转基因水稻mfb-MH3301外源基因纯合/杂合状态的检测方法与流程

转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合/杂合状态的检测方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种转基因水稻外源基因插入的纯合/杂合状态检测的方法，特别涉及转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合杂合状态的pcr检测引物及其检测方法。


背景技术：

[0002]
快速有效地鉴定转基因后代中纯合的转基因植株是育种研究的重要环节，一般要对不同世代的转基因植株进行连续的鉴定分析。传统的传育种过程中，需要不断进行多代自交，工作量大，周期长，利用分子生物学手段可以快速、简便地进行鉴定。纯合的转基因植株不仅可用于育种研究，还可用于制备转基因检测的标准物质。
[0003]
标准物质在研制过程中，也需要对候选物的纯合度进行鉴定，原因是标准物质量值的确定取决于候选物的纯合度，故建立一种操作简单，成本低，快速有效的纯度鉴定方法具有重要意义。
[0004]
复合pcr可以在同一pcr反应体系里加入多条引物，针对同一模板的不同区域进行扩增，以满足一次可检测多个片段存在的需求。通过分析转基因植株的侧翼序列，并设计合适的引物，进行pcr扩增，可以快速、准确地实现对转基因水稻mfb-mh3301纯合体进行身份识别，为后续转基因材料的利用提供技术支持。
[0005]
迄今未止，国内外目前还没有针对转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合/杂合状态的检测方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供检测转基因水稻mfb-mh3301外源基因插入的纯合/杂合状态的pcr检测引物。
[0007]
本发明的目的还在于提供转基因水稻mfb-mh3301外源基因插入的纯合/杂合状态的pcr检测方法。
[0008]
本发明的目的还在于提供转基因水稻mfb-mh3301外源基因插入的纯合/杂合状态的pcr检测试剂盒。
[0009]
一种转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合杂合状态的pcr检测引物，所述引物为：mh3301-ch-f，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；mh3301-ch-r，其核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；mh3301-ch-f1，其核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。
[0010]
本发明根据mfb-mh3301外源插入片段旁侧序列信息，在水稻染色体及外源插入片段部分设计出能够准确检测转基因水稻mfb-mh3301外源基因插入的纯合/杂合状态的复合pcr检测引物。
[0011]
一种转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合/杂合状态的pcr检测方法，按照如下步骤进行：
[0012]
(1)提取待检测水稻样品的dna；
[0013]
(2)以提取的dna为模板，以seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的核苷
酸序列为扩增引物，建立复合pcr扩增体系并进行pcr扩增；
[0014]
(3)如果仅扩增出一条580bp片段，则待检测的样品为纯合转基因水稻mfb-mh3301；如果扩增出580bp和299bp的两条片段，待检测的样品为杂合转基因水稻mfb-mh3301；如果只扩增出一条299bp片段，待检测的样品为其他水稻品种。
[0015]
其中，所述的从待检测水稻样品中提取dna的方法，可以是从植物材料中提取dna的各种常用方法，例如可以是ctab法、sds法或经验证适用于植物dna提取的试剂盒等各种方法。
[0016]
所述pcr扩增体系按照以下方式建立：反应体系的总体积为25.0μl，其中，green master mix缓冲液12.5μl，10μmol/l seq id no.1所示的引物1μl，10μmol/l seq id no.2所示的引物0.5μl，10μmol/l seq id no.3所示的引物0.5μl，25ng/μl dna模板2μl，用去离子水补至25μl。
[0017]
所述pcr扩增的条件为：94℃变性5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃延伸7min。
[0018]
一种转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合杂合状态的pcr检测试剂盒，包括：green master mix缓冲液，引物和双蒸水；所述引物的核苷酸序列为序列表seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的序列。
[0019]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明检测方法能够准确的检测出转基因水稻mfb-mh3301外源基因插入的纯合/杂合状态，建立了操作简单，成本低，快速有效的鉴定纯合体转基因水稻mfb-mh3301方法。
附图说明
[0020]
图1是pcr方法鉴定转基因水稻mfb-mh3301纯合体琼脂糖凝胶电泳图；
[0021]
图中，m：100bp dna marker；1：空白对照；2：mfb-mh3301纯合体；3：mfb-mh3301杂合体；4：其他水稻品种。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0023]
实施例1转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合/杂合状态的pcr检测方法的建立
[0024]
1、引物设计及序列
[0025]
该转化体外源整合结构位于水稻基因组9号染色体上，其中，引物mh3301-ch-f位于5
’
端水稻基因组上；引物mh3301-ch-r位于3
’
端水稻基因组上；引物mh3301-ch-f1位于整合结构上。
[0026]
引物序列
[0027]
mh3301-ch-f：tcttacagttgaaaaccaccgaat(seq id no.1)。
[0028]
mh3301-ch-r：aatccgaaaagaagtctgccat(seq id no.2)。
[0029]
mh3301-ch-f1：gcagcggtatttttcgatcagt(seq id no.2)。
[0030]
2、pcr扩增反应体系及反应程序：
[0031]
反应体系：green master mix缓冲液12.5μl，10μmol/l seq id no.1所示的引物1μl，10μmol/l seq id no.2所示的引物0.5μl，10μmol/l seq id no.3所示的引物0.5μl，25ng/μl dna模板2μl，用去离子水补至25μl。
[0032]
pcr扩增程序：94℃变性5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃延伸7min。
[0033]
3、结果判定
[0034]
纯合转基因水稻mfb-mh3301中仅能扩增出一条580bp的片段；杂合转基因水稻mfb-mh3301同时扩增出两条片段，一条为580bp，另一条为299bp；而其他水稻品种中只能扩增出一条299bp片段。
[0035]
实施例2转基因水稻mfb-mh3301外源基因纯合/杂合状态的pcr检测的应用实验
[0036]
1、植物材料
[0037]
1)转基因水稻mfb-mh3301纯合体；
[0038]
2)转基因水稻mfb-mh3301杂合体；
[0039]
3)其他水稻品种。
[0040]
2.实验方法
[0041]
(1)、植物基因组dna的提取与检测
[0042]
采用植物基因组dna提取试剂盒dp305(天根生化科技有限公司)进行水稻基因组dna提取和纯化。采用紫外分光光度计检测dna浓度与纯度时，dna应在od260处有显著吸收峰，od260/od280比值应为1.7-1.9。
[0043]
(2)、pcr反应体系及反应程序的建立
[0044]
按照实施例1所述的pcr扩增反应体系及反应程序进行。
[0045]
3、实验结果
[0046]
实验结果如图1所示；纯合体mfb-mh3301仅能扩增出一条580bp的片段；杂合体mfb-mh3301样品扩增出两条片段，一条为580bp，另一条为299bp；其他水稻品种只能扩增出一条299bp片段。