[0001]
本发明属于生物医药领域，涉及一种线粒体靶向性褪黑素及其制备方法和应用，具体涉及一种基于三苯基膦修饰的线粒体靶向褪黑素及其制备方法和应用。
背景技术：[0002]
线粒体是产生氧化应激的主要场所，也是氧化应激的敏感靶点。研究表明，过量的氧化应激能氧化线粒体内的结构和功能蛋白、不饱和脂肪酸和线粒体dna等生物大分子，造成线粒体功能紊乱和细胞的氧化损伤。由氧化应激引起的线粒体功能障碍不仅是重金属等环境污染物和职业有害因素造成机体损伤的重要毒性机制，而且还是神经退行性疾病、代谢性疾病和癌症等疾病发生发展的共同通路。
[0003]
褪黑素(melatonin，mt)是一种强抗氧化剂。褪黑素及其代谢产物能直接接清除各种氧自由基，增强抗氧化酶活性(如谷胱甘肽过氧化物酶)。而且，褪黑素能直接作用于线粒体，通过增加线粒体氧化磷酸化效率，减少氧化磷酸化过程中的电子泄漏。研究表明，褪黑素进入线粒体后，能降低氧化应激，提高氧化呼吸链的功能，维持线粒体膜电位，促进atp的生成和减轻mtdna的氧化损伤。由于具有上述优良性质，褪黑素在拮抗重金属等职业与环境污染物相关的毒性和防治线粒体相关疾病中表现出广阔的应用价值。
[0004]
然而，褪黑素具有高度的脂溶性,广泛分布于细胞膜等膜结构中。褪黑素本身不具备线粒体靶向性，而且线粒体的双层膜结构也使得大部分药物不能充分地穿过双层膜达到线粒体内部发挥作用。因此，亟需开发一种具有线粒体靶向褪黑素，通过降低线粒体活性自由基的水平，来减少线粒体蛋白、脂质和dna等的氧化损伤，从而更加有效地保护线粒体，改善线粒体功能障碍，为重金属等线粒体毒性和线粒体相关疾病的防治提供新思路。
技术实现要素：[0005]
本发明的目的在于提供一种基于三苯基膦修饰的线粒体靶向褪黑素，褪黑素是以线粒体为靶向具有抗氧化作用的药物，可以缓解线粒体氧化损伤，从而调节线粒体介导的病变进程，进而解决了褪黑素拮抗重金属等线粒体毒性的效力不足的技术问题。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
[0007]
一种基于三苯基膦修饰的线粒体靶向褪黑素，选自式(i)代表的化合物及其盐；在式(i)中，r1、r2和r3中的仅有一个为含三苯基膦的取代基，含三苯基膦的取代基如式(ⅱ)或式(ⅲ)所示；
[0008][0009]
其中，n为1-3，x为卤素；
[0010]
当r1为含三苯基膦的取代基时，r2为氢，r3为乙酰基；
[0011]
当r2为含三苯基膦的取代基时，r1为甲基，r3为乙酰基；
[0012]
当r3为含三苯基膦的取代基时，r1为甲基，r2为氢。
[0013]
采用上述技术方案，技术原理如下：三苯基膦是亲脂阳离子，三个苯环增大了分子表面积，并形成离域正电荷。线粒体双层膜的最内侧带负电，三苯基膦可以穿过线粒体的双层疏水膜。由于三苯基膦共价连接褪黑素，褪黑素在三苯基膦的带动下，进入线粒体双层膜中，可实现线粒体靶向的抗氧化作用。本方案的化合物是一种基于三苯基膦修饰的线粒体靶向5-羟基色胺衍生物，将本方案的化合物称为mito-mel(mito-melatonin)。三苯基膦的加入让褪黑素在线粒体高度聚集，而不是弥散在整个细胞中。而线粒体是氧化应激产生的主要场所，又是氧化应激的作用靶点，所以线粒体内高浓度的mito-mel比褪黑素抗氧化功能更好，改善重金属致线粒体损伤效果更明显。
[0014]
本化合物的有益效果主要体现在：
[0015]
(1)可以防治重金属引起的线粒体毒性
[0016]
目前临床上对重金属中毒缺乏特异性的防治措施，虽部分金属络合剂或解毒剂能一定程度上缓解重金属的毒性，但是重金属清除后所产生的继发性损伤是不可逆的，需研发更有针对性的防治药物。基于发明人多年来的研究基础，确定了以线粒体为靶向拮抗重金属毒性的新策略，筛选了褪黑素等能作用于线粒体的内源性小分子化合物，并首次合成了具有线粒体靶向的褪黑素mito-mel，为重金属毒性防治提供新思路。本方案的mito-mel可用于治疗和缓解重金属引起的线粒体损伤和细胞毒性。具体详见实验例1-4中的内容。
[0017]
(2)可以防治线粒体相关疾病
[0018]
本方案的mito-mel可以防治氧化损伤所引起的各类疾病。在实施例5中，发明人构建了百草枯引起的线粒体氧化应激和细胞损伤模型，而使用mito-mel可缓解百草枯引起的细胞损伤。由于慢性百草枯暴露是诱发帕金森氏综合征和其他神经退行性疾病的高危环境因素，所以mito-mel对防治帕金森氏综合征和其他神经退行性疾病具有一定的作用。在实施例6中，发明人使用双氧水处理细胞构建了线粒体氧化损伤模型，而使用mito-mel可有效改善过氧化氢暴露引起的多细胞氧化损伤。线粒体氧化损伤是神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病和癌症等诸多疾病发生发展的共同通路，是研究临床防治的关键环节，所以mito-mel对线粒体氧化损伤具有较好的缓解和治疗作用。
[0019]
(3)增强了褪黑素的抗氧化性能
[0020]
mito-mel除了通过增加线粒体靶向的效果来实现增强褪黑素的抗氧化功能，发明人通过大量体外实验还发现了三苯基膦可以增强褪黑素的体外抗脂质氧化的能力。发明人
进而分析了产生上述现象的原因，由于三苯基膦的加入，褪黑素的亲电子能力加强，能够更为有效地中和自由基，实现了抗脂质氧化的能力的加强。
[0021]
综上所述，褪黑素是迄今发现的最强的内源性自由基清除剂之一，其基本功能是参与抗氧化系统，防止细胞产生氧化损伤。大量临床试验的结果表明，褪黑素具有抗肿瘤、抗氧化、增强肌体免疫力和清除体内自由基等多种生理和药理作用。但外源性补充褪黑素需要达到一定浓度才能显示其生理功能，常规生理剂量浓度为0.3mg，而临床用量通常为3mg，过高的剂量往往会引起头痛、头晕、轻度焦虑、性功能降低等副作用，吸收达到靶标的浓度不够又不能发挥其生理功能。在本方案中，在褪黑素的基础上引入了三苯基膦，可大大减小外源褪黑素发挥生理作用的浓度，褪黑素只需要在比较小的浓度范围内即可发挥抗氧化作用，从而避免了高浓度的褪黑素所引起的毒副作用。本方案的mito-mel是全新化合物，该结构式是全新的新型化合物结构。
[0022]
进一步，一种基于三苯基膦修饰的线粒体靶向褪黑素，选自式(ⅳ)、式(
ⅴ
)或者式(
ⅵ
)所代表的化合物；
[0023][0024]
其中，x为卤素。
[0025]
采用上述技术方案，上述三种化合物具有较好的拮抗重金属线粒体毒性和抗氧化等效果。
[0026]
进一步，一种基于三苯基膦修饰的线粒体靶向褪黑素作为拮抗职业或者环境因素引起的线粒体毒性的药物、抗线粒体氧化损伤的药物或者抗脂质氧化的试剂的应用。
[0027]
采用上述技术方案，重金属产生的线粒体毒性会引起较为严重的细胞损伤，即使清除重金属等职业或者环境因素后，产生的继发性损伤是不可逆的，需要采用有针对性的防治药物。本方案的化合物可用于治疗和缓解重金属引起的线粒体损伤和细胞毒性。褪黑素上修饰有线粒体靶向功能分子三苯基膦，褪黑素可进入线粒体双层膜结构内部，实现对线粒体氧化损伤的治疗作用。mito-mel具有中和自由基、减少氧化损伤的效果，是一种理想的抗氧化的药物。mito-mel具有清除自由基的功效。mito-mel具有抗脂质过氧化的功能，进而减少丙二醛的产生。
[0028]
进一步，式(ⅳ)代表的化合物的制备方法为：由四溴丁酸与三苯基膦反应得到溴化(3-羧丙基)三苯基膦，接下来与碳基二咪唑反应，再与5-甲氧基色胺反应得到产物，产物经蒸馏和重结晶后，得到溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦。
[0029]
采用上述技术方案，四溴丁酸和三苯基膦之间进行反应获得较好的效果，接下来在与羟基二咪唑反应产生稳定的产物，目标产物的产量容易控制，且目标产物稳定。发明人曾尝试使用二溴丁烷作为反应底物，但是二溴丁烷与三苯基磷由于两个溴产生反应，不容
易控制产物，时间超过24h，目标产物消失。
[0030]
进一步，四溴丁酸与三苯基膦在四氢呋喃中反应得到溴化(3-羧丙基)三苯基膦。
[0031]
采用上述技术方案，使用四氢呋喃作为反应溶剂，可保证上述反应稳定进行，并且上述溶剂在反应后容易除去。
[0032]
进一步，溴化(3-羧丙基)三苯基膦在n,n-二甲基甲酰胺中，先与碳基二咪唑反应，再与5-甲氧基色胺反应，获得溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦。
[0033]
采用上述技术方案，使用n,n-二甲基甲酰胺作为反应溶剂，可保证上述反应稳定进行，并且上述溶剂在反应后容易除去。
[0034]
进一步，使用叔丁基氧羰基保护5-甲氧基色胺的亚氨基。
[0035]
采用上述技术方案，溴丁酸和n,n'-羰基二咪唑反应生成中间产物溴丁酸酰色胺时，容易发生聚合反应(副反应)，要用boc保护色胺上的nh，阻止副反应的发生。
[0036]
进一步，式(
ⅴ
)代表的化合物的制备方法为：由1，4-二溴丁烷与n-乙酰-5-羟基色胺在非质子溶剂中，经碳酸钾催化成醚得到n-(2-(5-(4-溴丁氧基)-1h-吲哚-3-基)乙基)乙酰胺，然后与三苯基膦在非质子溶剂中反应，蒸去溶剂后，经蒸馏水重结晶得到溴化(4-((3-(2-乙酰氨基乙基)-1h-吲哚-5-基)氧基)丁基三苯基膦。
[0037]
采用上述技术方案，可形成被三苯基膦修饰的褪黑素，具有线粒体靶向的抗氧化以及拮抗重金属线粒体毒性效果。
[0038]
进一步，式(
ⅵ
)代表的化合物的制备方法为：由四溴丁酸与三苯基膦反应得到溴化(3-羧丙基)三苯基膦，接下来与碳基二咪唑反应，再与褪黑素反应得到产物，产物经蒸馏和重结晶后，得到溴化(4-(3-(2-乙酰氨基乙基)-5-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-4-氧代丁基)三苯基膦。
[0039]
采用上述技术方案，四溴丁酸和三苯基膦之间进行反应获得较好的效果，接下来在与羟基二咪唑反应产生稳定的产物，目标产物的产量容易控制，且目标产物稳定。
[0040]
进一步，四溴丁酸与三苯基膦在非质子溶剂中反应，获得溴化(3-羧丙基)三苯基膦。
[0041]
采用上述技术方案，使用非质子溶剂可保证上述反应稳定进行。
附图说明
[0042]
图1为化合物(式(
ⅶ
))的质谱图。
[0043]
图2为化合物(式(
ⅶ
))的氢谱图。
[0044]
图3为实验例1的实验结果柱状统计图。
[0045]
图4为实验例2的实验结果柱状统计图。
[0046]
图5为实验例3的实验结果柱状统计图。
[0047]
图6为实验例4的实验结果柱状统计图。
[0048]
图7为实验例5的实验结果柱状统计图。
[0049]
图8为实验例6的实验结果柱状统计图。
具体实施方式
[0050]
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0051]
实施例1：式(ⅳ)代表的化合物的制备
[0052]
在本实施例中，式(ⅳ)代表的化合物具体为溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦，具体的化合物结构参见式(
ⅶ
)。
[0053]
式(
ⅶ
)的合成过程大致为：由四溴丁酸与三苯基膦在非质子溶剂中反应得到溴化(3-羧丙基)三苯基膦，去除溶剂后，在非质子溶剂中与碳基二咪唑反应后，再与5-甲氧基色胺反应得到产物，蒸馏去除溶剂后经蒸馏水重结晶得到溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦。
[0054]
式(
ⅶ
)的合成过程具体为：将16.7克4-溴丁酸、26.3克三苯基膦、50毫升四氢呋喃加入到250毫升反应瓶中，加热到60～65℃，搅拌2小时后，看到有固体析出，蒸馏去除四氢呋喃，得到溴化(3-羧丙基)三苯基膦固体42.5克。取溴化(3-羧丙基)三苯基膦10克加入到20毫升n,n-二甲基甲酰胺中，加入n,n'-羰基二咪唑4.2克，室温搅拌30分钟。加入5-甲氧基色胺5.3克(作为优化方案，先使用boc(叔丁基氧羰基)保护色胺上的nh，阻止副反应的发生，后续重结晶时，boc可脱去)，室温搅拌过夜。减压蒸馏去除n,n-二甲基甲酰胺(作为优化方案，旋蒸时选择80℃油浴)，残留物加入50毫升乙酸乙酯搅拌2小时，静置，过滤得到溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦粗品，用500毫升纯水重结晶得到溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦8.4克。
[0055]
合成式(
ⅶ
)的化合物的过程如式(
ⅹ
)所示：
[0056][0057]
在合成式(
ⅶ
)的过程中，发明人尝试使用多种底物，最终发现4-溴丁酸和三苯基膦之间进行反应获得较好的效果，接下来在dmf中与羟基二咪唑反应产生稳定的产物，目标产物的产量容易控制，且目标产物稳定。发明人曾尝试使用二溴丁烷作为反应底物，但是二溴丁烷与三苯基磷由于两个溴产生反应，不容易控制产物，时间超过24h，目标产物消失。另外，dmf目标产物的分离也是本制备路线的难点和关键点之一。实验过程中尝试了水以及多
种有机溶剂，均不能将dmf分离，经反复实验发现通过油泵和油浴，在约80℃可将大部分dmf蒸溜出去。溴丁酸和n,n'-羰基二咪唑反应生成中间产物溴丁酸酰色胺时，容易发生聚合反应(副反应)，要用boc保护色胺上的nh，阻止副反应的发生。
[0058]
本品(本实施例合成的化合物)为类白色结晶固体，化学式c
33
h
34
n2o2pbr，不吸潮，熔点(分解)为115～117℃。本品于水中重结晶得到，可溶于水、乙醇、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等溶剂。微溶于乙酸乙酯。本品在室温下稳定，低温更好。质谱鉴定结果如图1所示，从质谱图中看到分子离子峰521，与结构一致，负离子81为溴同位素。氢谱结果如图2所示，氢谱可以归属化合物各个氢，与化合物一致。
[0059]
式(
ⅴ
)和式(
ⅵ
)代表的化合物也可以用类似的方法合成，式(
ⅴ
)代表的化合物具体见式(
ⅷ
)，式(
ⅵ
)代表的化合物具体见式(
ⅸ
)。
[0060][0061]
式(
ⅷ
)的合成过程为：由1，4-二溴丁烷与n-乙酰-5-羟基色胺在非质子溶剂中，经碳酸钾催化成醚得到n-(2-(5-(4-溴丁氧基)-1h-吲哚-3-基)乙基)乙酰胺，然后与三苯基膦在非质子溶剂中反应，蒸去溶剂后，经蒸馏水重结晶得到溴化(4-((3-(2-乙酰氨基乙基)-1h-吲哚-5-基)氧基)丁基三苯基膦。
[0062]
式(
ⅷ
)波谱数据：
[0063]
氢谱数据(dmso-d6)：δ8.35(1h)，δ7.57～7.66(15h)，δ7.23(1h)，δ7.03(1h)，δ6.98(1h)，δ6.86(1h)，δ5.71(1h)，δ3.94(2h)，δ3.56(2h)，δ2.92(2h)，δ2.37(2h)，δ1.91(3h)，δ1.76(2h)，δ1.49(2h)
[0064]
质谱：[m+h]＝536
[0065]
式(
ⅸ
)的合成过程为：由四溴丁酸与三苯基膦在非质子溶剂中反应得到溴化(3-羧丙基)三苯基膦，去除溶剂后，在非质子溶剂中与碳基二咪唑反应后，再与褪黑素反应得到产物，蒸馏去除溶剂后经蒸馏水重结晶得到溴化(4-(3-(2-乙酰氨基乙基)-5-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-4-氧代丁基)三苯基膦。
[0066]
式(
ⅸ
)波谱数据：
[0067]
氢谱数据(dmso-d6)：δ7.57～7.66(15h)，δ7.23(1h)，δ7.03(1h)，δ6.98(1h)，δ6.86(1h)，δ5.71(1h)，δ3.84(3h)，δ3.56(2h)，δ2.92(2h)，δ2.64(2h)，δ2.44(2h)δ1.91(3h)，δ1.60(2h)
[0068]
质谱数据：[m+h]＝564
[0069]
以下以溴化(4-((2-(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)三苯基膦(式(
ⅶ
))为例研究其生物学功效。
[0070]
实验例1：化合物的毒性研究
[0071]
不同浓度的mito-mel(10um-10mm)处理neuro-2a细胞(小鼠来源神经瘤母细胞)24小时后，检测发现与对照组相比细胞活力没有变化。实验结果如图3所示，图中数据形式为：
mean
±
sem，n＝5。本实验例具体的检测方法如下：细胞活性用cck-8试剂盒进行检测。cck-8是一种基于wst-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂。实验中，将5
×
104个细胞接种于96孔板，每孔总体积100μl。检测细胞活性时，吸取各孔中的培养基，并向其中加入含有cck-8的新鲜培养基100ul(cck-8与培养基的体积比为1：10)，于37℃下孵育2h。然后用酶标仪测定各孔od值，波长选择为450nm，以每组实测值/对照组实测值作为结果进行统计计算。本实验例采用的统计学方法如下(实验例1-6均采用本统计方法)：实验数据采用spss12.0软件进行统计，取p<0.05为相差显著，其中*p<0.05为与对照组相比，#p<0.05为与处理组相比，实验结果用均数
±
标准误(mean
±
sem)表示。
[0072]
实验例2：化合物对重金属镉细胞毒性的保护作用
[0073]
实验结果如图4所示，mito-mel(1mm)能有效改善重金属镉暴露(cdcl2)引起的细胞损伤。而且，在相同条件下，mito-mel对镉暴露24h后细胞活力的保护效果好于非靶向性的melatonin本身。具体检测方法参见实验例1(cck-8法)，在图4中，数据形式为mean
±
sem，n＝5；*表示与对照组相比，p<0.05；#表示与cdcl2处理组相比，p<0.05。
[0074]
实验例3：化合物对氧化应激的改善作用
[0075]
实验结果如图5所示，mito-mel(1mm)能有效降低重金属镉暴露(cdcl2)引起的细胞线粒体氧化应激。而且，在相同条件下，mito-mel对镉暴露24h后清除细胞线粒体氧化应激的能力好于melatonin。本实验例具体检测方法如下(线粒体内氧化应激的检测)：细胞线粒体氧化应激用特异性的线粒体超氧阴离子荧光探针进行检测。将细胞与荧光探针mitosox red(5μm)在37℃孵育10min。孵育后，用荧光酶标仪检测mitosox red的荧光强度。mitosox red的激发波长514nm，在>540nm处收集相关信号。以每组实测值/对照组实测值作为结果进行统计计算。在图5中，数据形式为mean
±
sem，n＝5；*表示与对照组相比，p<0.05；#表示与cdcl2处理组相比，p<0.05。
[0076]
实验例4：改善线粒体膜电位的下降
[0077]
实验结果如图6所示，mito-mel(1mm)能有效缓解重金属镉暴露(cdcl2)引起的细胞线粒体膜电位的下降。而且，在相同条件下，mito-mel对维护细胞线粒体膜电位的效果优于melatonin。本实验例具体检测方法如下(细胞线粒体膜电位(
△
ψm)的检测)：线粒体膜电位用特异性荧光染料tmrm进行检测。实验时将细胞与含有tmrm(20nm)的培养基于37℃孵育20min。孵育后，用荧光酶标仪检测tmrm的荧光强度。tmrm的激发波长和发射波长分别为540nm和580nm。以每组实测值/对照组实测值作为结果进行统计计算。在图6中，数据形式为mean
±
sem，n＝6；*表示与对照组相比，p<0.05；#表示与cdcl2处理组相比，p<0.05。
[0078]
实验例5：mito-mel化合物能有效改善百草枯暴露引起的细胞损伤
[0079]
百草枯(paraquat)是一种快速灭生性除草剂，农业生产中使用范围很广，对人体毒性大。百草枯能特异性地作用于线粒体复合体i，造成线粒体呼吸链电子泄露，进而引起线粒体氧化应激和细胞损伤。新近流行病学研究表明慢性百草枯暴露是诱发帕金森氏综合征和其他神经退行性疾病的高危环境因素。实验中，百草枯处理(250um)神经细胞(neuro-2a)24h后细胞活性下降45％，而mito-mel(1mm)预处理2h能有效改善百草枯暴露引起的细胞损伤。本实验例采用cck-8法对细胞活性进行检测，具体检测方法参见实验例1。实验结果如图7所示，数据形式为mean
±
sem，n＝6；*表示与对照组相比，p<0.05；#表示与paraquat处理组相比，p<0.05。
[0080]
实验例6：mito-mel化合物能有效改善过氧化氢暴露引起多细胞氧化损伤
[0081]
线粒体氧化损伤是神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病和癌症等诸多疾病发生发展的共同通路，是研究临床防治的关键环节。为探讨mito-mel在临床上潜在的应用价值，我们采用过氧化氢处理细胞这一经典的线粒体氧化损伤模型，探讨mito-mel对不同细胞线粒体氧化损伤的保护作用。结果发现，mito-mel预处理(10μm，2h)均能有效改善h2o2处理(500um，12h)引起神经细胞neuro-2a、心肌细胞株h9c2、人脐静脉内皮细胞株huves和肝细胞株hepg2的细胞氧化损伤。本实验例采用cck-8法对细胞活性进行检测，具体检测方法参见实验例1。实验结果如图8所示，数据形式为mean
±
sem，n＝5；*表示与对照组相比，p<0.05；#表示与h2o2处理组相比，p<0.05。
[0082]
实验例7：抗自由基体外实验
[0083]
羟自由基是导致机体损伤最重要的自由基，以过氧化脂质mda(丙二醛)为指标，检测本方案的化合物的抗自由基的能力。本方案取大鼠脑组织匀浆进行体外抗自由基实验。不饱和脂肪酸是参与磷脂的组成部分，一切生物膜均有磷脂成份，神经细胞又是含磷脂最丰富的组织，本实验选择大鼠脑组织(匀浆)作为体外脂质过氧化物的实验材料，使用羟自由基使得不饱和脂肪酸被过氧化，由于mda是脂质过氧化物的分解产物，所以可通过检测mda的生成量，来实现对脂质过氧化物的检测。大鼠脑组织匀浆制备过程为：取sd大鼠3只，断头取脑，冰冷磷酸缓冲液洗去血迹，用ph为7.4的磷酸缓冲液制成10％匀浆，在大鼠脑组织匀浆中分别加入羟自由基、羟自由基和褪黑素、羟自由基和mito-mel(空白对照不加入任何试剂)，后加入feso4和h2o2(终浓度为0.15mmol/l)，37℃温育0.5h,放入冰浴10min终止反应，测定其中mda含量，各种试剂的用量和实验结果如表1所示。
[0084]
表1：mito-mel和褪黑素对羟自由基所致大鼠脑匀浆mda(丙二醛)含量升高的影响(mean
±
sd，n＝6)
[0085][0086]
在表1中，*表示与对照组比较p<0.05，#表示与羟自由基组比较p<0.05
[0087]
实验显示：由feso4和h2o2(终浓度为0.15mmol/l)反应生成的羟基可显著增加mda含量(*，p<0.05),而mt用1，10mmol/l和mito-mel用0.5，5mmol/l均能非常显著的抑制mda的含量增高(#，p<0.05)，且具有明显的剂量依赖性，mito-mel比mt抑制mda的含量增高作用更强。0.5mmol/l的mito-mel抗氧化作用与1mmol/l的mt抗氧化作用相当，5mmol/l的mito-mel抗氧化作用比10mmol/l的mt抗氧化作用略强，但mito-mel用量比mt约低50％。
[0088]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。