基于末梢血确定罹患癌症的手段的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及分离循环游离核酸的方法、构建测序文库的方法及其应用，更具体的，本发明涉及从末梢血血浆分离循环游离核酸的方法、构建末梢血循环游离核酸测序文库的方法、对末梢血循环游离核酸进行测序的方法、末梢血肿瘤标志物检测的方法、末梢血分析系统。


背景技术：

2.随着癌症发生发展相关基因突变的不断发现，基于监测外周血ctdna(circulating tumor dna，循环肿瘤dna)中个体患者癌症驱动基因突变变化的“液体活检”，由于其可重复性高、实时监测癌症动态变化等特点，在临床研究中受到广泛关注。ctdna是一种存在于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外dna，主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体及循环肿瘤细胞，大小通常为160
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180bp。作为cfdna(cell free dna，细胞游离dna)中特殊类型，ctdna能够直接反映肿瘤患者的基因信息。相比于其他传统的肿瘤标志物，ctdna有半衰期短，假阳性率低，实时反映肿瘤本身的特点。对ctdna进行二代测序可以检测并定量癌症负荷。另外，以往的报道显示突变的cfdna片段往往要比不含突变的cfdna要短，利用这一特点可以提高检测灵敏度。在肿瘤发展阶段，ctdna含量通常在晚期或转移性肿瘤中相对较高。而早期或局限性肿瘤中含量较低。目前常规的液体活检技术至少要求10ml静脉外周血，来保证有足够的cfdna用于检测。静脉外周血样本的采集需要专业的护士进行操作，会带来一定的局限性。另外，对于外周血的血浆分离通常需要经过2步离心操作，第一步全血样本1600g 4℃离心10分钟，吸取上清血浆，第二步16000g 4℃离心10分钟，进一步去除细胞碎片以及其他杂质。对于10ml外周血的离心通常需要用到大型离心机，而目前市面上能进行16000g高速离心操作的角转子通常只有6
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8通道。这个通量大大限制了临床应用，延长操作时间。
3.因此，现有循环肿瘤dna的检验手段仍有待改进。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。由此，本发明提出了一种采血操作简单方便、用血量少、成本低的癌症筛查方法，以利于基于二代测序的癌症筛查方法能够更容易被大众接受并服务于大众。
5.在本发明的第一方面，本发明提出了一种从末梢血血浆分离循环游离核酸的方法，其包括：(1)利用pbs，将不超过500微升末梢血血浆定容至1ml，以便获得血浆稀释液；(2)利用蛋白酶k，对所述血浆稀释液进行裂解处理，以便获得裂解液；(3)将所述裂解液与结合缓冲液混合；(4)将步骤(3)中所得到的混合物上样至硅胶膜柱，使所述硅胶膜柱吸附dna；(5)对步骤(4)中得到的吸附有dna的硅胶膜柱依次进行清洗和干燥处理；(6)利用无核酸酶水对所述吸附有dna的硅胶膜柱进行一次洗脱处理，以便获得一次洗脱液；和(7)利用所述一次洗脱液对经过一次洗脱的所述硅胶膜柱进行二次洗脱处理，以便获得含有循环游
离核酸的溶液，其中，可选的，在步骤(1)中将50微升～500微升的血浆定容至1ml，可选的，所述一次洗脱处理和所述二次洗脱处理分别独立地通过在20000g的条件下离心1分钟进行的。本发明的发明人通过大量的实验证明，通过上述方法进行末梢血血浆分离循环游离核酸，能够获得足够量的核酸样本，后续对该核酸样本进行测序文库构建，测序结果分析等发现，当采用这种方法得到的结果与静脉外周血检测结果一致，从而本发明的方法采血操作简单方便、用血量少、成本低，并且适用于进行癌症筛查，从而利于基于二代测序的癌症筛查方法能够更容易被大众接受并服务于大众。
6.根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征的至少之一：
7.根据本发明的实施例，所述裂解处理进一步包括：将含有蛋白酶k、载体rna、裂解缓冲液和血浆稀释液的混合物混合均匀后，将所得到的混合物在60摄氏度下孵育30分钟，其中，基于1毫升所述血浆稀释液，所述蛋白酶k的用量为100微升，所述裂解缓冲液的用量为800微升，所述载体rna的用量为1.0微克。
8.根据本发明的实施例，在进行步骤(4)之前，预先将步骤(3)中所得到的混合物在冰上孵育5分钟。
9.根据本发明的实施例，在步骤(5)中，所述干燥处理，是在56摄氏度的金属浴条件下进行10分钟。
10.根据本发明的实施例，所述血浆预先通过下列步骤获得的：(i)采用含有k2
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edta抗凝剂的收集管，收集500微升末梢血，优选地，所述收集管为bd microtainer一次性末梢血样采集容器；(ii)将所述末梢血在4摄氏度的温度下进行1600g离心10分钟，并收集上清液，以便去除血细胞；(iii)将步骤(ii)中得到的上清液进行16000g离心10分钟，并收集上清液，以便去除包括细胞碎片的杂质，并获得所述血浆。
11.在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建末梢血循环游离核酸测序文库的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(a)将根据前面所述方法获得的循环游离核酸进行末端修复和加a尾处理，以便获得具有a尾的循环游离核酸，所述循环游离核酸的起始用量为0.5～2.5ng；(b)将所述具有a尾的循环游离核酸进行接头连接反应，以便获得具有接头的连接产物；和(c)对所述连接产物进行扩增处理，以便获得所述末梢血循环游离核酸测序文库，可选的，在步骤(b)之后，对所述连接产物进行第一纯化，在步骤(c)之后，对所述末梢血循环游离核酸测序文库进行第二纯化，所述第一纯化和所述第二纯化是采用磁珠纯化进行的。
12.根据本发明的实施例，发明人发现，通过采用本发明的方法，能够有效地基于0.5～2.5ng前述得到的循环游离核酸，有效地构建可以用于后续测序和分析的测序文库。
13.根据本发明的实施例，上述方法还可以就有下列附加技术特征的至少之一：
14.根据本发明的实施例，在步骤(b)中，所述连接反应体系含有6微升连接缓冲液、2微升dna连接酶、2微升接头溶液，其中，当所述循环游离核酸的起始用量为不小于0.5ng并且小于1ng时，所述接头溶液的接头浓度为150nm，当所述循环游离核酸的起始用量为不小于1ng并且不小于2.5ng时，所述接头溶液的接头浓度为750nm。
15.根据本发明的实施例，在步骤(c)中，当所述循环游离核酸的起始用量为不小于0.5ng并且小于1ng时，所述扩增反应进行12轮，当所述循环游离核酸的起始用量为不小于1ng并且不小于2.5ng时，所述扩增反应进行10轮。
16.在本发明的第三方面，本发明提出了一种对末梢血循环游离核酸进行测序的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所述的方法，构建测序文库；和对所述测序文库进行测序，以便获得测序数据。如前所述，根据前面方法构建的测序文库，能够有效地用于核酸测序和测序结果的分析，以便用于进行癌症分析。
17.根据本发明的实施例，该方法进一步包括：对所述测序数据进行分析，以便分析基因拷贝数变异以及片段化模式。
18.在本发明的第四方面，本发明提出了一种基于末梢血进行早期确定罹患癌症概率的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：从待测个体，获取不超过500微升末梢血血浆；利用样本稀释液，将不超过100微升的所述末梢血血浆进行稀释，以便获得血浆稀释液，所述稀释的倍数为1～5倍；对所述血浆稀释液进行蛋白肿瘤标志物检测，所述肿瘤标志物包括cea、afp、ca
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724、ca
‑
199、ca
‑
125、ca
‑
153和cyfra；根据前面所述的方法，对剩余所述末梢血血浆中的循环游离核酸进行测序和分析，以便获得基因拷贝数变异以及片段化模式信息；基于所述基因拷贝数变异以及片段化模式信息和所述蛋白肿瘤标志物检测结果，确定所述待测个体罹患肿瘤的概率。发明人发现，对于末梢血例如指尖血，通过采用常用的稀释液例如pbs，能够获得有效的蛋白肿瘤标志物检测结果，以便用于后续的癌症分析。
19.在本发明的第五方面，本发明提出了一种对末梢血循环游离核酸进行测序的设备，根据本发明的实施例，该设备包括：测序文库构建装置，所述测序文库构建装置适于前面任一项所述的方法，构建测序文库；测序装置，所述测序装置适于对所述测序文库进行测序，以便获得测序数据。利用该设备，能够有效地实施前面对末梢血循环游离核酸进行测序的方法。
20.根据本发明的实施例，该设备进一步包括：测序数据分析装置，用于对所述测序数据进行分析，以便获得基因拷贝数变异以及片段化模式信息。
21.在本发明的第六方面，本发明提出了一种基于末梢血进行早期确定罹患癌症概率的系统，根据本发明的实施例，该系统包括：末梢血浆获取设备，用于从待测个体，获取不超过500微升末梢血血浆；蛋白分析设备，所述蛋白分析设备适于：利用样本稀释液，将不超过100微升优选80微升的所述末梢血血浆进行稀释，以便获得血浆稀释液，所述稀释的倍数为1～5倍优选4倍；和对所述血浆稀释液进行蛋白肿瘤标志物检测，所述肿瘤标志物包括cea、afp、ca
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724、ca
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199、ca
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125、ca
‑
153和cyfra；根据前面所述的测序设备，用于根据前面所述的方法，对剩余所述末梢血血浆中的循环游离核酸进行测序和分析，以便获得基因拷贝数变异以及片段化模式信息；检测结果分析设备，用于基于所述基因拷贝数变异以及片段化模式信息和所述蛋白肿瘤标志物检测结果，确定所述待测个体罹患肿瘤的概率。利用该系统能够有效地实施前面所述的末梢血分析方法。
22.在本发明的第七方面，本发明提出了一种测序文库，其是根据前面任一项所述的方法构建的。
23.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
24.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得
明显和容易理解，其中：
25.图1显示了根据本发明的一个实施例，不同品牌末梢采血管样本的凝血发生率。
26.图2显示了根据本发明的一个实施例，不同品牌末梢采血管的总评分比较。
27.图3显示了根据本发明的一个实施例，t1样本50μl、100μl、500μl血浆提取cfdna质控图拟合图。
28.图4显示了根据本发明的一个实施例，根据本发明的方法获得的测序文库的质控图。
29.图5显示了根据本发明的一个实施例，基于50μl血浆与4000μl血浆进行cnv变异检测的结果对比(上图)以及基于100μl血浆与4000μl血浆进行cnv变异检测的结果对比(下图)。
30.图6显示了根据本发明的一个实施例，50μl血浆、100μl血浆与4000μl血浆中cfdna片段大小分布情况图。
31.图7显示了根据本发明的一个实施例，建库起始量2ng，建库试剂用量1/5与建库起始量44ng，建库试剂用量不变构建的文库测序数据分析获得cnv变异的结果对比。
32.图8显示了根据本发明的一个实施例，建库起始量2ng，建库试剂用量1/5与建库起始量44ng，建库试剂用量不变构建的文库测序数据片段大小对比。
33.图9显示了根据本发明的一个实施例，针对每个检测项目分析了稀释后浓度乘以稀释倍数得到的蛋白浓度与稀释前比较。
具体实施方式
34.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
35.实施例1指尖血采集
36.需要的耗材：bdmicrotainer一次性使用末梢血样采集容器(品牌：bd，货号：365974)、一次性使用采血器(品牌：bd，货号：366594)、酒精棉片。找到穿刺部位，紧握受试者穿刺部位。用酒精棉片对要穿刺的部位进行消毒。拿一个一次性使用采血器，拧下护帽解除密封并丢弃。对准穿刺部位紧按采血器，使之激活。听到卡嗒一声前不要从穿刺部位移走采血器。拿一个一次性使用末梢血样采集容器，拧开帽盖，将采集容器对准穿刺部位，收集血液，轻柔、间歇性地对周围组织施加压力，增加血流量至500μl刻度线，盖上帽盖，并拧紧。样本混匀：上下颠倒混匀或轻弹混匀，避免剧烈振摇而导致标本溶血。
37.实施例2分离血浆
38.将准备好实验所需的仪器、耗材，台式高速冷冻离心机应提前预冷至4℃；将指尖血从收集管中转移至500μl离心管中。将台式高速冷冻离心机设定参数：温度4℃，离心力1600g，时间10min。将离心管配平之后放置在离心机中，进行离心；离心完成之后，将离心管放置在生物安全柜的离心管架上。将离心管中的上清收集至新的500μl离心管中，在管壁做好标记。注意在收集上清时需要仔细操作，避免吸入白细胞；将离心机设定参数：温度4℃，离心力16000g，时间10min。将装有上清的500μl离心管配平之后放置在离心机中，进行离心；离心完成之后，将离心管放置在生物安全柜的离心管架上。将离心后离心管中的上清收集至新的5ml离心管中。注意在收集上清时需要仔细操作，避免吸入沉淀。这一步的目的是
去除血浆当中的细胞碎片等杂质；将血浆放置于
‑
80℃冰箱保存，备用。
39.实施例3提取循环游离dna(cfdna)
40.准备好实验所需的仪器、试剂、耗材。打开水浴锅，并调节温度至60℃。打开金属浴，并调节温度至56℃。使用qiaamp circulating nucleic acid kit(品牌：qiagen，货号：55114)。按照说明书配置缓冲液和试剂：buffer acb、buffer acw1、buffer acw2、将carrier rna溶解于buffer ave中以及配置acl混合液。
41.向分离得到的血浆中加入适量的pbs，使体积定容至1ml。转移100μl proteinase k至上述离心管中。间断涡旋30s以充分混匀；加入0.8ml的buffer acl(含有1.0μg carrier rna)。剧烈涡旋混匀30秒。确保离心管经剧烈涡旋，以保证样本和buffer acl的充分混匀，从而实现高效的裂解；注意：此步完成后不要中断实验并立即进行下步的裂解孵育步骤，将离心管放置在60℃水浴锅中孵育30分钟。向上述反应液中加入1.8ml的buffer acb。盖上管盖，间断涡旋15s以充分混匀；将含有buffer acb的裂解液至于冰上孵育5min；组装抽滤装置：把vacvalve插在24孔底上，再把vacconnectors插入vacvalve中，再将qiaamp mini硅胶膜柱连接到vacconnectors上，最后把20ml扩容管插入到硅胶膜柱上。确保扩容管插入紧实以防止样本泄露。注意：将2ml收集管留下至后续空转时才使用。并在硅胶膜柱上做好样本编号的标记。vacvalve可调节流速，vacconnectors可以防止污染，qiaamp mini硅胶膜柱用于吸附dna，扩容管用于装大体积血浆；把孵育完的混合物转移至扩容管中，打开真空泵，待离心柱中的裂解液完全抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕。小心地将扩容管拆下并丢弃；向qiaamp mini硅胶膜柱中加入600μl的buffer acw1，关闭排气阀，并打开真空泵，进行抽滤液体。当离心柱中buffer acw1被抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕；向qiaamp mini硅胶膜柱中加入750μl的buffer acw2，关闭排气阀，并打开真空泵，进行抽滤液体。当离心柱中buffer acw2被抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕；向qiaamp mini硅胶膜柱中加入750μl的无水乙醇溶液，关闭排气阀，并打开真空泵，进行抽滤液体。当离心柱中无水乙醇被抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕。关闭真空泵电源；盖上qiaamp mini硅胶膜柱并从真空支管上取下后放置到干净的2ml收集管中，将vacconnector丢弃。收集管在20,000x g下离心3min。将qiaamp mini硅胶膜柱放置到新的2ml收集管中，开盖并置于56℃条件下的金属浴上干燥10min至硅胶膜彻底干燥；将qiaamp mini硅胶膜柱取出后放置到干净的1.5ml洗脱管(试剂盒自带)中，并将使用过的2ml的收集管丢弃；向qiaamp mini硅胶膜柱中硅胶膜的中央小心加入55μl的nuclease
‑
free water。盖上管盖后在室温孵育3min；将洗脱管置于小型离心机中20,000x g离心1min来洗脱cfdna；将洗脱液重新加入qiaamp mini硅胶膜柱中硅胶膜的中央，盖上管盖后在室温孵育3min；将洗脱管置于小型离心机中20,000x g离心1min来洗脱cfdna。
42.实施例4构建cfdna测序文库
43.建库前准备
44.从4℃冰箱取出纯化dna所用的磁珠(ampurexp beads,beckman)，室温平衡30min再使用；从
‑
20℃冰箱内取出end repair&a
‑
tailing buffer和end repair&a
‑
tailing buffer enzyme mix试剂，置于冰盒上解冻，待用；将要建库的cfdna样本名称、dna浓度记录在实验记录本上，并编写好编号，方便之后操作；取相应数量的200μl pcr管；取10μlcfdna
置于相应的pcr管中。
45.末端修复&加a
46.按照表1配置末端修复&加a体系
[0047][0048][0049]
向每个含有cfdna的200μl pcr管内加入10μl上述末端修复反应体系，混匀后低速离心，设定pcr仪，程序如下表2。
[0050][0051]
将反应体系从pcr仪中取出，并进行接头连接反应。
[0052]
接头连接反应体系
[0053]
按照表3所示，配制接头连接反应体系。
[0054]
成分1个反应体系8个反应体系(过量5％)连接缓冲液(ligation buffer)30μl252μldna连接酶(dna ligase)10μl84μl总体积(total volume)40μl336μl
[0055]
向每个反应管中加入40μl上述反应体系，温和混合均匀，低速离心；
[0056]
根据加入的dna量加入适量的接头，具体dna:接头的用量如下表4，每个反管各加入5μl接头。另外根据测序要求，每个样本加入不同的接头，使得同一个芯片(lane)中不会出现两个样本使用同一个接头的情况，记录好每个样本使用的接头信息；
[0057]
建库起始量接头1ng≤x＜2.5ng750nm0.5ng≤x＜1ng150nm
[0058]
混合均匀，并放入pcr仪中，设定温度20℃，反应15min。
[0059]
dna纯化
[0060]
配制80％乙醇(例如配制50ml 80％乙醇：40ml无水乙醇+10ml nuclease
‑
free water)，80％乙醇应现用现配；
[0061]
准备相应数量的1.5ml样本管，并做好相应的标记；
[0062]
将事先在室温平衡好的磁珠充分震荡混匀，并向每个管中分装88μl；
[0063]
将上述加了接头的dna加入磁珠中混匀。室温静置10min；
[0064]
将1.5ml样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；
[0065]
小心移除上清液，再加入200μl 80％乙醇，将样本管水平旋转360度，静置30s后弃上清液(此过程，离心管一直保持在磁力架上)；
[0066]
重复上述步骤一次；
[0067]
应将所有残留的酒精溶液移除。打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇，以免过多乙醇影响后续反应体系中酶的效果。注意：不可过分干燥磁珠，否则会导致dna不容易从磁珠上洗脱下来，造成产量损失。当磁珠表面不再有光泽时即为干燥完成；
[0068]
每个样本管内加入21μl nuclease
‑
free water，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置5min；
[0069]
准备一批新的200μl pcr管，管盖管壁标注对应的样本编号；
[0070]
将样本管置于磁力架，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的pcr管中，作为pcr实验的模板。
[0071]
文库扩增
[0072]
按照表5所示，配制文库扩增反应体系。
[0073][0074]
每个0.2ml样本管内加入30μl pre
‑
pcr扩增反应体系，混合混匀并低速离心，放入pcr仪中反应；
[0075]
将pcr仪设定如下程序，pcr循环数应根据所加入dna量适当调整，见表6。
[0076][0077]
[0078]
循环数选择参考表格7。
[0079]
建库起始量pcr循环数1ng≤x＜2.5ng100.5ng≤x＜1ng12
[0080]
pre
‑
pcr反应结束后，开始进行文库纯化。
[0081]
文库纯化
[0082]
准备相应数量的1.5ml样本管，并做好相应的标记；
[0083]
将事先在室温平衡好的磁珠充分震荡混匀，并向每个管中分装50μl；
[0084]
将上述pcr反应产物加入磁珠中混匀。与磁珠混匀。室温静置10min；
[0085]
将1.5ml样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；
[0086]
小心移除上清液，再加入200μl 80％乙醇，将样本管水平旋转360度，静置30s后弃上清液(此过程，离心管一直保持在磁力架上)；
[0087]
重复上述步骤一次；
[0088]
应将所有残留的酒精溶液移除。打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇，以免过多乙醇影响后续反应体系中酶的效果。注意：不可过分干燥磁珠，否则会导致dna不容易从磁珠上洗脱下来，造成产量损失。当磁珠表面不再有光泽时即为干燥完成；
[0089]
每个样本管内加入35μl nuclease
‑
free water，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置5min；
[0090]
准备一批新的离心管，管盖上标注样本名称和建库日期；管壁上标注接头信息，浓度；
[0091]
将1.5ml样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的写有样本信息的1.5ml离心管；
[0092]
取1ul样本测浓度，1ul样本使用agilent 2100测定文库片段大小，并记录相应信息。
[0093]
样本放入相对应项目的冻存盒内，置于
‑
20℃保存；
[0094]
文库pooling与上机
[0095]
准备好实验所需的仪器、试剂、耗材；按照测定的浓度以及所需要测定的数据量，计算pooling体积；取一个新的1.5ml离心管，做好标记。按照计算的pooling体积进行pooling；混合均匀之后，测定浓度，并记录信息。将上述pooling好的文库用tris
‑
hcl以及naoh进行稀释变性，然后进行上机测序。测序采用illumina的测序设备，选择2x150bp的双端测序试剂盒进行测序。
[0096]
测序结果分析
[0097]
(1)按照上面实施例的方法，获得样本下机数据，过滤掉低质量等reads后，使用比对软件(bwa)将这些测序reads比对到人的参考基因组上(hg19)。
[0098]
(2)过滤比对结果，要求比对质量值>30,去除重复的reads，不正常配对的reads等。将人的参考基于组，每个10000bp，划分为一个区间(bin)，统计每个区间的比对reads；
[0099]
(3)bins的过滤包括：1)mappability>0.5；2)n的比例<0.5；3)不在从ucsc上下载的region文件wgencodedacmapabilityconsensusexcludable.bed和wgencodedukemapabilityregionsexcludable.bed；4)过滤掉x，y染色体；5)过滤掉标准差大的bins；
[0100]
(4)根据每个bin的gc值：统计每个窗口(bin)内a，t,c,g碱基的数量；以及g和c的数量。mappability计算：根据从ucsc下载的encode’s mappability bigwig文件，将文件中的每个region的mappability与bin比较，计算出每个bin里面所有region的mappability的平均值，作为该bin的mappability值。
[0101]
(5)将每个bin的gc和mappability组合，并按照它们的组合进行分组，同时计算每个gc和mappability组合对应所有bins的reads数目中位数。
[0102]
(6)使用广义交叉验证的方法，将bins平均分成10分，用其中9分数据拟合局部加权非参数回归参数曲线，将剩余的1份数据作为测试集，进行预测，计算aic等；确定局部加权非参数回归参数的最优值(aic最小)；构建拟合曲线，最后用每个bins的标准化后的深度除以曲线预测的值，得到校正后的值。
[0103]
(7)正常人群，在同一个bin上的校正后的深度服从正态分布。因此，根据正常人群的测序和分析，得到每一个的bins的正态分布的均值和标准差。在根据受试者在同一个bins下的标准化后的深度，计算z
‑
score。如果受试者的z
‑
score绝对值大于3倍标准差，就认为该样本的这个bins，在该区域存在缺失或扩增，如图5。
[0104]
(8)根据比对结果，挑选正常比对上参加基因组的配对reads，根据配对reads比对起始和终止位置计算出插入片段的长度。统计不同插入片段长度下，对应的reads数目，就可以画出如图6的插入片段长度分布图。
[0105]
实施例5蛋白质肿瘤标志物检测
[0106]
将从指尖血样本离心分离得到的血浆中，分离80μl用于蛋白肿瘤标志物检测。检测的项目包括(cea、afp、ca
‑
724、ca
‑
199、ca
‑
125、ca
‑
153、cyfra)，使用的平台为roche cobas e411电化学发光全自动免疫分析仪，使用的试剂为平台配套的检测试剂。
[0107]
每次实验前先做维护保养，然后进行定标和质控。
[0108]
然后将80μl血浆加入240μl样本稀释液(roche，器械代码11732277122)进行4倍稀释，然后上机进行检测。
[0109]
根据检测结果乘以稀释倍数4，得到稀释前的蛋白定量。
[0110]
实验结果分析
[0111]
1、指尖血样本采集容器选择
[0112]
本发明的发明人调研了解了多款指尖血样本采集容器，主要包括：microtainer(品牌：bd),vaccutee minicollect(品牌：greiner bio one),impromini(品牌：阳普医疗),gd005(品牌：u
‑
real medical),safe lock tubes(品牌：eppendorf international)这五款。图1显示了不同品牌末梢采血管样本的凝血发生率。图2显示了不同品牌末梢采血管的总评分比较。评分内容包括：外观、开关盖方便性、血液采集简便性、内壁光滑性以及密封性。其中，优选bd microtainer一次性使用末梢血样采集容器。其中，bd microtainer一次性使用末梢血样采集容器具有以下3大特点：(1)仿生内壁能够加快进样速度，避免血细胞附壁引起溶血或混匀不及时干扰检测结果，(2)同时安全头盖双凹设计，pet材质管体，防止开启头盖或运输时发生意外伤害。(3)准确均匀预置高浓度k2edta抗凝剂，充分抗凝，保证样品质量。综上所述，选择bd microtainer一次性使用末梢血样采集容器(品牌：bd，货号：365974)以及一次性使用采血器(品牌：bd，货号：366594)进行指尖血采集。经过多次采血测试，发现该采血过程方便简单，不需要任何的专业知识以及特殊技巧，普通大众就能在
家自行操作。并且不易发生溶血以及凝血情况。
[0113]
2、指尖血血浆分离
[0114]
在本发明中，总血量降低至500μl左右，因此可以采用台式高速离心机进行离心，其通量可达24通道，相比处理大体积的高速离心机(通常为6
‑
8通道)，其通量大大提升，节约了血浆分离的时间，同时可以一定程度上防止血浆由于在室温放置时间过长而导致的cfdna降解。
[0115]
3、低血浆量提取、文库构建
[0116]
发明人选取了一个正常人样本以及癌症患者样本，将分离得到的血浆分别分成50μl、100μl、500μl进行cfdna提取，然后构建文库，cfdna浓度见下表。
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发明人意外地发现在t1(肿瘤样本)中，cfdna浓度与血浆量成正相关，而n1(正常人样本)中不存在这种关系，可能是因为在我们的提取过程中加入了carrier rna，一种poly
‑
a，其大小为0.5
‑
4kb，主要作用是在提取过程中促进cfdna与过滤柱膜的结合并减少一些非特异性的结合。这个carrier rna在提取得到的cfdna中会仍然存在，也会被qubit荧光定量。而在正常人中本身cfdna含量非常低，因此最后用qubit检测到的浓度没有与血浆量呈一定的相关性。并且由于carrier rna为单链，在后续文库构建过程中，不能进行接头连接，不会影响文库构建以及测序数据。同时在cfdna提取过程中最后洗脱进行了2次，向过滤柱中加入55μl的nuclease
‑
free water，离心洗脱之后，将洗脱液再次加入过滤柱中进行离心洗脱。2次洗脱的目的是为了提高洗脱效率，减少cfdna残留在过滤柱膜上。从以下结果可以看到，2次洗脱，显著地比1次洗脱浓度要高，整体平均高出25％，具体信息见下表。
[0119][0120]
进一步对这些cfdna进行片段大小分布质检。图3显示了t1样本50μl、100μl、500μl
血浆提取cfdna质控图拟合图。可以看到，不同血浆量提取得到的cfdna其主峰位置一致，并且没有发现降解以及gdna污染情况。然后对上述得到的cfdna进行文库构建，具体参数见下表。
[0121][0122]
图4显示了根据本发明的方法获得的测序文库的质控图。t1 50μl、100μl、500μl血浆提取cfdna文库质控图拟合。可以看到，不同血浆量提取得到的cfdna其文库片段大小分布基本一致。对上述样本的文库采用novaseq 6000进行测序，对测序结果进行分析。
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5、测序结果方面的比较
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首先分析cnv变异情况，并与4000μl血浆提取出的cfdna文库进行对比。图5显示了基于50μl血浆与4000μl血浆进行cnv变异检测的结果对比以及基于100μl血浆与4000μl血浆进行cnv变异检测的结果对比。可以看到在就cnv变异检测结果而言，不管是50μl血浆还是100μl血浆的文库，与4000μl血浆构建的文库具有很好的一致性，其相关系数r2为至少0.952(0.952或者0.954)。
[0125]
接下来，分析了片段大小分布情况，并与4000μl血浆提取出的cfdna文库进行对比。图6显示了50μl血浆、100μl血浆与4000μl血浆中cfdna片段大小分布情况图。可以看到就片段大小分布而言，不管是50μl血浆还是100μl血浆的文库，与4000μl血浆构建的文库片段大小分布基本一致。综上，本发明的发明人通过实验惊奇地发现，即使在50μl这种极低血浆量的情况下，使用本发明的技术，都能够很好的检测到ctdna的cnv变异以及片段大小分布信息。
[0126]
6、文库构建中dna起始量和建库试剂用量
[0127]
由于血浆量降低，提取得到的cfdna量降低，因此在建库时，是否可以降低将库试剂用量也可以达到同样的检测效果，我们做了一系列实验，举例如下，具体参数见下表：
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通过比较针对2ngcfdna起始量，采用1/5建库试剂用量实验文库质控图以及44ngcfdna起始量，采用原始建库试剂用量实验文库质控图比较，发明人惊奇地发现采用上述不同血浆量提取得到的cfdna其文库片段大小分布基本一致。
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接下来，对上述样本的文库采用novaseq6000进行测序，对测序结果进行分析。
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首先分析cnv变异情况，图8显示了建库起始量2ng，建库试剂用量1/5与建库起始
量44ng，建库试剂用量不变构建的文库测序数据分析获得cnv变异的结果对比。可以看到就cnv变异检测而言，建库起始量2ng，建库试剂用量1/5与建库起始量44ng，建库试剂用量不变构建的文库具有很好的一致性，其相关系数r2＝0.944。
[0132]
1其次分析了片段大小分布情况。图8显示了建库起始量2ng，建库试剂用量1/5与建库起始量44ng，建库试剂用量不变构建的文库测序数据片段大小对比。可以看到就片段大小分布而言，分布基本一致。综上，本发明的发明人惊奇地发现，针对微量cfdna构建文库，即使将建库试剂用量降低至1/5，使用本发明的技术，都能够很好的检测到ctdna的cnv变异以及片段大小分布信息。文库构建参数测试
[0133][0134]
[0135]
通过以上测试发现在低起始量情况下，需要调整接头浓度以及pcr循环数，防止接头浓度使用过高导致构建的文库中接头剩余，影响测序数据量。防止pcr循环数设置过多导致文库duplication率过高，影响数据分析。调整如下：
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建库起始量接头pcr循环数1ng≤x＜2.5ng750nm100.5ng≤x＜1ng150nm12
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6、蛋白肿瘤标志物检测
[0138]
评估采用roche cobas e411平台针对低血浆量进行肿瘤蛋白标志物检测的性能。该平台为全自动检测平台，根据所作项目种类和数量不同，对样本体积有一定的要求。该专利中针对每个样本分别检测了(afp、cea、ca199、ca125、ca153、cyfra、ca72
‑
4)这7个项目，最低血浆体积为300μl。而由于指尖血所含有的血浆量非常少，因此我们猜测是否使用样本稀释液进行样本稀释可以达到同样的检测效果。于是选取了8个样本，分别取80μl血浆，加入240μl样本稀释液进行4倍稀释，然后上机进行检测。
[0139]
以下为每个样本的检测结果：
[0140][0141]
同时，我们针对每个检测项目分析了稀释后浓度乘以稀释倍数得到的蛋白浓度与
稀释前比较，结果显示在图9中。可以看到，稀释后浓度乘以稀释倍数得到的蛋白浓度与稀释前比较，在这7个肿瘤蛋白标志物中，相关系数r2都能达到0.98以上，一致性非常好。因此，通过测试发现，使用样本稀释液对血浆进行稀释，即使降低了血浆量，也能很好的检测肿瘤蛋白标志物。
[0142]
结论：
[0143]
本发明通过探索建立了一种利用指尖血进行癌症筛查的方法。该方法利用bd microtainer一次性使用末梢血样采集容器(品牌：bd，货号：365974)以及一次性使用采血器(品牌：bd，货号：366594)进行指尖血采集。cfdna提取过程中加入carrier rna以及2次洗脱操作来提高cfdna提取效率。通过一系列测试，寻找合适的接头浓度以及pcr循环数数，提高文库构建效率，同时通过测试发现在cfdna量比较低的情况下，相应降低建库试剂用量，也能达到同样的检测效果，同时降低了检测成本。使用样本稀释液稀释样本，使得在体积极小的情况下也能使用roche cobas e411仪器进行蛋白肿瘤标志物检测。
[0144]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0145]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。