一组用于诊断特发性膜性肾病的微生物标志物组合及其应用

1.本发明属于生物医学领域，公开了一组用于诊断特发性膜性肾病的微生物标志物及其应用，具体涉及肠道微生物标志物在特发性膜性肾病诊断中的应用。


背景技术：

2.膜性肾病是一种临床多发难治性肾小球疾病，临床突出表现为“三高一低”，即高度水肿，高蛋白尿，高脂血症，低蛋白血症。其病理特征为弥漫性肾小球基底膜(glomerular basementmembrane，gbm)增厚及免疫复合物沉积。近几年相关研究数据表明，膜性肾病的发病率有明显上升趋势，且逐渐趋于年轻化。其中约80％的病例为肾局限性(特发性膜性肾病，imn)，而另外20％与其他全身性疾病或暴露有关(继发性膜性肾病)。
3.这里要提到的特发性膜性肾病(imn)是一种独特的肾脏特异性自身免疫性肾小球疾病，是成人肾病综合征最常见的病因，也是终末期肾病(end stage of renal disease,esrd)的主要可识别病因之一。大多数imn是由m型磷脂酶a2受体抗体(抗磷脂酶a2受体)(85％)、含有7a 的血小板反应蛋白1型结构域(thsd7a)(3％
–
5％)或其他尚未确定的机制(10％)所介导的。目前针对特发性膜性肾病的早期诊断并不十分容易，除了结合生化和免疫性指标外，肾脏穿刺取肾脏组织进行病理检测和igg免疫荧光诊断，对确诊也非常必要，这对患者会造成较大的身体创伤和肾脏损伤。imn的治疗主要采用免疫抑制剂治疗，副作用较大，预后较差，缺乏有效的治疗药物和诊断治疗手段。因此，建立特发性膜性肾病的疾病诊断模型迫在眉睫，这对膜性肾病的早期发现，早期诊断和及时治疗意义重大。
4.存在于人胃肠道中的数万亿细菌-肠道微生物群与人类的健康密切相关，它们与宿主处于共生关系，具有调节免疫，物质代谢，宿主防御，生物屏障等多种功能。因此肠道菌群紊乱影响着多种疾病的发展，如肥胖，癌症，心血管疾病和肾脏疾病等。众多证据表明慢性肾病中肠道菌群发生紊乱，肠-肾轴理论的提出更好的解释了肠道微生物与肾脏疾病的相互作用。
5.随着多种技术的应用以及研究的深入，基于肠道微生态特征建立模型作为诊断疾病的工具逐渐被报道和认可。肠道微生物的个体差异性提示肠道菌具有良好的诊断和预警作用。目前针对特发性膜性肾病的肠道微生物早期诊断模型还未被报道，因此寻找特发性膜性肾病早期诊断的微生物标志物具有重大意义。


技术实现要素：

6.为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种用于区别、鉴定特发性膜性肾病的肠道微生物组合体标志物，有19种微生物组成，通过检测19种肠道微生物的丰度水平，可以实现特发性膜性肾病的早期诊断。
7.本发明经过广泛而深入的研究，通过收集特发性膜性肾病人的粪便样本，分析16s测序结果，首次发现了paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus,coprobacter, romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas,
parabacteroides,,allisonella,bacteroides, butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentified prevotellaceae,odoribacter, citrobacter这19类微生物在特发性膜性肾病样本中相对丰度存在显著差异(p《0.05)，说明了这19类微生物组合体可作为特发性膜性肾病早期诊断的微生物标志物。发现该微生物组合体的试验设计思路见图1所示；所有入组特发性膜性肾病患者和健康对照人群的基本生理指标见表2.
8.表1. 19类菌属拉丁文名称对应的中文名称。
[0009][0010]
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0011]
本发明提供的技术方案之一为：一组微生物标志物，所述微生物标志物是由19类菌属 paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus,coprobacter,romboutsia, roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,allisonella,bacteroides,butyricicoccus, actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentified prevotellaceae,odoribacter和citrobacter组成。
[0012]
本发明提供的技术方案之二为：上述微生物标志物在制备诊断特发性膜性肾病的产品中的应用。优选检测微生物的试剂在制备诊断特发性膜性肾病的产品中的应用，所述微生物为 paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus,coprobacter,romboutsia, roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,,allisonella,bacteroides,butyricicoccus, actinomyces,intestinibacter,
prevotellaceae, odoribacter,citrobacter。
[0024]
本发明提供了一种诊断特发性膜性肾病的产品，所述产品包括检测样本中19类菌属 paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus,coprobacter,romboutsia, roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,,allisonella,bacteroides,butyricicoccus, actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentified prevotellaceae,odoribacter,citrobacter丰度的试剂，其中所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
[0025]
进一步，所述试剂包括检测19类菌属paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium, negativibacillus,coprobacter,romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,, allisonella,bacteroides,butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentifiedprevotellaceae,odoribacter,citrobacter的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
[0026]
进一步，所述特异性的引物是检测19类菌属paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium, negativibacillus,coprobacter,romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,, allisonella,bacteroides,butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentifiedprevotellaceae,odoribacter,citrobacter 16s rrna的引物。
[0027]
本发明的试剂盒包括检测paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus, coprobacter,romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,,allisonella, bacteroides,butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentified prevotellaceae, odoribacter,citrobacter菌属丰度的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
[0028]
作为一种可选择的实施方式，本发明提供了一种基于检测19类菌属paraprevotella,barnesiella, faecalibacterium,negativibacillus,coprobacter,romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas, parabacteroides,,allisonella,bacteroides,butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes, unidentified prevotellaceae,odoribacter,citrobacter丰度的诊断肾病综合征的试剂盒。试剂盒组分如下：dna提取试剂、特异性检测19类菌属16srrna的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶逆转录酶、dnase、rnase抑制剂、depc-水、无菌水、 sybr green荧光染料。
[0029]
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肾病综合征的发展进行判断、对治疗方案进行选择。
[0030]
本发明提供了19类菌属paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus, coprobacter,romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,,allisonella, bacteroides,butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentified prevotellaceae, odoribacter,citrobacter在制备预测特发性膜性肾病的计算模型中的应用。
[0031]
生物标志物
[0032]
术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为dna，也可以为rna，可以是经修饰的dna或者rna，也可以为未经修饰的dna 或者rna。在本文中基因标志物有时也可以称为特征片段。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。
[0033]
根据本发明的实施例，分析特发性膜性肾病的粪便样本，基于16srrna测序数据，对特发性膜性肾病呈现差异的肠道菌群进行统计，从而确定与特发性膜性肾病相关的特异性序列。作为一种优选的实施方案，包括以下步骤：
[0034]
(1)样品的收集与处理：收集相关粪便样本，使用试剂盒进行dna提取，得到核酸样本；
[0035]
(2)文库构建和测序：利用高通量测序进行dna文库构建和测序，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；
[0036]
(3)通过生物信息学的分析方法确定与肾病综合征相关的特异性肠道微生物核酸序列。
[0037]
首先，获得所述个体的粪便样本中的核酸序列的测序数据，所述测序数据包括多个读段；组装所述读段，获得基因集，所述基因集包括多个组装片段，所述基因集中的组装片段为非冗余序列；确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段；依据所述测序数据，分别确定所述基因集中的各个组装片段的丰度，其中包括，分别确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段的丰度；分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定各种微生物的丰度。
[0038]
在本发明中，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如pgm，合成测序的技术平台比如illumina公司的hiseq、miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如pacbio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段。
[0039]
在本发明中，所称的组装可以利用已知序列组装方法或软件进行，例如利用soapdenovo、 velvet等。
[0040]
根据本发明的一个实施例，通过将基因集中的组装片段与微生物参考序列运用软件 metagenemark比对，依据与某种微生物参考序列的相似程度来判断组装片段是否来自该种微生物。所称参考序列指预先确定的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，若目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择ncbi数据库中的各种微生物的参考基因组和或metahit项目公开的dacc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，确定肾病综合征标志物中的各种微生物包含的组装片段包括：将所述基因集中的组装片段分别与所述各种微生物的参考序列进行比对，确定与一种微生物的参考序列的相似性大于或者等于90％的组装片段来自该种微生物。
[0041]
根据本发明的一个实施例，所称的分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定所
述肾病综合征标志物中的各种微生物的丰度的步骤中，微生物的丰度为该种微生物包含的所有组装片段的丰度的中位数或者平均数。
[0042]
术语“丰度差异”是指，与正常或对照的体内微生物水平相比，在患有特发性膜性肾病的患者体内得到更高或更低水平的微生物。从本发明的目的出发，将“丰度差异”视为从正常的或患有疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的微生物水平1.5 倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现象。
[0043]
在本发明中，术语“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为粪便。
[0044]
在本发明中，“受试者”包括能够遭受或罹患肾病综合征的动物，受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在本发明的具体实施方式中，所述受试者为人。
[0045]
在本发明中，术语“试剂盒”包括检测有效量的检测19类菌属的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
[0046]
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断。
[0047]
采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测19类菌属：实时定量反转录pcr、生物芯片检测法、dna印迹法或原位杂交法、免疫检测法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。
[0048]
作为一种优选的实施方式，所述试剂盒通过实时定量反转录pcr检测19类菌属的丰度；更为优选的，所述试剂盒中包括针对19类菌属的特异性引物，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dntps)、taq-聚合酶逆转录酶等酶、dnase、rnase抑制剂、depc-水、无菌水等。
[0049]
术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”。“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针 (例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是dna、rna 或其中的任何排列。
[0050]
本发明的核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
[0051]
本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
[0052]
本发明的有益效果：
[0053]
本发明首次发现了19类菌属paraprevotella,barnesiella,faecalibacterium,negativibacillus, coprobacter,romboutsia,roseburia,ralstonia,butyricimonas,parabacteroides,,allisonella, bacteroides,butyricicoccus,actinomyces,intestinibacter,alistipes,unidentified prevotellaceae, odoribacter和citrobacter与特发性膜性肾病相关，19类菌属的相对丰度在健康对照组与患病组呈现显著性差异。通过检测受试者样本中19类菌属的丰度，可实现特发性膜性肾病的早期诊断。本发明发现的新的微生物组合体标志物特异性高，敏感性强，无创，可提高受试者的生活质量。
附图说明
[0054]
图1是用于发现特发性膜性肾病肠道菌群标志物的样本研究设计
[0055]
图2是19类菌属在特发性膜性肾病样本与健康对照组样本中的丰度图
[0056]
图3是基于微生物组合体标志物的诊断模型的效能评价
具体实施方式
[0057]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0058]
实施例1筛选与肾病综合征相关的肠道菌群
[0059]
1样本的采集
[0060]
所有临床研究都是在受试者知情并自愿的情况下进行的，研究方案得到了北京协和医科大学伦理委员会的批准。从2019年5月至2019年10月，共纳入来自北京协和医院和北京大学第三医院的81名受试者，包括40名imn患者和41名的相应健康对照(见表2)。符合本研究条件的所有imn患者均被准确诊断为符合以下标准:蛋白尿、高脂血症、水肿、低白蛋白血症、免疫荧光检测肾小球中主要的免疫球蛋白4(igg4)沉积以及血小板活化蛋白2r1自身抗体(pla2r1)阳性。患者的排除标准如下:(1)患有复杂疾病、急性和慢性感染的患者；(2)慢性炎症性肠病和腹腔疾病患者；(3)三个月内接受抗生素、免疫抑制剂和功能性食品(益生菌)的患者。健康对照具有以下特点:(1)健康人肾功能正常，无肾脏疾病、腹腔疾病及其他并发症；(2)三个月内从未接受过抗生素、免疫抑制剂和功能性食品(益生菌)的患者。所有参与者的年龄在18-70 岁之间。这两组在年龄和性别上是匹配的。
[0061]
新鲜粪便立即放入无菌试管中，并储存在-80℃
[0062]
表2试验中入组特发性膜性肾病患者和健康志愿者的临床指标汇总
[0063][0064]
2、16s rrna测序
[0065]
样本16s rrna的测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成，具体步骤如下：
[0066]
2.1基因组dna的提取
[0067]
采用ctab或sds方法对样本的基因组dna进行提取,操作步骤按说明书进行。
[0068]
1)样品：吸取1000ul ctab裂解液至2.0ml ep管里，加入20ul溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65度水浴(针对粪便样本，水浴时间2小时)，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解。
[0069]
2)离心取950ul上清，加入与上清等体积的酚(ph8.0)：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。
[0070]
3)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。
[0071]
4)吸取上清至1.5ml离心管里，加入上清液3/4体积的异丙醇，上下摇晃，-20度沉淀。
[0072]
5)12000rpm离心10分钟，倒出液体，注意不要倒出沉淀。用1ml 75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。
[0073]
6)超净工作台吹干或者室温晾干(dna样品不要过于干燥，否则很难溶解)。
[0074]
7)加入51μl ddh2o溶解dna样品，必要时可于55-60℃下孵育10min助溶。
[0075]
8)加rnase a 1ul消化rna，37度放置15min。
[0076]
2.2 dna样本纯度及浓度测定
[0077]
利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。
[0078]
检测参数：基因组dna-胶浓度：1％；电压：100v；电泳时间：40min；上样量：5μl
tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(clean tags)，参照qiime (v1.9.1http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的tags质量控制流程。经过以上处理后得到的tags需要进行去除嵌合体序列的处理，tags序列通过(https://github.com /torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(effective tags)。
[0101]
3.2 otu聚类和物种注释
[0102]
利用uparse软件(uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部effective tags进行聚类，默认以97％的一致性(identity)将序列聚类成为otus(operationaltaxonomic units)，同时会选取otus的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是otus中出现频数最高的序列作为otus的代表序列。对otus序列进行物种注释，用mothur方法与 silva132(http://www.arb-silva.de/)的ssurrna数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)， family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用muscle(version 3.8.31， http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有otus代表序列的系统发生关系。最后对各样本数据进行均一化处理。
[0103]
3.3肠道菌群物种差异分析
[0104]
使用lefse(lda effect size)多级物种差异判别分析进行两组间差异物种(biomarker)，首先采用非参数因子kruskal-wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种；然后采用线性判别分析(lda)来估算每个显著性差异物种的效应大小。筛选标准：lda score》4且p 值《0.05。
[0105]
3.4随机森林预测模型构建
[0106]
为了检测19类菌属区分特发性膜性肾病的诊断效能，选取19类菌属构建随机森林模型，通过受试者工作曲线(roc)来评估模型的性能，根据曲线下面积(auc)来确定模型的准确性，特异性。
[0107]
4、结果
[0108]
结果如图2，图3所示，与正常对照相比，特发性膜性肾病样本中的19类菌属的丰度均存在显著性差异，所构建模型的auc为93.53％，表明该分类模型具有很好的代表性，诊断准确性极高。提示19种微生物的组合具有很高的特异性，很好地区分了特发性膜性肾病，可作为微生物标志物应用于特发性膜性肾病的诊断。这或许是一种监测和预防疾病的新方法。要真正确认微生物组合的可靠性，可能需要在更大的样本数据中进行验证。
[0109]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。