类肝组织结构体及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物材料和生物医学工程领域，具体地说，涉及一种类肝组织结构体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.肝脏是人体最大的实体器官，约占人体总重量的2％。作为人体最大的消化腺和新陈代谢中心，肝脏在维持人体的代谢稳态承担着重要角色。肝脏承担着营养物质的合成功能，负责人体内的血清蛋白、氨基酸和糖原的合成和分泌。肝脏还承担着解毒功能，代谢来自内源和外源的代谢废物、药物等化合物。此外，肝脏还承担着包括氨基酸、维生素、脂质和碳水化合物等物质的代谢和储存。
3.由于人体试验的伦理和安全限制，现阶段常用的研究模型是动物模型和平面培养的人体肝实质细胞。由于多种病原体(如丙型肝炎等)的种属特异性以及动物与人类的肝脏功能性蛋白的巨大差异，导致动物的肝脏的病理模型在许多方面都与人体有着本质的差别。而平面培养的人体肝细胞，不仅来源极其有限，而且受限于细胞表面受体的平面群聚状态，导致体外平面培养的成熟肝细胞很快丧失其表型与功能特征。这些问题导致目前常用的研究模型无法在临床前药物检测中准确的预测药物的导致的人类肝脏毒性和肝损伤，难以进行新药的临床前筛选与开发。
4.人体肝实质细胞来源极其有限，体外增殖能力有限且易分化，在一般体外培养条件下极易丧失其表型和功能特征。从干细胞衍生获得的肝细胞，具有来源广泛、易获取、功能良好、体外可长期培养和维持功能等特点，是近年来肝组织研究领域的热点。多种干细胞(诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞和成体干细胞)都具有向肝脏细胞分化的潜力，已经有大量的研究致力于优化和规范不同干细胞分化至肝细胞的过程。但是，现阶段干细胞分化研究面临一个普遍问题：分化不可控(分化不均一、效率较低而且可重复性差)、得到的细胞不成熟而且生理功能较差、分化过程耗时长且产率低等问题，无法获得大量的、无批次内差异、功能稳定的干细胞衍生的肝细胞，无法满足组织发育、肝脏再生和肝病发生与发展方面的基础与应用研究的需求。
5.因此，亟待开发出基于干细胞的生理功能优异的体外人工肝组织，特别是具有较高的白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢等生理功能的人工肝组织，以满足肝组织发育研究、肝组织再生研究、肝脏疾病发生与发展研究、临床前药物检测和新药测试与开发等方面的需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种类肝组织结构体及其制备方法与应用。
7.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种类肝组织结构体(人工肝组织)，所述类肝组织结构体的尺寸大小为0.1～50cm，其宏观结构可以是柱状、块状、片状、囊状、
管状、网格状、编织状或任意形状组合；
8.所述类肝组织结构体包含直径大小为50～2000μm的微丝和内径大小为0.01～300mm的中空通道；其中，所述微丝是由生物相容性材料和细胞通过铸模法或3d打印工艺形成的，呈丝状或圆柱状结构；所述中空通道是由相邻的数根微丝围绕形成的(如图3中上部空白部位所示)；中空通道的大小、形状和分布密度可以根据需求设计；
9.所述细胞至少包含肝细胞；
10.所述类肝组织结构体的杨氏模量为0.1-150kpa。
11.本发明的类肝组织结构体中细胞表型高度一致，以小尺寸(10-50μm)细胞团簇的形式均匀分散在整个结构中，每个小尺寸细胞团簇中的细胞数量小于50个。
12.优选地，所述细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞或成体干细胞，以及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；优选肝脏干细胞及其细胞系、诱导多能干细胞分化得到的肝脏细胞。
13.进一步地，所述细胞还可以包括胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞等中的一种或多种，包括上述细胞及其细胞系，以及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；细胞来源于诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞或成体干细胞，由多种细胞分化得到，或人体各种组织获得；优选成纤维细胞和/或内皮细胞。
14.本发明中，所述生物相容性材料可选自天然水凝胶材料和/或人工合成的水凝胶材料。
15.所述天然水凝胶材料可选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白(纤维蛋白原)、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、dna水凝胶等中的至少一种；优选胶原、纤维蛋白(纤维蛋白原)、明胶和/或明胶衍生物。
16.所述人工合成的水凝胶材料可选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮，以及它们的衍生物或聚合物等中的至少一种；优选聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸。
17.本发明的类肝组织结构体具有高度仿生的生理功能，阳性表达成熟肝组织的标志性基因和蛋白，具有白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢的肝组织生理功能。
18.第二方面，本发明提供类肝组织结构体的制备方法，包括：
19.(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；
20.(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构(图6)制备成三维水凝胶结构体；
21.(3)对三维水凝胶结构体进行后处理；
22.(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得类肝组织结构体。
23.其中，所述细胞至少包含肝细胞。
24.步骤(2)可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体：铸模法、消失模法、生物3d打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻法或激光烧结法等。
25.所述方法可以是通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃。
26.所述方法还可以是通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。
27.步骤(3)所述后处理方法包括稳定化处理和/或牺牲材料处理。
28.其中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物等中的至少一种；优选二价阳离子和/或凝血酶。
29.所述交联试剂的浓度为0.1mm～10m，优选10mm～500mm。
30.对三维水凝胶结构体进行牺牲材料处理，包括去除牺牲材料，所述牺牲材料包括三维水凝胶结构体中的温敏材料(如明胶、胶原蛋白、n-异丙基丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮等)、交联试剂等。
31.步骤(4)对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和/或动态培养。
32.优选地，静置培养在培养皿、多孔板中进行；动态培养在生物反应器、脉动培养装置、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片或灌注等培养系统中进行。
33.肝细胞的分化可以受到多种细胞因子不同程度的调控，体外培养所用细胞培养液是在基础培养液的基础上添加了促进肝细胞分化的细胞因子；其中，所述促进肝细胞分化的细胞因子选自骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、抑癌蛋白m等中的至少一种。其中，骨形态发生蛋白是调控细胞发育的转化生长因子(tgf-β)家族的重要成员之一，具有调控多种干细胞发育分化的功能，研究表明，骨形态发生蛋白是多种干细胞向肝细胞分化过程中必不可少的关键细胞因子；成纤维细胞生长因子对细胞的发育调控起着关键作用，可促进刺激中胚层来源细胞、神经外胚层细胞、外胚层细胞和内胚层来源细胞的增殖，它们对内皮细胞具有趋化和有丝分裂作用，并诱导破坏基底膜的物质的释放；肝细胞生长因子可以刺激肝细胞的增殖，并调节多种细胞生长、运动和形态发生的多功能因子。通过旁分泌或自分泌机制，借助上皮间质的相互作用，在胚胎发生、创伤愈合、血管发生、组织器官再生、形态发生和致癌作用等方面发挥重要作用；抑癌蛋白m是一种属于白介素-6家族的细胞因子，研究表明在胎肝中表达，并可以在胚胎时期促进胎肝细胞的成熟，在肝细胞的分化成熟阶段起着重要的调控作用。
34.本发明中，所述细胞培养液包含100-200ng/ml激活素a，100-300ng/ml骨形态发生蛋白2，100-300ng/ml骨形态发生蛋白4，100-500ng/ml成纤维细胞生长因子4，0.1％-5％v/v二甲基亚砜，100-300ng/ml肝细胞生长因子，1
×
10-5-1
×
10-4
m抑癌蛋白m和1mm抗坏血酸。各因子之间协同作用，共同促进肝细胞的分化和成熟。
35.体外培养条件为：35℃～38℃，5％co2。
36.第三方面，本发明提供按照所述方法制备的类肝组织结构体。
37.所述类肝组织结构体的宏观结构可以是柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合。
38.优选地，所述类肝组织结构体的尺寸大小为0.1～50cm。
39.优选地，所述类肝组织结构体包含直径大小为50～2000μm的微丝。
40.优选地，所述类肝组织结构体具有内径大小为0.01～300mm的中空通道。
41.优选地，所述类肝组织结构体的杨氏模量为0.1-150kpa。
42.本发明的类肝组织结构体中细胞表型高度一致，以小尺寸(10-50μm)细胞团簇的形式均匀分散在整个结构中，每个小尺寸细胞团簇中的细胞数量小于50个。
43.本发明提供的类肝组织结构体具有优异的生理功能，不仅阳性表达成熟肝组织标志性的蛋白和基因，而且具有极高的白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢等生理功能。此外，本发明公开的人工肝组织中的细胞表型高度一致，以独特的均匀分散形式分布，提供一种独特的肝组织模型。
44.第四方面，本发明提供所述类肝组织结构体的以下任一应用：
45.1)肝组织发育研究；
46.2)肝组织再生研究；
47.3)肝脏疾病发生与发展研究；
48.4)临床前药物检测；
49.5)新药开发；
50.6)药物毒理学研究。
51.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
52.(一)本发明的人工肝组织具有优异的生理功能，该人工肝组织具有成熟肝细胞特有的白蛋白分泌、氨代谢和尿素合成的功能，相关基因的表达水平达到人体肝细胞的水平，是平面培养同种细胞的5倍以上。本发明的人工肝组织具有高度仿生的解毒和药物代谢功能，接近或达到甚至超过人体肝细胞水平，相关基因表达水平是平面培养同种细胞的10倍以上。
53.(二)本发明提供了一种生理功能优异的人工肝组织，以独特的均匀分散形式分布，方便观察以及多种鉴定和表征。此外，人工肝组织中的细胞表型高度一致，这为肝脏发育、肝脏再生和肝脏疾病治疗等方面的研究提供了独特的肝组织模型。
54.(三)本发明提供的人工肝组织制备工艺稳定，可批量生产，便于开展大规模研究和应用。采用本发明的人工肝组织制备方法，得到的人工肝组织产率高、成本低、方法稳定、过程可控、批次内/间差异小，可以实现大批量生产，以开展下游大规模研究和应用，可用于肝组织发育研究、肝组织再生研究、肝脏疾病发生与发展研究、临床前药物检测和新药测试与开发等领域。
55.(四)本发明提供的人工肝结构体的宏观和微观形态可调控，可根据需要定制化生产。可采用以下一种或多种技术制备：铸模法、消失模法、生物3d打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻技术法、激光烧结技术法。通过上述方法，可以根据具体需求，制造出形状复杂、尺寸可控的三维结构。还可对三维结构的宏观形状与微观结构进行调控，满足不同细胞对营养物质、氧气浓度和生存微环境的需求。整体结构上既可形成微米和毫米级尺度的微型人工肝结构体，也可形成厘米、甚至分米级尺度的大型人工肝结构体。
56.(五)本发明中的人工肝组织可以进行实时监控，保证批次稳定性。本发明的实施例可形成透明度较高的人工肝组织，能够通过光学显微镜或其他成像设备实时、无损监测
细胞的生长情况，保证批量生产结构的稳定性，是大规模体外研究和体内应用的基础。
附图说明
57.图1为本发明较佳实施例中生理功能优异的人工肝组织的三维结构示意图。其中，a为用铸模法制备的三维立体结构示意图，b为用3d打印法制备三维立体结构的示意图，c为铸模法制备的一种生理功能优异的人工肝结构体的示意图，其中细胞表型高度一致，以均匀分散形式分布于结构体内。
58.图2为本发明较佳实施例中挤出式生物3d打印工艺与多层网格结构示意图。
59.图3为本发明较佳实施例中生理功能优异的人工肝组织的细胞形貌图。光学显微镜下可见大量均匀离散分布的肝细胞。
60.图4为本发明较佳实施例中生理功能优异的人工肝组织中成熟肝细胞关键标志性蛋白表达情况，所有细胞表型高度一致。
61.图5为本发明较佳实施例中人工肝组织的功能情况。其中，a表示本发明人工肝组织、平面培养的同种细胞和人体肝细胞的白蛋白合成和尿素分泌水平；b表示本发明人工肝组织、平面培养的同种细胞、人体肝细胞的解毒和药物代谢关键基因表达水平。**和***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
62.图6为本发明用于构建类肝组织结构体的不同设计结构的示意图。
具体实施方式
63.本发明提供一种生理功能优异的人工肝组织(类肝组织结构体)，其中活性肝细胞均匀离散分布在整个肝组织中。
64.在本发明具体实施方式中，所述人工肝组织的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合。
65.在本发明具体实施方式中，所述人工肝组织具有上尺寸为0.1～50cm的三维结构。在一些具体实施例中，所述人工肝组织具有尺寸为2cm
×
2cm
×
0.2cm的三维结构。
66.在本发明具体实施方式中，所述人工肝组织所述肝组织由直径大小为50～2000μm的微丝组成。
67.在本发明具体实施方式中，所述人工肝组织具有内径大小为0.1～300mm的中空通道。
68.在本发明具体实施方式中，所述人工肝组织的杨氏模量为0.1-150kpa。
69.在本发明具体实施方式中，所述的一种生理功能优异的人工肝组织，其中含有活性细胞，包括但不限于肝细胞。细胞来源于：胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞和成体干细胞等多种细胞及其细胞系，以及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞。优选肝脏干细胞及其细胞系、诱导多能干细胞分化得到的肝脏细胞。
70.在本发明具体实施方式中，所述生理功能优异的人工肝组织，其中的活性细胞除了肝细胞之外，还可以包含以下一种或者多种细胞：由诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞和成体干细胞等多种细
胞分化得到胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞，人体各种组织来源的胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞及其细胞系，以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞。优选成纤维细胞和/或内皮细胞。
71.在本发明具体实施方式中，所述人工肝组织由生物相容性材料制成。
72.在本发明具体实施方式中，所述生物相容性材料选自天然材料和/或人工合成材料。
73.在本发明具体实施方式中，所述天然水凝胶材料选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、dna水凝胶中的一种或多种，优选胶原、纤维蛋白、明胶和/或明胶衍生物；
74.在本发明具体实施方式中，所述人工合成的水凝胶材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮、以及以上材料的衍生物和聚合物中的至少一种，优选聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸。
75.本发明还提供上述一种生理功能优异的人工肝组织的制备方法，包括以下步骤：
76.(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；
77.(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；
78.(3)对三维水凝胶结构体进行后处理；
79.(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得仿生人工肝组织；
80.进一步地，将人工肝组织应用于肝组织发育研究、肝组织再生研究、肝脏疾病发生与发展研究、临床前药物检测和新药测试与开发等领域。
81.按照上述方法可以构建得到一种生理功能优异的人工肝组织，人工肝组织中的细胞表型高度一致，以独特的均匀分散形式分布。
82.根据本发明生理功能优异的人工肝组织的制备方法，可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维结构体：铸模法(或工艺)、消失模法(或工艺)、生物3d打印法(或工艺)、喷墨打印法(或工艺)、熔融沉积成型法(或工艺)、静电纺丝法(或工艺)、静电驱动打印法(或工艺)、立体光刻技术法(或工艺)、激光烧结技术法(或工艺)。
83.在本发明一些具体实施方式中，所述制备方法通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃。
84.在本发明一些具体实施方式中，所述制备方法通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。
85.根据本发明生理功能优异的人工肝组织的制备方法，基于不同制备方法进行结构体后处理，后处理方法主要包括稳定化处理和牺牲材料处理。
86.根据本发明生理功能优异的人工肝组织的制备方法，可以对三维结构进行稳定化处理，得到结构稳定、含有活性细胞的三维结构体。
87.在本发明一些具体实施方式中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的试剂
选自以下的一种或多种：二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物，优选为二价阳离子和/或凝血酶。
88.在本发明一些具体实施方式中，所用的交联溶液的质量百分比浓度为0.1mm～10m，优选10mm～500mm。
89.根据本发明生理功能优异的人工肝组织的制备方法，可以对三维结构进行牺牲材料处理，去除多余材料。包括但不限于通过控制温度去除结构内的温敏材料，通过离子置换作用去除结构内的离子交联的材料，通过酶解去除酶交联的材料。
90.根据本发明生理功能优异的人工肝组织的制备方法，步骤(4)所述对人工肝组织进行培养；或者，进一步地，还包括进行细胞收集和/或检测的步骤。
91.其中，所述人工肝组织可以在一定的培养空间内静置培养或动态培养。人工肝结构体可以培养在各种本领域常用的培养用具中，如培养皿、多孔板等。所述动态培养方法可使用本领域常用的仪器，如借助各种形式的生物反应器、脉动培养、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片、灌注等培养系统。
92.其中，所述生理功能优异的人工肝组织于35℃～38℃，5％co2条件下培养。
93.本发明对细胞培养液和培养方法进行了改良，提高了促进肝细胞分化和维持肝细胞功能的细胞因子浓度，并在现有方案上添加了多种向肝细胞分化的诱导因子，实现不经过细胞扩增过程，直接驱动高效的肝系分化，得到均匀分散分布的肝细胞。本发明的细胞培养方案中，加入以下细胞因子并培养14～20天：100～200ng/ml激活素a(gibco,phg9014)，100～300ng/ml骨形态发生蛋白2(gibco,phc7146)，100～300ng/ml骨形态发生蛋白4(bmp4,gibco,phc9533)，100～500ng/ml成纤维细胞生长因子4(r&d systems,233-fb-025)，0.1％～5％二甲基亚砜(sigma,d2650)，100～300ng/ml肝细胞生长因子(r&d systems，294-hgn-005)，1
×
10-5
m～1
×
10-4
m抑癌蛋白m(invitrogen，phc5015)和1mm抗坏血酸(sigma,1043003)。
94.本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
95.除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
96.本文中使用的术语“交联溶液”是指在三维水凝胶结构形成过程中起到交联作用的溶液，其可以是本领域技术人员公知可用于使得水凝胶材料发生交联从而形成固化结构的材料，例如氯化钙溶液，浓度为0.1mm～10m，优选1mm～100mm，例如100mm浓度的氯化钙溶液。
97.本文中使用的术语“生物打印”是指一种在体外构建具有生物活性的细胞-材料三维空间结构体的先进技术。基于“离散-堆积”原理和计算机设计，经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维成型装置(例如三维打印机)相匹配的方法，将活细胞、基质材料、蛋白质等活性材料作为基本成形原料，进行的三维精确沉积，这一技术在构建复杂结构的多种细胞/外基质材料三维结构体方面具有独特优势。
98.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
99.实施例1利用生物3d打印制备生理功能优异的人工肝组织
100.本实施例提供一种通过生物3d打印设备构建的一种生理功能优异的人工肝组织，如图1所示。
101.1、肝脏祖细胞、人体肝细胞的获得与培养
102.肝脏祖细胞的获得与培养：使用诱导性多能干细胞进行诱导分化，获得肝脏祖细胞。具体实施步骤为：将诱导多能性干细胞接种于matrigel基底(becton dickinson)上培养3～4天。随后培养4天，将诱导性多能干细胞向限定性内胚层阶段进行分化，培养液成分为：l-wnt3a(crl2647；atcc)-expressing cell-conditioned rpmi 1640培养液(life,c11875500bt)，100ng/ml激活素a(activina,gibco,phg9014)，1％glutamax
tm
supplement(gibco,35050061)，1％青链霉素(gibco,15140122)，0.2％fbs(bioind,04-001-1a)，以及1
×
b-27supplement(gibco,17504044)。随后培养5天，将限定性内胚层阶段的细胞诱导分化为肝脏祖细胞。培养液成分为：肝细胞培养基(hcm；lonza)，30ng/ml骨形态发生蛋白4(bmp4,gibco,phc9533)，30ng/ml成纤维细胞生长因子4(fgf4,r&d systems，233-fb-025)，1％glutamax
tm
supplement(gibco,35050061)和1
×
b-27supplement(gibco,17504044)。
103.人体肝细胞的获得与培养：人体肝细胞购自美国康宁公司(gentest人类冷冻肝细胞，454550)。按照说明书将细胞接种于用大鼠尾巴i型胶原蛋白(康宁，biocoat354236)包被的6孔板(thermo scientific，150239)内培养。使用人原代肝细胞培养基(lonza，cc-3198)进行培养，每2-3天更换一次培养液，共培养5天。人体肝细胞用作对照。
104.2、打印溶液的制备
105.gelma是明胶的衍生物，是由明胶与甲基丙烯酸酐(ma)反应制得，明胶侧链上存在的大量氨基被甲基丙烯酸酐中的甲基丙烯酰基取代，形成改性明胶，具有可共价交联、结构长期稳定的特点。制备方法如下：1)将明胶溶于磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)中。完全溶解后，向混合物中加入甲基丙烯酸酐，并搅拌均匀；2)将混合溶液用pbs稀释以终止反应，然后将稀释溶液放入透析膜中在超纯水中透析，以去除有毒和未反应的ma以及其他副产物；3)将最终溶液冷冻干燥储存；4)通过在紫外线(uv)照射，可以将含有光引发剂(irgacure 2959)的gelma的水溶液形成gelma水凝胶。
106.配制21％的gelma水凝胶溶液和21％的纤维蛋白原溶液。
107.加入胰酶(gibco，25200072)消化步骤1获得的肝脏祖细胞，得到单细胞悬液，计数统计之后，与提前加热的gelma溶液/纤维蛋白原混合溶液混合均匀，最终获得的打印溶液中细胞浓度为1
×
107个细胞/ml，7％gelma和7％纤维蛋白原溶液。
108.3、三维打印构建含有细胞的类肝组织三维结构体
109.使用捷诺飞生物科技股份有限公司的生物3d打印设备(regenovo，bio-architect x)构建三维结构体。将步骤2获得的打印溶液装载至打印机上，控制打印机腔内温度、打印底板温度和喷头温度分别为10℃和20℃，按照设计好的cad文件与计算机路径，可以构建多种具有复杂结构的三维立体结构。本实施例中构建了每层6根微丝(微丝的成分同打印溶液)，一共4层，长、宽各2cm，高1mm的立体网格结构，结构示意图如图2所示。构建后使用200mm的凝血酶溶液浸泡结构体20min完成稳定化后处理，得到人工三维结构体。
110.4、人工肝组织培养与功能成熟
111.人工三维结构体构建完成后，于37℃5％co2条件下采用诱导培养基培养20天，获得生理功能优异的人工肝组织。诱导培养基成分为：rpmi 1640培养液，200ng/ml骨形态发
生蛋白2(bmp2,gibco,phc7146)，300ng/ml成纤维细胞生长因子4(fgf4,r&d systems，233-fb-025)，200ng/ml肝细胞生长因子(hgf,r&d systems,294-hgn-005)，5
×
10-5
m抑癌蛋白m(osm,invitrogen,phc5015)，5％二甲基亚砜(sigma)和5％肾上腺素(sigma,e4642)。
112.本发明的诱导培养基含有高浓度的多种促进肝细胞分化的细胞因子，如骨形态发生蛋白，成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子和抑癌蛋白m等。该分化方案促使肝脏祖细胞跨越了扩增阶段，直接进入高效分化阶段，在生物材料与三维微环境的辅助下，最终获得细胞表型均一、分布均匀、生理功能优异的人工肝组织。本实施例制备的人工肝组织结构体的尺寸为：长2cm
×
宽2cm
×
高1mm，具有4层网格结构，杨氏模量为0.5kpa。人工肝组织结构体中的细胞表型高度一致，以小尺寸(10-50μm)细胞团簇的形式均匀分散在整个结构中，每个小尺寸细胞团簇中的细胞数量小于50个。该类肝组织结构体包含直径大小约为300μm的微丝和内径大小约为400mm的中空通道。
113.5、人工肝组织观察与细胞活死比例检测
114.1)第1天、第7天、第14天、第21天分别用光学显微镜(olympus,cx40)每天观察细胞形态变化，并拍摄记录三维结构体内细胞生长形态和细胞团簇形成情况。在第21天，可观察到肝细胞离散存在，且均匀地分布于人工肝组织内部，实施例1制备的一种生理功能优异的人工肝组织的显微形貌见图3。
115.2)第1天、第7天、第14天、第21天分别对人工肝组织进行细胞活死染色检测。本发明使用2um calcein-am(dojindo，c326)和4.5um pi(dojindo，p346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(lscm，nikon，z2)观察记录。对活死染色的照片进行数据统计，各时间点人工肝组织的细胞存活率约在85％以上。
116.6、人工肝组织的功能检测
117.为了检测三维结构体中肝细胞的功能，采用免疫荧光染色检测了标记肝细胞功能的关键蛋白表达(如alb和mrp2)(图4)，采用酶联免疫吸附试验(elisa)检测构建三维组织的肝功能水平，采用qpcr技术检测成熟肝细胞标志性基因的转录水平。
118.免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(pbs)(bi,02-024-1ac)洗涤三维结构体；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用pbs洗涤3次，每次5分钟；含0.3％triton-x(sigma,x100)和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)(multicell,800-096-eg)的混合液封闭1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％triton-x和1％bsa)，alb(abcam，ab83465)和cyp3a4(abcam，ab3572)，4℃过夜孵育。用pbs洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗alexa594(abcam，ab150080)和alexa488(abcam，ab150113)，室温避光孵育2小时后，用pbs洗涤3次，每次5分钟；接着加入dapi染细胞核，室温避光孵育5分钟。用激光共聚焦显微镜(lscm，nikon，z2)观察记录。图4分别为alb蛋白与cyp3a4蛋白染色结果。由图可知，alb蛋白与cyp3a4蛋白均高表达。其中，alb是成熟肝细胞分泌功能的标志性蛋白，cyp3a4是成熟肝细胞药物代谢功能的标志性蛋白。可以看出功能优异的肝细胞离散均匀的分布在生物材料中，具有成熟的白蛋白分泌和药物代谢功能。
119.采用白蛋白分泌检测试剂盒(bethyl，e80-129、e101、e115)和尿素分泌检测试剂盒(bio assay systems，diur-500)按照试剂盒说明书检测所得肝组织的白蛋白分泌和尿素分泌功能。结果显示，实施例1制备的肝组织三维结构体与常规平面培养(所用培养基成
分相同)的细胞相比，人工肝组织白蛋白分泌水平是平面培养同种细胞的7.5倍，尿素分泌水平是平面培养同种细胞的11.3倍，数据均有显著性差异。
120.qpcr检测：
121.提取细胞rna操作：用pbs洗涤三维结构体1次，每个结构体加入1ml trizol(gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的ep管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离心10分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，4℃12000g离心10分钟。弃上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得rna，使用depc水溶解。用spectrophotometer(thermo scientific)来检测rna浓度及纯度。rna反转录操作步骤：采用primescript
tm
ii 1st strand cdna synthesis kit(takara，6210)，按照试剂盒说明书进行操作。rna含量均调整为5ng。引物为oligo dt primer。反转录pcr程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用pcr仪(abi，simpliamptm热循环仪)。荧光定量pcr操作步骤：使用applied biosystems 60x基因检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后，将反应板置于qpcr仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s，40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达。
122.qpcr所用引物见表1：
123.表1
[0124][0125]
[0126]
注：人体肝细胞是目前肝组织研究领域的“黄金标准”，是采用常规平面培养方式进行的(平面培养方式一般在常规培养皿中，如6孔板中进行)；人工肝组织是本实施例中制备的肝组织，具有三维结构，包含一定的物质成分和特定的力学特征。
[0127]
以上基因编码的蛋白是成熟肝细胞解毒和药物代谢功能的标志性蛋白。从实验结果可以看出，本发明人工肝组织的关键肝脏基因表达水平达到甚至超过人体肝细胞的水平，显著性高于平面培养的同种细胞基因表达水平(数据有显著性差异)。
[0128]
实施例2利用铸模法制备生理功能优异的人工肝组织
[0129]
本实施例提供利用铸模法制备多种结构的生理功能优异的人工肝组织，包括如下步骤：
[0130]
1、肝脏干细胞培养
[0131]
heparg是一种由人体肝癌组织获得的肝脏干细胞，具有向肝脏细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。将heparg细胞(sigma，hprgc1)在细胞扩增培养液中进行培养，细胞扩增培养液的成分为：williams'medium e培养液(sigma,w4125)中添加10％fbs血清(gibco,16000)，0.05％胰岛素(sigma,i9278)，5
×
10-5
m氢化可的松琥珀酸酯(sigma,h4881)，1％青链霉素(gibco,15140122)和1％glutamax
tm
(gibco,35050061)。当细胞90％汇合时按照1:5的比例传代，每2-3天更换一次培养液，共培养5天，细胞达到90％汇合时收集使用。
[0132]
2、铸模前体溶液的制备
[0133]
配制16％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(sigma，p2191，分子量30000～60000da，丙交酯和乙交酯的摩尔比为50:50)溶液和30％的i型鼠尾胶原(康宁，biocoat 354236)溶液。
[0134]
向步骤1培养的heparg细胞中加入胰酶(gibco，25200072)，在37℃条件下消化3min后收集，离心得到肝脏干细胞的沉淀，用基础培养基重悬，得到单细胞悬液，对细胞进行计数后按比例稀释，然后与提前加热的聚乳酸-羟基乙酸共聚物/胶原混合溶液混合均匀，最终获得的打印溶液(前体溶液)中细胞浓度为1
×
107个细胞/ml，4％聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和15％胶原溶液。
[0135]
3、铸模法构建含有细胞的结构体
[0136]
将步骤2得到的前体溶液倒入预先设计好的模具中。本实施例中所用的模具示意图如图1所示，形成体积为外圆直径3cm，中央均匀分布直径500um的中空圆柱，高3cm的圆柱体样三维结构体。将模具至于37℃条件下进行交联30min，交联后将成型的结构取出，浸入5％(w/v)的戊二醛溶液进行交联。然后采用诱导分化培养基培养20-25天，得到仿生肝组织。分化培养基成分为：肝细胞培养基(hcm；lonza)，100ng/ml激活素a(activina,gibco,phg9014)，300ng/ml成纤维细胞生长因子4(fgf4,r&d systems，233-fb-025)，500ng/ml肝细胞生长因子(hgf,r&d systems,294-hgn-005)，1
×
b-27(gibco,17504044)，2％glutamax
tm
supplement(gibco,35050061)，5
×
10-3
m氢化可的松琥珀酸钠(常州四药)，10％dmso(sigma)和5％胰岛素(sigma,i9278)。
[0137]
本发明的诱导培养基含有高浓度的多种促进肝细胞分化的细胞因子，如激活素a、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子，促使肝脏干细胞高效分化，在生物材料与三维微环境的辅助下，最终获得细胞表型均一、分布均匀、生理功能优异的人工肝组织。
[0138]
加入培养液后，结构体于37℃5％co2条件下进行培养，每2～3天更换新鲜培养基。期间可用光学显微镜观察细胞形态变化。
[0139]
4、人工肝组织的动态培养
[0140]
本实施例中采用脉动培养，脉动生物反应器参见zl200910079726.8。
[0141]
采用崇州市崇阳众诚不锈钢配件服务部生产的蠕动泵jd-200来提供相应的循环动力，设定其工作电压为12v，流速为60ml/min；直流电机为北京艾克斯电机有限公司生产的电机zgb37rh52i，设定其工作电压为12v、转速为100r/min；采用100ml的注射器；将自制导杆和滑块导轨，以及各部件，如直流电机、导杆、滑块导轨、注射器用自制的支架固定在底板上，连接各部件。
[0142]
细胞培养液循环部分由培养液瓶、蠕动泵和培养盒构成，各部分由硅胶管连接，培养液经硅胶管由蠕动泵从培养液瓶泵入培养盒(内置工程化组织)，然后经硅胶管流回培养液瓶；导轨滑块、注射器和直流电机构成脉动部分，直流电机与导轨滑块连接推动注射器活塞往复运动，注射器与蠕动泵的出液端连接后和培养盒连接，由此形成脉动流；压力表设置在培养盒上，检测置于培养盒内的组织内的培养液压力。
[0143]
在进行体外培养以前，先拆卸脉动生物反应器的连接管、注射器，利用高温高压灭菌。然后接通脉动生物反应器，蠕动泵和直流电机接通，首先在培养液瓶中加入少量75％的酒精，利用酒精在脉动循环系统中流动灭菌；倒掉酒精然后在培养液瓶中加入一定量已灭菌的pbs溶液，利用该溶液冲洗残余酒精。
[0144]
关掉电源，然后在培养液瓶中加入待培养需使用的培养液，用灭菌好的镊子夹住步骤1～3制备的工程化肝组织接到培养盒的接头上。为使工程化组织牢固地接在接头上，用已灭菌的细线固定工程化组织的两头。待脉动生物反应器系统完全连接好后，接通电源，调整蠕动泵的电压为12v，调节人造组织处所受压力到0.1mpa，然后就可以持续运行脉动生物反应器对工程化组织进行脉动培养了。
[0145]
在培养过程中保持上述电压和组织的压力，使线性控制脉动培养过程中脉动频率在100次/分钟。
[0146]
直流电机运行平稳后，带动滑块在导轨上推动注射器活塞往复运动，活塞拉出的时候从培养液瓶中吸取培养液，挤出时把吸入的培养液注入蠕动泵形成的循环系统中流经培养盒中的工程化组织流回培养液瓶。通过调节注射器每次吸入、挤出的培养液的量可调节培养工程化组织处的压力。由此，蠕动泵和直流电机持续运动，脉动生物反应器就提供了一个脉动循环的培养液流实现了对工程化组织的脉动培养。
[0147]
5、人工肝组织观察与细胞活死比例检测
[0148]
1)第1天、第7天、第14天、第21天分别用光学显微镜(olympus,cx40)每天观察细胞形态变化，并拍摄记录三维结构体内细胞生长形态和细胞团簇形成情况。在第21天，在结构内看到肝细胞离散存在，且均匀地分布于结构内。用光学显微镜(olympus,cx40)每天观察细胞形态变化，最终获得的具有肝细胞离散均匀分布表征的人体肝组织结构体的显微形貌。
[0149]
2)第1天、第7天、第14天、第21天分别对人工肝组织内细胞进行活死染色检测。本发明使用2um calcein-am(dojindo，c326)和4.5um pi(dojindo，p346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(lscm，nikon，z2)观察记录。对活死染色的照片进行数据统计，各检测时间点人工肝组织内的细胞存活率约高于85％。
[0150]
6、人工肝组织的功能检测
[0151]
为了检测三维结构体中肝细胞的功能，采用免疫荧光染色检测了标记肝细胞功能的关键蛋白表达(如cyp3a4和alb)，采用酶联免疫吸附试验(elisa)检测构建三维组织的肝功能水平，采用qpcr技术检测成熟肝细胞标志性基因的转录水平。
[0152]
1)免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(pbs)(bi,02-024-1ac)洗涤三维结构体；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用pbs洗涤3次，每次5分钟；含0.3％triton-x(sigma,x100)和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)(multicell,800-096-eg)的混合液封闭1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％triton-x和1％bsa)，cyp3a4(abcam，ab3572)和alb(abcam，ab83465)，4℃过夜孵育。用pbs洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗alexa594(abcam，ab150080)和alexa488(abcam，ab150113)，室温避光孵育2小时后，用pbs洗涤3次，每次5分钟；接着加入dapi染细胞核，室温避光孵育5分钟。用激光共聚焦显微镜(lscm，nikon，z2)观察记录。由结果可知，cyp3a4和alb蛋白均高表达。其中，cyp3a4是成熟肝细胞药物代谢功能的标志性蛋白；alb是成熟肝细胞分泌功能的标志性蛋白。可以看出肝细胞离散且均匀的分布与结构微丝内，具有成熟的分泌和代谢功能。
[0153]
2)采用白蛋白分泌检测试剂盒(bethyl，e80-129、e101、e115)和尿素分泌检测试剂盒(bio assay systems，diur-500)按照试剂盒说明书检测所得肝组织的白蛋白分泌和尿素分泌功能，结果如图5a所示，本实施例制备的肝组织与常规平面培养(所用培养基成分相同)的细胞相比，三维仿生肝组织的白蛋白分泌水平是平面培养细胞的6.3倍，尿素分泌水平是平面培养细胞的9.4倍。本实施例制备的人工肝组织结构体为直径3cm
×
高3cm的圆柱体，圆柱体中央均匀分布19个直径500μm的中空圆柱(图1)。结构体的杨氏模量为1kpa。人工肝组织结构体中的细胞表型高度一致，以小尺寸细胞团簇的形式均匀分散在整个结构中，每个小尺寸细胞团簇(10-50μm)中的细胞数量小于50个。该类肝组织结构体包含直径大小约为400μm的微丝和内径大小约为1000mm的中空通道。
[0154]
3)qpcr检测技术：
[0155]
提取细胞rna操作步骤：用pbs洗涤三维结构体1次，每个结构体加入1ml trizol(gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的ep管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，4℃12000g离心10分钟。弃上清，加入等体积异丙醇，4℃12000g离心10分钟。弃上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得rna，使用depc水溶解。用spectrophotometer(thermo scientific)来检测rna浓度及纯度。rna反转录操作步骤：采用primescript
tm
ii 1st strand cdna synthesis kit(takara，6210)，按照试剂盒说明书进行操作。rna含量均调整为5ng。引物为oligo dt primer。反转录pcr程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用pcr仪(abi，simpliamptm热循环仪)。荧光定量pcr操作步骤：使用applied biosystems 60x基因检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后，将反应板置于qpcr仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s，40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达情况。
[0156]
qpcr所用引物序列见表2：
[0157]
表2
[0158][0159]
以上基因编码的蛋白是成熟肝细胞解毒和药物代谢功能的标志性蛋白。检测结果如图5b和表2所示，人工肝组织各种基因的表达水平达到或高于人体肝细胞的基因表达水平，显著性高于平面培养的同种细胞基因表达水平，数据有显著性差异。
[0160]
本发明提供的人工类肝组织结构体，这种三维的仿生组织具有一定的结构、物质成分、物质排布和力学性能。细胞在组织中的生长及发育情况与常规的平面培养采用了完全不同的方式，而这正是能够成功诱导出特定三维结构的肝组织和生理功能的关键，为下游应用提供了更加接近人体组织的研究模型，添补了该领域的空白。
[0161]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。