:12)的水溶液；
[0155]
(3)检测液b：其为含10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、2.5～30pmol/反应/第一引物(o基因第一引物和n基因第一引物，seq id no:3和seq id no:11)、5～30pmol/反应/靶标检测探针(同时含实施例1中o基因探针和实施例4中n基因探针，seq id no:5和seq id no:13；o基因探针5’端用fam荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记；n基因探针5’端用hex荧光标记，3’端用dabcyl荧光标记)的水溶液；
[0156]
(4)sat酶液：其主要含400-4000u/反应的m-mlv反转录酶和200-2000u/反应的rna聚合酶(例如t7 rna聚合酶)，具体含400～4000u/反应的m-mlv反转录酶、200～2000u/反应的rna聚合酶、2～10mm hepes ph7.5、10～100mm n-acetyl-l-cysteine、0.04～0.4mm zinc acetate、10～100mm trehalose、40～200mm tris-hcl ph 8.0、40～200mm kcl、0.01～0.5mm edta、0.1～1％(v/v)triton x-100和20～50％(v/v)glycerol。
[0157]
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒还包含以下组分：
[0158]
(5)洗涤液：用于磁珠水相清洗，其配方为hepes 5～50mm、nacl 50～500mm、1％sds、edta 1-10mm；
[0159]
(6)矿物油：用于磁珠有机相清洗的矿物油；
[0160]
(7)阳性对照；实施例2中o基因阳性对照和实施例5中n基因阳性对照；
[0161]
(8)阴性对照：不含新型冠状病毒核酸的体系，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
[0162]
利用该实施例提供的试剂盒对核酸浓度为250copies/ml的阳性标准品(利用阴性对照对实施例1得到的o基因阳性对照和实施例4得到的n基因阳性对照的等浓度混合物进行稀释获得，设三个重复)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法如以下实施例8所述)。结果如图3所示，其中a幅为fam通道扩增曲线(即检测orf1ab基因的扩增曲线)，b幅为hex通道扩增曲线(即检测n基因的扩增曲线)，可见该实施例提供的试剂盒在同一检测体系中同时针对新型冠状病毒orf1ab和n基因的检测灵敏度均可达到250copies/ml，并且三个重复扩增曲线相似且接近，因此该实施例提供的试剂盒具有较高的检测灵敏度，且重复性好，可以满足多种高灵敏度检测环境的需要。
[0163]
实施例8：同时检测orf1ab和n基因的实时荧光核酸恒温扩增检测新型冠状病毒(2019-ncov)的方法
[0164]
该实施例方法利用上述实施例7提供的试剂盒对从受试者获取的口咽拭子/痰液样本中是否含有新型冠状病毒核酸进行检测，具体操作步骤为：
[0165]
8.1、样品准备
[0166]
分别取400μl阳性对照(实施例7所述)、400μl阴性对照和400μl口咽拭子样本分别置于样品处理管中备用；
[0167]
8.2、核酸提取
[0168]
(1)在各样品处理管中加入100μl～800μl病毒核酸提取液(hepes 500mm、lls 8％、特异性捕获探针a(o基因捕获探针a和n基因捕获探针a)15μμ/探针、磁珠150mg/l、第一引物(o基因第一引物和n基因第一引物)浓度为15pmol/反应/引物，混匀，60℃保温10分钟，室温放置5-10分钟；
[0169]
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置2～5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1ml洗涤液(hepes 25mm、nacl150mm、1％sds、edta 2.5mm)振荡均匀后静置2～5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μl洗涤液和150μl矿物油，振荡均匀后静置2～5分钟，弃液体，保留磁珠；
[0170]
(3)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
[0171]
8.3、sat扩增检测
[0172]
(1)向样品处理管中各加入40μl检测液a(tris 15mm、mgcl
2 15mm、dntp 2.5mm、ntp 3mm、pvp40 1％、kcl 10mm、第二引物(o基因第二引物和n基因第二引物)浓度为20pmol/反应/引物)振荡重悬磁珠；
[0173]
(2)取振荡混匀的上述40μl反应检测液a加至洁净微量反应管，向每个反应管中加入50μl矿物油，42℃5-10min。向微量反应管中加入25μl sat酶液(事先42℃条件下预热，含有m-mlv反转录酶1500u/反应、t7 rna聚合酶1000u/反应、10mm hepes ph7.5、15mm n-acetyl-l-cysteine(n-乙酰-l-半胱氨酸)、0.15mm zinc acetate(乙酸锌)、20mm trehalose(海藻糖)、100mm tris-hcl ph 8.0、80mm kcl、0.25mm edta、0.5％(v/v)triton x-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇))，42℃5-10min；
[0174]
(3)向微量反应管中加入35μl的检测液b(tris15mm、mgcl
2 15mm、dntp 2.5mm、ntp 3mm、pvp40 1％、kcl 10mm、第一引物(o基因第一引物和n基因第一引物)浓度为10pmol/反应/引物，靶标检测探针(o基因探针和n基因探针)浓度为15pmol/反应/探针)，将反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择fam通道(o基因靶标信号检测)和hex通道(n基因靶标信号检测)。
[0175]
8.4、结果判定
[0176]
根据sat扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
[0177]
阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点对应的横坐标读数。结果判定标准为：
[0178]
若fam通道和hex通道任一通道dt≤35，则样本为阳性，即样本中含有新型冠状病毒；
[0179]
若fam通道和hex通道dt均＞35，则样本为阴性，即样本中不含有新型冠状病毒。
[0180]
参照本实施例，同样可以对其他临床诊断样本(如鼻拭子、肺泡关系液、血液、粪便等)进行检测，还可以对非临床诊断样本，例如河水、海水、污水、物体表面附着物(检测前先制成水样)、气溶胶等环境样本，以及饮用水、食品(检测前先制成水样)等样本中新型冠状病毒进行检测。
[0181]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。