1.本发明涉及松萝多糖及其制备方法、应用。
背景技术：
2.松萝(usnea)是子囊地衣纲、茶渍目、松萝科、松萝属的一种地衣植物，主要生于原始森林冷杉、云杉、落叶松、糙皮桦等树上，少见于岩石或土表，国内主要分布在广西、内蒙古、吉林、黑龙江、四川、云南、西藏、陕西、甘肃、新疆等地区；全球主要在北半球分布。松萝属植物是滇金丝猴的主要食物来源，亦可作为环境探测器。目前，松萝属植物已广泛用于染料、化妆品、防腐剂、除臭剂和民间药用植物中。在中国，松萝是中、蒙、藏、维医习用药材，具有清热解毒、止咳、化痰、消炎等功效，其提取物具有抗氧化活性等功效。长松萝(usnea longissima)是《中华本草》上记载的两种松萝植物来源之一，主要分布于我国四川、云南、西藏、东北、陕西、安徽、浙江至广东等省区，附生于云杉和白花杜鹃等乔木的茎和枝条上，是中医、蒙医和藏医民族的常用药材，其药理活性有抗菌、抗炎、解毒等功能。
3.松萝多糖是长松萝的主要活性成分之一，主要成分为地衣多糖(β-葡聚糖)、异地衣多糖(α-葡聚糖)和半乳甘露聚糖等，具有抗氧化性及很高的抗癌活性、提高免疫力的功效。例如中国专利申请(申请公开号为cn110724206a)公开了一种长松萝多糖的提取方法及其应用，其将提取的长松萝多糖用于激活肠道免疫，中国专利申请(申请公开号为cn109576048a)公开了一种从松萝中提取挥发油及同时提取松萝多糖和松萝酸的方法，其中提到松萝多糖可提高健康细胞的免疫能力，抑制癌细胞的病态增殖。然而目前还没有关于长松萝多糖在人体肌肤护理和化妆品中的应用报道。
技术实现要素：
4.本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中松萝多糖在护肤方面的应用有待开发的缺陷，提供一种松萝多糖及其制备方法、应用。本发明提供的松萝多糖的制备方法简单，并且提供了松萝多糖在促进人体皮肤细胞增殖、紫外损伤保护、美白、保湿、提高皮肤伤口修复愈合活性、稳固皮肤基底膜结构和延缓皮肤衰老上方面的应用。
5.本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题：
6.一种松萝多糖的制备方法，包括如下步骤：将松萝原料和水在70-85℃下进行浸提，获得提取液；对所述提取液进行离心取上清液，再经醇沉，即得。
7.本发明中，较佳地，在所述浸提之前，还包括对所述松萝原料进行预处理的步骤，所述预处理较佳地为切碎、粉碎、锤碎；所述切碎可为用小刀切碎。
8.本发明中，所述松萝原料的形态较佳地为颗粒状或粉末状。
9.本发明中，所述松萝原料可为本领域常规的松萝，较佳地为长松萝，更佳地为采自西藏自治区林芝市的色季拉山的长松萝。
10.本发明中，松萝原料和水的料液比较佳地为1:(18-21)，更佳地为1：20。
11.本发明中，所述浸提时的温度较佳地为75-85℃，例如75、80或83℃。
factor 2)基因和ltbp1(latent transforming growth factor beta binding protein 1)基因。
31.其中，col4a1基因表达编码的iv型胶原蛋白能稳定基底膜结构，延缓皮肤衰老。
32.csf2基因表达编码的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，是一种重要的细胞长寿因子，与皮肤衰老密切相关。
33.fgf2基因表达编码的成纤维细胞生长因子(bfgf)在生物体内和体外表现出有效的血管生成作用，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。
34.ltbp1基因表达编码的潜伏转化生长因子β结合蛋白1能调节转化生长因子tgf-β的分泌和活化，参与细胞生长、组织修复和创面愈合。
35.一种皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包括松萝多糖，所述松萝多糖较佳地为前述的松萝多糖。
36.其中，所述松萝多糖在所述皮肤外用剂中的浓度较佳地为0.01-0.5mg/ml，例如为0.01、0.1或0.5mg/ml；或者所述松萝多糖体积百分比为0.08-1.5％，例如为0.1-1.2％，较佳地为0.9％、1％或1.2％。所述体积百分比为所述松萝多糖的体积占所述皮肤外用剂的总体积的百分比。
37.本发明中，所述皮肤外用剂可为本领域常规用于皮肤护理的制剂或产品。
38.其中，所述皮肤外用剂还可按照本领域常规包括辅料。所述辅料可为本领域常规的用于皮肤外用剂的辅料，例如选自增稠剂、乳化剂、保湿剂、抗氧化剂、抗过敏剂、皮肤调理剂、防腐剂、ph调节剂和香精中的一种或多种。
39.所述皮肤外用剂的剂型可为本领域常规的剂型，例如水剂、乳剂或霜剂。
40.本发明的积极进步效果在于：
41.1)本发明提供的松萝多糖的制备方法简单、可操作性强，适合工业应用。
42.2)本发明进一步提供松萝多糖在制备皮肤外用剂中的应用，在皮肤外用剂中可作为具有促进人体皮肤细胞增殖、紫外损伤保护、美白、保湿、提高皮肤伤口修复愈合活性、稳固皮肤基底膜结构和延缓皮肤衰老的作用的活性成分。拓宽了松萝及松萝多糖的应用范围，在护肤和化妆品领域具有潜在的应用前景。
附图说明
43.图1为实施例6中松萝多糖和空白对照组(nt)对col4a1基因表达的影响对比。
44.图2为实施例6中松萝多糖和空白对照组(nt)对抗衰老细胞因子相关基因(csf2、fgf2、ltbp1)表达的影响对比。
具体实施方式
45.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
46.下述实施例中，使用的长松萝原料采自西藏自治区林芝市的色季拉山。
47.下述实施例中，用于培养人永生化表皮hacat细胞、人原代成纤维细胞(fb)等皮肤细胞的培养基为mem(购自gibco货号1109580)完全培养基及dmem(购自gibco货号10569-010)。
48.实施例1松萝多糖样品的制备
49.称取100g长松萝原料，按料液比1:20用去离子水在80℃下浸提3次每次浸提的时间为1h。冷却后过滤，将残渣再浸提一次，合并两次提取液，将滤液离心10min，转速10000rpm/min，收集上清液，用旋转蒸发仪浓缩至微粘稠状，加3倍体积的无水乙醇，静置过夜后抽滤取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤后冷冻干燥，得到粗多糖14g。用硫酸苯酚法检测多糖含量98.4％。
50.实施例2松萝多糖对皮肤细胞增殖的影响
51.角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的皮肤。
52.制备的样品用pbs配制成溶液(浓度参见以下表格)，加入到人永生化表皮hacat细胞或者人原代成纤维细胞(fb)培养液中，以不含样品的pbs溶液加入培养液中为空白对照。培养48小时后，用mtt法对细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度，空白对照的增殖率为100％，参比空白对照，评估对hacat或者fb细胞增殖的影响。
53.由表1结果可知，长松萝多糖对皮肤细胞表皮hacat细胞和成纤维细胞都有一定的增殖促进作用。
54.表1长松萝多糖对皮肤细胞增殖的影响
[0055][0056][0057]
实施例3长松萝多糖对皮肤紫外损伤的保护作用
[0058]
皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(ultraviolet uv)照射是外源性老化形成的主要因素，所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是uva(320nm-400nm)和uvb(280-320nm)。许多研究表明照射到皮肤的的紫外线95％是由角质形成细胞吸收，紫外线uvb则会直接作用于表皮细胞，通过诱导氧化应激、炎症过程进而影响皮肤屏障功能，形成光损伤。因此本实施例用uvb照射人永生化表皮hacat细胞建立皮肤的光损伤模型，利用该模型评估活性物对皮肤紫外损伤的保护作用。
[0059]
人永生化表皮hacat细胞，以5000个/孔种于96孔板中，37℃的5％co2细胞培养箱中培养72小时。然后细胞在含有样品的培养基中培养24小时。将培养基换成pbs后，uvb
(312nm)辐照，剂量为40mj/cm2。再加入含有待测样品的培养基，继续培养24小时，用mtt法检测细胞活力。用没有uvb辐照组做为对照组(uvb-)，uvb辐照组作为对照组(uvb+)。用vc作为阳性对照。
[0060]
由表2结果可知，长松萝多糖对uvb造成的细胞损伤有明显的保护作用。
[0061]
表2长松萝多糖对皮肤uvb损伤的保护作用
[0062][0063][0064]
实施例4长松萝多糖的美白作用
[0065]
近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。人表皮中位于基底层的黑素细胞与周围的角质形成细胞接触并发生联系，构成“表皮黑素单元”，其中黑素是一种含氮的复合物，在黑素小体中进行合成。一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。
[0066]
皮肤的颜色来自于角质形成细胞内存储的黑色素。一般来讲，存储黑色素多的人肤色更深，也更受到保护，远离阳光辐射。黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。酪氨酸酶是结构复杂的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。在人体中酪氨酸酶是皮肤合成黑色素的关键酶。
[0067]
采用l-dopa氧化法测定样品对酪氨酸酶的抑制作用。小鼠黑色素瘤b16细胞以1
×
105密度培养在96孔板中，经24h后，将提取物的样品粉末用pbs溶解后过滤除菌，加入到细胞中培养48h，去掉培养液，每孔加入含1％tritonx-100的pbs缓冲液100μl，然后加入50μl 0.2mg/ml的l-dopa，37℃处理3h后再测定490nm的吸光值。按如下公式计算酶活力：酪氨酸酶抑制率＝[1-(实验组od值/对照组od值]
×
100％。同时用mtt法测定样品对b16细胞的活力影响。
[0068]
由表3结果可知，长松萝多糖对b16细胞活力没有影响，并且能够抑制b16细胞的酪氨酸酶活性。当长松萝多糖的浓度为0.5mg/ml时，酪氨酸酶抑制率比长松萝多糖的浓度为0.1mg/ml时稍高些。
[0069]
表3长松萝多糖对小鼠黑色素瘤b16细胞酪氨酸酶活力影响
[0070][0071]
实施例5长松萝多糖的保湿作用
[0072]
保湿测试原理：根据保湿剂保湿性能的差异，不同保湿剂分子对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同。作用力大的，对水分子结合力强，吸收和保持水的量也较大。含一定水分的样品放在恒温恒湿的干燥器中，定时称量样品质量的减少，称出样品的保水量，通过对比分析，比较出不同样品保湿性的大小。
[0073]
取3m micropore(7.5cm*2.5cm)胶带贴在载玻片上，称重，取1％松萝多糖水溶液200μl均匀涂敷在胶布上，精密称取重量。放入恒温恒湿箱(25℃,65
±
5％)24h后，迅速称量。根据公式计算保湿率。保湿率％＝放置后的水分质量/放置前的水分质量*100％。
[0074]
离体保湿测试：角质层以细膜形式构成保护皮肤第一道屏障，该层的疏水性构成了水扩散的屏障，从而防止脱水。因此，可通过限制经皮水散失来保持和增强皮肤状态。体外测试通过将原料涂抹在皮肤模拟物上烘干，附在敞口的圆筒上，在特定时间测定圆筒中水蒸发量，来模拟经皮水散失过程，评估样品的保湿能力。
[0075]
取3m transpore胶带(4.8*4.8cm)，加入300ul左右1％松萝多糖水溶液，均匀涂敷在胶带表面，在45度鼓风干燥箱放置1h。取称重瓶(开口直径4cm，高2.5cm)，精确加入15ml蒸馏水，称重(a)。将胶带黏在瓶口密闭，在45度鼓风干燥箱放置24h，去掉胶带后称重(b)。根据公式计算经皮失水率。
[0076]
失水率％＝(b-a)/15
[0077]
由表4结果可知，长松萝多糖能够显著降低经皮失水率，具有一定的保湿能力。
[0078]
表4长松萝多糖24小时经皮失水率及保湿率
[0079]
样品经皮失水率(％)保湿率％空白对照(水)33.2
±
1.41.21
±
0.0310％甘油34.4
±
3.813.91
±
0.25***1％透明质酸钠水溶液31.8
±
1.71.60
±
0.04***1％长松萝水溶液25.5
±
1.3**1.47
±
0.16*
[0080]
*p《0.05，**p《0.01，p《0.001
[0081]
实施例6长松萝多糖在提高皮肤伤口修复愈合活性、稳固皮肤基底膜结构和延缓
皮肤衰老上的作用
[0082]
皮肤是我们最大的免疫器官，能保护我们免受外界严苛环境的干扰。但随着年龄的增加及其他因素的影响，我们皮肤结构中相关蛋白表达的变化能引起皮肤外在表型的变化，例如皱纹增加、弹性减少等。而皮肤中蛋白表达受基因调控，因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤修复能力，保持结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。
[0083]
col4a1(collagen type iv alpha 1chain)基因编码iv型胶原蛋白，该蛋白是基底膜的主要成分。在基底膜中，ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白5、肝素等许多分子形成稳定有序的网格结构，这种结构在基底膜的构建和稳定中发挥重要作用。col4a1基因表达上调能够促进dej(基底膜带)的完整性，延缓皮肤衰老。
[0084]
csf2(colony stimulating factor 2)基因编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，是一种重要的细胞长寿因子，与皮肤衰老密切相关。
[0085]
fgf2(fibroblast growth factor 2)基因编码成纤维细胞生长因子(bfgf)，是一种生长因子和信号蛋白，调节特定种类细胞的增殖和分化。此外，fgf-2在生物体内和体外表现出有效的血管生成作用，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。
[0086]
ltbp1(latent transforming growth factor beta binding protein 1)基因编码的潜伏转化生长因子β结合蛋白1能调节转化生长因子(transforming growth factor-β，tgf-β)的分泌和活化。tgf-β是一类具有多效且功能复杂的细胞因子，参与细胞生长、组织修复和创面愈合，血管及瘢痕的生成及肿瘤的发生和转移。所以ltbp1和皮肤伤口愈合、组织修复和抗衰老密切相关。
[0087]
本实验研究松萝多糖是否能影响重建皮肤模型中抗衰老相关基因表达的影响。
[0088]
1.获得的松萝多糖用于基因表达活性测试，步骤为：
[0089]
(1)皮肤模型的制备
[0090]
从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(nhdf)及人原代角质细胞(nhek)。将人原代成纤维细胞复苏，培养消化后与胶原混合进行3天的真皮阶段培养，然后将人原代角质细胞消化接种到真皮阶段培养的皮肤模型表面，再依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至26天得到可用于检测的3d皮肤模型。
[0091]
在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面后浸没培养的第4天，根据所使用培养基的不同进行分组，分为空白对照(nt)组、含松萝多糖(1％，v/v)组。气液相培养的第1天和第4天按相同比例将红米发酵液稀释到培养基中进行培养，气液培养第8天收皮用于后续rna提取。
[0092]
(2)rna的提取
[0093]
剪取3d皮肤模型组织约2*3mm，放入2ml ep管中；加入1ml trizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5ml ep管中；加入200μl氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；9000rpm、4℃条件下离心15min；转上层水相(约400μl)于新1.5ml ep管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，
8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清，沉淀于空气干燥5～10分钟，溶于30μl depc(焦炭酸二乙酯)水中；分光光度计测定rna浓度。
[0094]
(3)基因表达分析
[0095]
根据quantigene r 2.0 plex assay试剂盒进行rna的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析，检测相关基因的表达水平，结果如图1、2。
[0096]
a.松萝多糖提高col4a1基因的表达
[0097]
由图1可知，相较于空白对照组(nt)，添加1％松萝多糖后，与基底层相关的蛋白col4a1上调1.55倍。col4a1基因编码合成的iv型胶原蛋白是基底膜的主要成分，其和层粘连蛋白5、肝素等许多分子形成形成稳定有序的网格结构，这种结构在基底膜的构建和稳定中发挥重要作用。因此，松萝多糖通过上调col4a1基因促进ⅳ型胶原蛋白表达，稳定基底膜结构，延缓皮肤衰老。
[0098]
b.松萝多糖提高抗衰老细胞因子相关基因的表达
[0099]
由图2可知，相较于空白对照组(nt)，添加松萝多糖后，细胞抗衰老生长因子相关基因表达有不同程度的上调。相对nt组相比，1％松萝多糖使csf2基因表达上调4.96倍，使ltbp1基因表达上调1.54倍，使fgf2基因表达上调1.76倍。csf2基因编码集落刺激因子是一种重要的细胞长寿因子，能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能。fgf2基因编码成纤维细胞生长因子能调节特定种类细胞的增殖和分化，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。ltbp1基因编码的潜伏转化生长因子β结合蛋白1能调节转化生长因子tgf-β的分泌和活化，参与细胞生长、组织修复和创面愈合，与抗衰老密切相关。松萝多糖通过上调csf2、fgf2和ltbp1基因促进集落刺激因子、成纤维细胞生长因子和转化生长因子tgf-β的表达，促进细胞的增殖分化、伤口愈合和组织再生，减弱衰老进程。
[0100]
由以上基因表达测试结果可知，相对于空白对照组(nt)，添加松萝多糖后，基底层蛋白相关基因col4a1和抗衰老细胞因子基因csf2、fgf2和ltbp1的表达均有不同程度的升高。col4a1基因编码iv型胶原蛋白能稳定基底膜结构，延缓皮肤衰老；csf2基因编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，是一种重要的细胞长寿因子，与皮肤衰老密切相关。fgf2基因编码成纤维细胞生长因子(bfgf)在生物体内和体外表现出有效的血管生成作用，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。ltbp1基因编码的潜伏转化生长因子β结合蛋白1能调节转化生长因子tgf-β的分泌和活化，参与细胞生长、组织修复和创面愈合。由此，本发明松萝多糖可提高皮肤伤口修复愈合活性、稳固皮肤基底膜结构和延缓皮肤衰老。
[0101]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。