一种具有抗糖基化作用的赤嘴鳘鱼胶肽及其制备方法与流程

1.本发明涉及鱼胶肽制备领域，具体为一种具有抗糖基化作用的赤嘴鳘鱼胶肽制备方法。


背景技术：

2.鱼胶，其实就是鱼鳔的干制品，富胶质，故名鱼胶，也有人叫花胶。中国人从鱼中剖摘 鱼肚食用，可追溯至汉朝之前。1600多年前的《齐民要术》就记载有现今之所谓鱼肚。鱼胶 与燕窝、鱼翅齐名，是八珍之一，素有海洋人参之誉。它的主要成分为胶原蛋白、多种维生 素及钙、锌、铁、硒等多种微量元素。其蛋白质含量高达84.2％，脂肪仅为0.2％，是理想的 高蛋白低脂肪食品。
3.赤嘴鳘是一种深海鱼类，生活在从没有受到污染的深水海洋，主要分布在北太平洋西部、 广东南澳岛周边海，属于珍贵鱼种，具有很高的营养价值，赤嘴鳘鱼胶更是鱼类中的精品。
4.目前除少部分鱼胶直接被食用或加工为干制品外，大部分被当做废弃物丢弃，造成大量 的资源浪费和严重的环境污染。胶原蛋白肽是胶原蛋白经加工得到的一系列由3～20个氨基 酸组成的多肽，多项研究表明，鱼胶可以通过酶解制备鱼胶肽。
5.王斌等通过酶解制备了一种鲩鱼鱼鳔降血脂寡肽(专利申请号：201711013006.2)，并对 其降血脂作用进行了验证。同年，王斌等通过酶解制备了一种鲩鱼鱼鳔抗氧化肽(专利申请 号：201711013000.5)，并对其抗氧化作用进行了验证。此外，常虹等、涂宗财等、李娜等、 郑婷婷等也分别通过蛋白酶从鱼鳔中制备了得到了一种抗氧化肽。多数研究主要集中在通过 酶解等手段制备得到了鱼胶肽，但通过其他方式制备鱼胶肽的研究较少，且发现制备的鱼胶 肽也仅局限在抗氧化和降血脂的生理活性。
6.刘姝等通过接种米曲霉，利用米曲霉发酵制备鱼鳔得到了一种具有抗氧化活性的鱼胶肽， 通过发酵64小时后，经超滤制备得到由5-12个氨基酸残基组成鱼胶肽片段抗氧化性活性最 强，其相对应的分子质量分布在1000～3000d之间。
7.糖基化是发生在生物环境内的非酶促反应，它能够在蛋白质、dna、和脂类等大分子中插 入糖链。而这些反应直接导致了这些生物大分子变异或失活，糖基化在很多疾病以及衰老进 程中发挥着重要的作用。晚期糖基化终末产物(ages)是过量的糖和蛋白质结合的产物，在 体内有两个来源，一是过量的糖和蛋白质在体内合成ages，二是通过进食将食物中存在的 ages摄入体内。ages能够和身体的组织细胞相组合并破坏它们。研究证明：ages会加速人 体的衰老，使皮肤变差出现皱纹等之外，还会引起退化性脑疾病、心脏功能障碍、糖尿病并 发症等疾病。所以ages也是全球医学界最为热门的领域之一，有众多的科研机构、大学、医 院以及制药公司纷纷加入研究ages的行列，以期通过研究ages的抑制剂，找到天然的抗糖 基化成分。


技术实现要素：

8.本发明为了解决现有技术中抗糖基化对人体的影响的问题，提供一种具有抗糖基化作用 的赤嘴鳘鱼胶肽制备方法，能够使得人们可以通过服用鱼胶肽补充人体胶原蛋白的同时，还 可以通过赤嘴鳘鱼胶肽的抗糖基作用，达到减缓衰老、改善皮肤的目的。
9.本发明通过下述技术方案实现：
10.一种具有抗糖基化作用的赤嘴鳘鱼胶肽制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
11.s1.预处理：将赤嘴鳘干鱼胶用30倍的清水清分两次洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体 积的纯化水，4-10℃泡发8-12h，泡发后用匀浆机进行匀浆；
12.s2.酶解脱脂：向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m)脂肪酶，酶解温度25-35℃，酶 解2-3h；
13.s3.离心：6000-8000r/min，离心20-30min，收集沉淀；
14.s4.提胶、灭菌：收集沉淀物，加入发酵罐内，并添加葡糖糖溶液，控制发酵罐，进行提 交、灭菌处理；
15.s5.发酵：接种发酵菌，控制发酵温度、发酵罐转速、发酵罐通气量和发酵时间；
16.s6.二次补料发酵：向发酵罐内进行补料，补料后对发酵罐内的发酵条件进行更改；
17.s7.超滤：选用截留分子量为5000da的陶瓷膜进行超滤，收集滤液；
18.s8.脱色除腥：在滤液中加入活性炭，并调节ph值；
19.s9.树脂脱灰：对脱色除腥后的滤液进行脱灰处理；
20.s10.凝胶柱纯化：脱灰液过sephadex g-10柱，收集分子量300-700da的鱼胶肽组份；
21.s11.纳滤浓缩：用分子量180da的纳滤膜对分子量300-700da的鱼胶肽组份进行浓缩， 浓缩至固含30％；
22.s12.冷冻干燥：冷冻干24小时；
23.s13.粉碎：低温超微粉碎至120-200目。
24.优选的，在步骤s4中，按沉淀质量1:3-1:5加入纯化水，添加液体体积2-5％(m/v)的 葡萄糖，在发酵罐内115-121℃，加压提取灭菌10-30提取分钟，降温至40℃。
25.优选的，在步骤s5中，接种发酵菌为枯草芽孢杆菌和酵母菌，枯草芽孢杆菌接种量为 105～107cfu/ml，酵母菌接种量为104～105cfu/ml。
26.优选的，在步骤s5中，接种后发酵温度28-35℃、转速200r/min、通气量1-2.5vvm、 ph自然发酵12h。
27.优选的，在步骤s6中，发酵12h后，按照发酵液的体积一次性补加氯化镁至发酵液终浓 度2-6mmol/l、补加氯化锰至发酵液终浓度1-3mmol/l。
28.优选的，在步骤s6中，补料后发酵温度30-40℃、转速100r/min、通气量0.7-1.5vvm、 ph自然发酵8-12h。
29.优选的，在步骤s8中，将滤液用盐酸调ph至3.0-5.0，加入发酵液体积0.3％(m/v)的 活性炭，45℃保温2h；将吸附液3000r/min进行离心5min，上清液用氢氧化钠调至ph7.0。
30.优选的，在步骤s9中，将脱色脱腥液先过大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，再通过 大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，进行脱灰。
31.本发明还公开了一种具有抗糖基化作用的赤嘴鳘鱼胶肽，根据上述制备方法制得的鱼胶 肽粉剂、口服液。
32.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
33.1、制备得到的赤嘴鳘鱼胶肽的多肽含量≥99％，其中分子量在300-700da的鱼胶肽占比 大于98％，小分子的鱼胶肽更容易被人体吸收；
34.2、赤嘴鳘鱼胶肽体外抗糖基化活性作用明显，具体为对hbalc形成的抑制率达到89.2％；
35.3、保护抗糖基化的赤嘴鳘鱼胶肽产品本身，即能补充人体胶原蛋白，又能减少糖基化终 产物对皮肤成纤细胞的影响。
具体实施方式
36.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
37.实施例1：
38.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，4℃泡发8h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，26℃酶解2h。酶解完成后6000r/min，离心20分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:3加 入纯化水，再加入液体体积2％(m/v)的葡萄糖，在发酵罐内115℃，加压提取灭菌15分钟， 降温至40℃。按105cfu/ml接种枯草芽孢杆菌、104cfu/ml接种酵母菌，接种后发酵温度28℃、 转速200r/min、通气量1.5vvm、ph自然发酵12h。发酵12h后一次性补加氯化镁至终浓度 2mmol/l、补加氯化锰至终浓度1mmol/l，补料后发酵温度30℃、转速100r/min、通气量0.7vvm、 ph自然发酵8h。发酵结束后用截留分子量为5000da的陶瓷膜进行超滤，收集滤液；将滤液 用盐酸调ph至3.0，加入发酵液体积0.3％(m/v)的活性炭，45℃保温2h，将吸附液3000r/min 离心5min，上清液用氢氧化钠调ph至7.0。将脱色脱腥液先通过大孔强酸性苯乙烯系阳离子 交换树脂，再通过大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，进行脱灰。脱灰液过sephadex g-10 柱，收集分子量300-700da的鱼胶肽组份。用分子量180da的纳滤膜对分子量300-700da的 鱼胶肽纯化液进行浓缩，浓缩至固含30％，再对浓缩液进行冷冻干燥24h，采用低温超微粉碎 至120-200目，即得赤嘴鳘鱼胶肽。
39.实施例2：
40.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，6℃泡发10h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，30℃酶解3h。酶解完成后7000r/min，离心25分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:4加 入纯化水，再加入液体体积3％(m/v)的葡萄糖，在发酵罐内121℃，加压提取灭菌20分钟， 降温至40℃。按106cfu/ml接种枯草芽孢杆菌、105cfu/ml接种酵母菌，接种后发酵温度30℃、 转速200r/min、通气量2vvm、ph自然发酵12h。发酵12h后一次性补加氯化镁至终浓度 4mmol/l、补加氯化锰至终浓度2mmol/l，补料后发酵温度35℃、转速100r/min、通气量1.0vvm、 ph自然发酵12h。发酵结束后用截留分子量为5000da的陶瓷膜进行超滤，收集滤液；将滤液 用盐酸调ph至4.0，加入发酵液体积0.3％(m/v)的活性炭，45℃保温2h，将吸附
液3000r/min 离心5min，上清液用氢氧化钠调ph至7.0。将脱色脱腥液先通过大孔强酸性苯乙烯系阳离子 交换树脂，再通过大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，进行脱灰。脱灰液过sephadex g-10 柱，收集分子量300-700da的鱼胶肽组份。用分子量180da的纳滤膜对分子量300-700da的 鱼胶肽纯化液进行浓缩，浓缩至固含30％，再对浓缩液进行冷冻干燥24h，采用低温超微粉碎 至120-200目，即得赤嘴鳘鱼胶肽。
41.实施例3：
42.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，10℃泡发12h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，35℃酶解3h。酶解完成后8000r/min，离心30分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:5加 入纯化水，再加入液体体积5％(m/v)的葡萄糖，在发酵罐内121℃，加压提取灭菌30分钟， 降温至40℃。按107cfu/ml接种枯草芽孢杆菌、106cfu/ml接种酵母菌，接种后发酵温度35℃、 转速200r/min、通气量2.5vvm、ph自然发酵12h。发酵12h后一次性补加氯化镁至终浓度 6mmol/l、补加氯化锰至终浓度3mmol/l，补料后发酵温度40℃、转速100r/min、通气量1.5vvm、 ph自然发酵12h。发酵结束后用截留分子量为5000da的陶瓷膜进行超滤，收集滤液；将滤液 用盐酸调ph至5.0，加入发酵液体积0.3％(m/v)的活性炭，45℃保温2h，将吸附液3000r/min 离心5min，上清液用氢氧化钠调ph至7.0。将脱色脱腥液先通过大孔强酸性苯乙烯系阳离子 交换树脂，再通过大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，进行脱灰。脱灰液过sephadex g-10 柱，收集分子量300-700da的鱼胶肽组份。用分子量180da的纳滤膜对分子量300-700da的 鱼胶肽纯化液进行浓缩，浓缩至固含30％，再对浓缩液进行冷冻干燥24h，采用低温超微粉碎 至120-200目，即得赤嘴鳘鱼胶肽。
43.实施例4：
44.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，6℃泡发10h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，30℃酶解3h。酶解完成后7000r/min，离心25分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:4加 入纯化水，再加入液体体积3％(m/v)的葡萄糖，在发酵罐内121℃，加压提取灭菌20分钟， 降温至40℃。按106cfu/ml接种枯草芽孢杆菌、105cfu/ml接种酵母菌，接种后发酵温度30℃、 转速200r/min、通气量2vvm、ph自然发酵12h。发酵12h后不补料，发酵条件调整为：发酵 温度35℃、转速100r/min、通气量1.0vvm、ph自然发酵12h。发酵结束后用截留分子量为 5000da的陶瓷膜进行超滤，收集滤液；将滤液用盐酸调ph至4.0，加入发酵液体积0.3％(m/v) 的活性炭，45℃保温2h，将吸附液3000r/min离心5min，上清液用氢氧化钠调ph至7.0。 将脱色脱腥液先通过大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，再通过大孔弱碱性苯乙烯系阴离 子交换树脂，进行脱灰。脱灰液过sephadex g-10柱，收集分子量300-700da的鱼胶肽组份。 用分子量180da的纳滤膜对分子量300-700da的鱼胶肽纯化液进行浓缩，浓缩至固含30％， 再对浓缩液进行冷冻干燥24h，采用低温超微粉碎至120-200目，即得赤嘴鳘鱼胶肽。
45.实施例5：
46.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，6℃泡发10h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，30℃酶解3h。酶解完成后7000r/min，离心25分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:4加 入纯化水，再加入液体体积3％(m/v)的葡萄糖，在发酵罐内121℃，加压提取灭菌20分
钟， 降温至40℃。对提胶液进行冷冻干燥24h，采用低温超微粉碎至120-200目，即得赤嘴鳘鱼 胶。
47.实施例6：
48.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，6℃泡发10h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，30℃酶解3h。酶解完成后7000r/min，离心25分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:4加 入纯化水，在发酵罐内121℃，加压提取灭菌20分钟，降温至55℃。按干鱼胶重量加入2％ 原料质量的碱性蛋白酶，55℃酶解3h。酶解结束后用截留分子量为5000da的陶瓷膜进行超 滤，收集滤液；将滤液用盐酸调ph至4.0，加入发酵液体积0.3％(m/v)的活性炭，45℃保 温2h，将吸附液3000r/min离心5min，上清液用氢氧化钠调ph至7.0。将脱色脱腥液先通 过大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，再通过大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，进行 脱灰。脱灰液过sephadex g-10柱，收集分子量300-700da的鱼胶肽组份。用分子量180da 的纳滤膜对分子量300-700da的鱼胶肽纯化液进行浓缩，浓缩至固含30％，再对浓缩液进行 冷冻干燥24h，采用低温超微粉碎至120-200目，即得赤嘴鳘鱼胶肽。
49.实施例7：
50.称取赤嘴鳘干鱼胶10kg，用30倍量的水分两次清洗干净后，加入干鱼胶重量20倍体积 的纯化水，6℃泡发10h，泡发后用匀浆机进行匀浆。向匀浆液中加入匀浆液重量0.4％(m/m) 脂肪酶，30℃酶解3h。酶解完成后7000r/min，离心25分钟，收集沉淀。按沉淀质量1:4加 入纯化水，再加入液体体积3％(m/v)的葡萄糖，在发酵罐内121℃，加压提取灭菌20分钟， 降温至40℃。按106cfu/ml接种枯草芽孢杆菌、105cfu/ml接种酵母菌，接种后发酵温度30℃、 转速200r/min、通气量2vvm、ph自然发酵12h。发酵12h后一次性补加氯化镁至终浓度 4mmol/l、补加氯化锰至终浓度2mmol/l，补料后发酵温度35℃、转速100r/min、通气量1.0vvm、 ph自然发酵12h。发酵结束后用截留分子量为5000da的陶瓷膜进行超滤，收集滤液；将滤液 用盐酸调ph至4.0，加入发酵液体积0.3％(m/v)的活性炭，45℃保温2h，将吸附液3000r/min 离心5min，上清液用氢氧化钠调ph至7.0。将脱色脱腥液先通过大孔强酸性苯乙烯系阳离子 交换树脂，再通过大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，进行脱灰。脱灰液过sephadex g-10 柱，收集分子量1000-2000da的鱼胶肽组份。用分子量180da的纳滤膜对分子量1000-2000da 的鱼胶肽纯化液进行浓缩，浓缩至固含30％，再对浓缩液进行冷冻干燥24h，采用低温超微粉 碎至120-200目，即得赤嘴鳘鱼胶肽。
51.对比：
52.实施例1-7感官对比
53.对比项目：粉末感官(粉末颜色、气味(含腥味))，按照5g鱼胶原肽+100ml温开水溶 解后(溶液颜色、气味(含腥味)、澄清度、口感)。
54.实施例1-7理化对比
55.对比项目：水分、灰分、蛋白质、多肽含量，各分子量占比(300-700、700-2000、＞2000)。
56.实施例1-7赤嘴鳘鱼胶肽抗糖基化活性对比
57.①
赤嘴鳘鱼胶肽对hbalc形成的抑制作用，实验采用血红蛋白-δ葡萄糖酸内酯(hb-δ glu)实验模型。配置50mmol/lδglu干液和终浓度为50mmol/l的氨基胍(作为阳性对
照药)。 共分为10组：基线对照组(200μl血液+0.5mol/l、ph7.4 pbs 40μl)；δglu对照组(200 μl血液+δglu干液40μl)；阳性药对照组(200μl血液+δglu干液40μl及含氨基胍50mmol/l)；7个实施例的实验组(200μl血液+δglu干液40μl及含赤嘴鳘鱼胶肽终浓度 10mg/ml)。每个条件设置3个平行管。37℃暗处孵育16h，期间轻轻摇动。孵育后用糖化血 红蛋白试剂盒(微柱法)测定hbalc的水平。
58.hbalc形成抑制率(％)＝[(b—c)/(b—a)]
×
100。
[0059]
式中a代表基线对照组hbalc的水平；b为δglu对照组hbalc的水平；c为用氨基胍或 赤嘴鳘鱼胶肽处理组的hbalc水平。
[0060]
赤嘴鳘鱼胶肽对对糖基化产物hbalc的形成及百分抑制率的影响
[0061][0062]
在反应体系中加入10mg赤嘴鳘鱼胶肽，实验发现实施例1、2、3、4、6、7制备得到的 赤嘴鳘鱼胶肽均能抑制血红蛋白早期糖基化产物hbal c的形成，其中实施例1、2、3效果最 好，实施例4、7有一定抑制作用，实施例6有少量的抑制作用，而实施例5则无抑制作用。
[0063]
实验说明，实施例1、2、3得到的鱼胶肽抗糖基化作用效果最好，特别是实施例2与阳 性对照药的效果相当。而实施例5赤嘴鳘鱼胶经过同样的前处理，不经过特定的发酵就无抗 糖基化的作用，说明鱼胶本身并不具有抗糖基化作用。实验也表明，只有经过特定的发酵工 艺后，得到的分子量为300-700da的赤嘴鳘鱼胶肽的抗糖基化作用是最强的，如采用碱性蛋 白酶酶解后收集分子量为300-700da的赤嘴鳘鱼胶肽、或发酵后收集分子量为1000-2000da 赤嘴鳘鱼胶肽、或发酵过程中不采用二次补料发酵技术，所制备的赤嘴鳘鱼胶肽有一定的抗 糖基化作用，但效果较差。
[0064]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。