一种嗜酸乳杆菌及其在断奶仔猪饲料中的应用的制作方法

[0001]
本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种嗜酸乳杆菌及其在断奶仔猪饲料中的应用。


背景技术：

[0002]
抗生素在畜牧养殖中广泛和长期应用，确实能促进动物生长、提高产量，但同时也能导致动物胃肠功能紊乱，引起药物残留、耐药菌增加和内源性感染等问题，人们认识到抗生素的弊端，求助于生物防治方法，寻求绿色、无污染和多功能的新型饲料添加剂是饲料业和畜牧业发展的新道路，由此益生菌的诞生打开了新局面。
[0003]
益生菌可产生多种酶，帮助宿主消化吸收，促进蛋白及钙等吸收，还可合成微生物等，维持机体生理代谢，具有抗氧化、提高免疫及调节肠道等功能。
[0004]
嗜酸乳杆菌作为一种益生菌，是人和动物肠道中存活和定植的重要微生物，能够调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，同时嗜酸乳杆菌能分泌抗生物素类物质，对肠道致病菌产生拮抗作用，常被制成生物活性食品及微生态制剂，可改善动物肠道微生态平衡、促进生长及预防疾病；还耐受酸和胆汁、消除乳糖不耐症、降低胆固醇、抑制并治疗腹泻及增强机体免疫等。近年来，发达国家对益生菌的研究较多，我国对益生菌研究较少，尤其对单一嗜酸乳杆菌的研究更少。
[0005]
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。


技术实现要素：

[0006]
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌，具有较好的耐酸性、耐胆盐性和抑菌性，能够调节仔猪的肠道菌群、增强对饲料中营养物质的消化吸收功能，避免断奶仔猪的断奶应激、腹泻、生长停滞等，提高断奶仔猪的生长性能和经济效益。
[0007]
为了实现上述目的，本发明提供一株嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌plbs006，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.16946。
[0008]
根据本发明的嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌取自牛乳。
[0009]
根据本发明的嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌在断奶仔猪的基础日粮中的添加量为200～800mg/kg。
[0010]
根据本发明的嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌在断奶仔猪的基础日粮中的添加量为359～552mg/kg。
[0011]
根据本发明的嗜酸乳杆菌，本发明还提供一种筛选嗜酸乳杆菌的方法，包括以下步骤：
[0012]
步骤一混合菌株的稀释
[0013]
将牛乳放入mrs固体培养基培养，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；
[0014]
步骤二菌株初筛
[0015]
取所述不同梯度的稀释液分别加入lbs琼脂培养基中，摇匀凝固后，再加入lbs琼脂培养基，待完全凝固后，37℃倒置，厌氧培养36～48h；
[0016]
挑取具有乳酸菌典型特点且生长旺盛的单菌落，通过革兰氏染色后，挑取含有革兰氏阳性菌的单菌落在lbs琼脂平板上进行划线培养，37℃倒置，厌氧培养36～48h，重复分离纯化培养至少3次，获得初筛菌落；
[0017]
步骤三菌株复筛
[0018]
将所述初筛菌落接种于mrs培养基上，37℃倒置，厌氧培养36～48h，重复操作3～5次，直到获得单菌株的纯培养物，为复筛菌株。
[0019]
根据本发明筛选嗜酸乳杆菌的方法，所述lbs琼脂培养基在使用时，需先冷却至50℃。
[0020]
根据本发明的嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌在断奶仔猪饲料中的应用。
[0021]
本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌，本发明提供的嗜酸乳杆菌plbs006，具有较好的耐酸性、耐胆盐性和抑菌性。在断奶仔猪日粮中添加适宜水平的嗜酸乳杆菌plbs006，能够调节仔猪的肠道菌群、增强对饲料中营养物质的消化吸收功能，避免断奶仔猪的断奶应激、腹泻、生长停滞等，提高断奶仔猪的生长性能和经济效益。
附图说明
[0022]
图1是本发明嗜酸乳杆菌plbs006的菌落形态图；
[0023]
图2是本发明嗜酸乳杆菌plbs006的生长曲线图。
具体实施方式
[0024]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]
本发明提供了一株嗜酸乳杆菌，拉丁文学名：lactobacillus acidophilus；该嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌plbs006，已于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.16946。
[0026]
本发明的嗜酸乳杆菌取自牛乳，本发明提供了嗜酸乳杆菌plbs006的筛选方法，包括以下步骤：
[0027]
步骤一 混合菌株的稀释
[0028]
将牛乳放入mrs固体培养基37℃培养24小时，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液。
[0029]
步骤二 菌株初筛
[0030]
取不同梯度的稀释液加入冷却约至50℃的lbs琼脂培养基中，摇匀凝固后，再加入冷却约至50℃的lbs琼脂培养基，待完全凝固后，37℃倒置，厌氧培养36～48h。
[0031]
挑取具有乳酸菌典型特点且生长旺盛的单菌落，通过革兰氏染色后，挑取含有革兰氏阳性菌的单菌落在lbs琼脂平板上进行划线培养，37℃倒置，厌氧培养36～48h，重复分
离纯化培养至少3次，获得初筛菌落。
[0032]
步骤三 菌株复筛
[0033]
将初筛菌落接种于mrs培养基上，37℃倒置，厌氧培养36～48h，重复操作3～5次，直到获得单菌株的纯培养物，为复筛菌株。
[0034]
本发明还提供了嗜酸乳杆菌plbs006的鉴定方法，包括形态学鉴定和基因序列鉴定。
[0035]
形态学鉴定
[0036]
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对复筛菌株进行形态观察和生理生化鉴定。
[0037]
(参见图1)
[0038]
由图1可知，菌落边缘整齐无锯齿状，呈乳白色，表面光滑不透明。
[0039]
基因序列鉴定
[0040]
将复筛菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，根据得到的16sr rna序列信息与ncbi的16s数据库进行比对，设置参数identify>95。然后选取identify最高的前30条16s r rna序列(不足则全取)，并利用muscle软件进行序列多重比对后，采用fasttree软件构件系统发育树。结果显示，复筛菌株与已发表的嗜酸乳杆菌lactobacillus sp.hmsc25a02最接近。因此，将复筛菌株归为嗜酸乳杆菌，命名为嗜酸乳杆菌plbs006。
[0041]
为了验证本发明的嗜酸乳杆菌plbs006的菌株性质，本发明进行了菌株性质试验，包括菌株的生长曲线、耐酸性、耐胆盐性和抑菌试验。
[0042]
菌株的生长曲线
[0043]
将嗜酸乳杆菌plbs006按照1.00％的接种量接种于mrs液体培养基中，每2h取样测定波长500nm处的吸光值，以培养时间为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制菌株生长曲线。(参见图2)
[0044]
由图2可知，嗜酸乳杆菌plbs006在mrs培养基中生长迅速，在4h左右进入对数期；30h后进入稳定期。说明嗜酸乳杆菌plbs006生长速率很快，产酸能力较强，适合用作益生菌菌株。
[0045]
耐酸性能测定
[0046]
将嗜酸乳杆菌plbs006接种于mrs液体培养基中，37℃培养20h，得到培养液。用稀盐酸调节mrs液体培养的ph为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5，115℃灭菌30min。然后将培养液分别接种于不同ph的mrs液体培养基中，37℃培养3h，检测各培养液中的活菌数，计算存活率。(参见表1)
[0047]
表1嗜酸乳杆菌plbs006在不同ph条件下的存活率
[0048][0049]
由表1可知，在ph为3.5～4.5的条件下，嗜酸乳杆菌plbs006的存活率均超过90％；在ph为2.5和3.0的条件下，存活率仍能超过80％，说明嗜酸乳杆菌plbs006具有较强的耐酸性能。菌株在ph为1.0～2.0的条件下，活菌下降较快，表明ph为1.0～2.0对嗜酸乳杆菌plbs006有一定的抑制作用。
[0050]
通常情况下胃酸ph为3.0，对照上述耐酸性能试验，表明嗜酸乳杆菌plbs006能够
适应动物肠道环境，具有良好的耐酸性能。
[0051]
耐胆盐性能测定
[0052]
将嗜酸乳杆菌plbs006接种于mrs液体培养基中，37℃培养20h，得到培养液。将胆盐加入mrs液体培养基中，调节胆盐质量分数为0.10％、0.30％、0.50％、1.00％和2.00％，115℃灭菌30min。然后将培养液分别接种于不同胆盐质量分数的mrs液体培养基中，37℃培养3h，检测各培养液的活菌数，计算存活率。(参见表2)
[0053]
表2嗜酸乳杆菌plbs006在不同胆盐浓度条件下的存活率
[0054][0055]
由表2可知，嗜酸乳杆菌plbs006随着胆盐质量分数的增加，存活率降低。嗜酸乳杆菌plbs006在胆盐质量分数0.10％条件下，存活率达99.32％，保持较高的活性；胆盐质量分数0.30％和0.50％条件下，嗜酸乳杆菌plbs006存活率都高于90％，说明对嗜酸乳杆菌plbs006的影响不大；在胆盐质量分数为1％和2％时，嗜酸乳杆菌plbs006的活性虽然下降较快，但存活率高于60％，说明嗜酸乳杆菌plbs006具有较强的耐胆盐性能。
[0056]
抑菌试验
[0057]
将3株病原菌分别接种于na培养基中，37℃培养18h，使其浓度为10亿cfu/ml，得到3种病原菌培养液；分别取3种病原菌培养液于na平板上，涂布均匀，制成病原菌平板；然后将每个平板上对称放置2个牛津杯，数分钟后，分别向每个牛津杯中加入嗜酸乳杆菌plbs006培养液，于37℃下恒温培养48h，观察抑菌圈直径。(参见表3)
[0058]
表3嗜酸乳杆菌plbs006的抑菌试验
[0059][0060]
由表3可知，嗜酸乳杆菌plbs006对3株病原菌的抑菌圈较为明显，抑菌直径均大于10mm，说明嗜酸乳杆菌plbs006对3株病原菌的颉颃能力较强；嗜酸乳杆菌plbs006依靠自身抑制病原菌的生长，可在肠道中维护微生态平衡。
[0061]
由于嗜酸乳杆菌plbs006具有较好的耐酸性、耐胆盐性和抑菌性，因此，本发明将嗜酸乳杆菌plbs006应用于断奶仔猪饲料中，为了验证本发明的嗜酸乳杆菌plbs006在断奶仔猪饲料中的应用价值，本发明还提供一中嗜酸乳杆菌在断奶仔猪饲料中的应用方法。
[0062]
一、试验动物及饲养管理
[0063]
选用遗传背景、胎次和体重相近的21日龄断奶仔猪40头(公母各半)，随机分为4个处理组(每个处理组中公母各半)，包括对照组和三个试验组。预饲7天后，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮基础上添加嗜酸乳杆菌plbs006。饲养试验期21天。
[0064]
试验猪在保育床上饲养，舍温为25℃左右，试验期间所有断奶仔猪自由采食和饮水。基础日粮按照断奶仔猪养殖场的配方配制。
[0065]
二、饲料配方
[0066]
在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，添加量为200～800mg/kg。
[0067]
三、测定指标
[0068]
生长性能
[0069]
开始试验后，记录每天投料量。试验第1、21天清晨对仔猪进行空腹称重，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。
[0070]
肠道形态结构
[0071]
剪取仔猪十二指肠、空肠、回肠样品中段，经常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色后测量隐窝深度和绒毛高度。
[0072]
为了进一步验证本发明的嗜酸乳杆菌plbs006在断奶仔猪饲料中的应用价值，本发明以上述应用方法饲养断奶仔猪，设置如下若干实施例，并对各实施例中断奶仔猪的相关指标进行测定。各实施例中断奶仔猪的饲养管理方法相同，仅改变实施例中嗜酸乳杆菌plbs006的添加量，因此，各实施例中相同的内容不再列出。
[0073]
各实施例中嗜酸乳杆菌plbs006的添加量见表4；各实施例中断奶仔猪的相关指标结果见表5、表6。
[0074]
对比例
[0075]
在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，添加量为0。
[0076]
养殖完成后，测得断奶仔猪的平均日增重为409.56g/d、平均日采食量为603.41g/d、料重比为1.47；测得断奶仔猪的肠道形态结构中，十二指肠的绒毛高度为342.3μm，空肠的绒毛高度为339.6μm，回肠的绒毛高度为324.5μm；十二指肠的隐窝深度为241.9μm，空肠的隐窝深度为232.6μm，回肠的隐窝深度为235.4μm。
[0077]
实施例1
[0078]
在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，添加量为359mg/kg。
[0079]
养殖完成后，测得断奶仔猪的平均日增重为436.55g/d、平均日采食量为621.95g/d、料重比为1.42；测得断奶仔猪的肠道形态结构中，十二指肠的绒毛高度为414.5μm，空肠的绒毛高度为415.7μm，回肠的绒毛高度为411.2μm；十二指肠的隐窝深度为219.5μm，空肠的隐窝深度为220.3μm，回肠的隐窝深度为223.7μm。
[0080]
实施例2
[0081]
在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，添加量为473mg/kg。
[0082]
养殖完成后，测得断奶仔猪的平均日增重为437.07g/d、平均日采食量为619.05g/d、料重比为1.41；测得断奶仔猪的肠道形态结构中，十二指肠的绒毛高度为419.0μm，空肠的绒毛高度为413.2μm，回肠的绒毛高度为415.7μm；十二指肠的隐窝深度为217.8μm，空肠的隐窝深度为219.4μm，回肠的隐窝深度为220.4μm。
[0083]
实施例3
[0084]
在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，添加量为552mg/kg。
[0085]
养殖完成后，测得断奶仔猪的平均日增重为437.82g/d、平均日采食量为620.02g/d、料重比为1.41；测得断奶仔猪的肠道形态结构中，十二指肠的绒毛高度为417.6μm，空肠的绒毛高度为414.8μm，回肠的绒毛高度为413.6μm；十二指肠的隐窝深度为220.3μm，空肠的隐窝深度为221.3μm，回肠的隐窝深度为217.8μm。
[0086]
由于各实施例的实施过程均相同，因此，其他实施例的具体过程不再列出，仅列出上述三个效果较好的实施例。
[0087]
表4各实施例中嗜酸乳杆菌plbs006的添加量mg/kg
[0088][0089]
表5断奶仔猪的生产性能
[0090][0091]
表6断奶仔猪的肠道形态结构
[0092]
[0093]
由上述实施例可以看出，在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，能够提高断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量，降低断奶仔猪的料重比，说明嗜酸乳杆菌plbs006改善了断奶仔猪的肠道微生态平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，促进断奶仔猪的生长。嗜酸乳杆菌plbs006用作饲料添加剂加入到动物饲粮中，可以调节肠道菌群、增强胃肠道的消化吸收功能，保持益生菌优势地位，促进肠胃消化吸收。
[0094]
由上述实施例可以看出，在断奶仔猪的基础日粮中添加本发明的嗜酸乳杆菌plbs006，能够提高断奶仔猪肠道形态结构中十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度，降低十二指肠、空肠、回肠的隐窝深度，说明嗜酸乳杆菌plbs006能够增加小肠内壁表面积，提高小肠对营养物质的吸收，避免断奶应激、腹泻、生长停滞等。嗜酸乳杆菌plbs006用作饲料添加剂加入到动物饲粮中，不仅能够促进动物肠道黏膜绒毛的发育，同时还具有提高动物生长性能的作用。
[0095]
另外，通过上述实施例可以看出，在断奶仔猪的基础日粮中添加嗜酸乳杆菌plbs006的添加量为359～552mg/kg时，断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量和绒毛高度最高，隐窝深度最浅，因此，在断奶仔猪的基础日粮中，嗜酸乳杆菌plbs006的最适添加量为359～552mg/kg。
[0096]
综上所述，本发明提供的嗜酸乳杆菌plbs006，具有较好的耐酸性、耐胆盐性和抑菌性。在断奶仔猪日粮中添加适宜水平的嗜酸乳杆菌plbs006，能够调节仔猪的肠道菌群、增强对饲料中营养物质的消化吸收功能，避免断奶仔猪的断奶应激、腹泻、生长停滞等，提高断奶仔猪的生长性能和经济效益。
[0097]
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。