水稻源抗虫相关基因OsIDP1及其编码产物与应用的制作方法

水稻源抗虫相关基因osidp1及其编码产物与应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种水稻源抗虫相关基因osidp1及其编码产物与应用。


背景技术：

[0002]
水稻(oryza sativa l.)是世界上最重要的粮食作物之一，满足了全球超过30亿人口20％-80％的日常饮食需求。稻飞虱，包括褐飞虱(nilaparvata lugens)、白背飞虱(sogatella furcifera)、灰飞虱(laodelphax striatellus)，是亚太地区最具破坏性的水稻害虫之一。由于其单食性和远距离迁飞能力，爆发严重时会导致水稻大面积死亡、甚至颗粒无收，即“虱烧”现象，造成每年数百万美元的产量损失。面对日益严峻的人口增长、用药成本增加、有毒有害物质残留等环境污染以及害虫再猖獗等问题，使得研究培育具有安全、稳产、增产、抗虫等性状的水稻新品种迫在眉睫。
[0003]
在稻飞虱综合防治体系中，培育和种植水稻抗虫品种是最经济有效的方法之一。到目前为止，研究人员已从水稻栽培种和野生种中鉴定出30多个抗褐飞虱基因或数量性状位点(qtls)，且基于图位克隆技术分离到了8个抗褐飞虱基因(bph14、bph26、bph3、bph29、bph32、bph18、bph9和bph6)；此外，水稻中还分别存在至少14个抗白背飞虱以及34个抗灰飞虱基因/qtls。然而，由于稻飞虱生物型的进化，由单一抗性基因控制的改良品种很可能并不具备对新生物型稻飞虱产生抗性的能力。因此，发现新的广谱性抗稻飞虱基因并将其整合到水稻品种中，对实现稻飞虱无公害和可持续控制具有十分重要的意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水稻源抗虫相关基因osidp1及其编码产物与应用。
[0005]
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种水稻源抗虫相关基因osidp1，它具有seq id no.1的dna序列。
[0006]
一种上述水稻源抗虫相关基因osidp1编码的蛋白，它是包含seq id no.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将seq id no.2的氨基酸残基经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与seq id no.2的氨基酸残基序列相同活性的由seq id no.2衍生的蛋白质。
[0007]
一种上述水稻源抗虫相关基因osidp1的dna片段，该dna片段为基因osidp1全长dna序列seq id no.1中的第273到第642的碱基序列。
[0008]
一种上述水稻源抗虫相关基因osidp1的dna片段在转基因水稻中的应用。
[0009]
一种上述水稻源抗虫相关基因osidp1的dna片段在抗虫水稻育种中的应用。
[0010]
本发明的有益效果是：利用抑制消减杂交(ssh)和反转录pcr(rt-pcr)技术分离并克隆了osidp1基因；利用荧光定量pcr(qrt-pcr)方法分析了osidp1基因在褐飞虱产卵雌成虫为害前后的表达情况；利用农杆菌介导的植物转化技术获得了osidp1基因的rnai沉默转
基因植株，并发现了基因osidp1的dna片段在水稻对褐飞虱的抗性中发挥着十分重要的作用。该基因的分离克隆及其dna片段的应用，对作物的抗虫育种，尤其是抗稻飞虱的水稻品种的培育，具有十分重要的指导和促进作用。
附图说明
[0011]
图1是osidp1全长基因pcr扩增产物凝胶电泳图；图中m为dna标准分子量；1泳道为osidp1基因pcr电泳结果；
[0012]
图2是褐飞虱产卵雌成虫为害前后osidp1基因的表达情况(均值+标准误，n＝5)。对照：套入玻璃罩但未被褐飞虱产卵雌成虫为害的常规水稻植株叶鞘；褐飞虱为害：在玻璃罩内接入褐飞虱产卵雌成虫为害的常规水稻植株叶鞘。星号表示处理组与对照组存在显著差异(*：p<0.05；**：p<0.01；student
’
s t-test)；
[0013]
图3是osidp1基因的rnai沉默载体构建示意图；
[0014]
图4是osidp1在转基因沉默植株中的沉默效果图(均值+标准误，n＝5)。褐飞虱产卵雌成虫为害不同时间，常规植株(wt)、沉默品系(r7和r8)中osidp1基因的表达量。a、b、c等不同字母表示对照组与处理组存在显著差异(p<0.05，duncan
’
s multiple-range test)；
[0015]
图5是沉默osidp1后降低了褐飞虱产卵雌成虫取食和产卵的偏好性(均值+标准误，n＝8)。(a-b)表示褐飞虱产卵雌成虫在常规植株(wt)、沉默植株(r7或r8)上的取食头数和产卵率。星号表示处理组与对照组存在显著差异(*：p<0.05；**：p<0.01；student
’
s t-test)；
[0016]
图6是沉默osidp1后降低了褐飞虱若虫的存活率(均值+标准误，n＝8)。常规植株(wt)、沉默品系(r7和r8)上褐飞虱若虫的存活率。a、b等不同字母表示对照组与处理组存在显著差异(p<0.05，duncan
’
s multiple-range test)；
[0017]
图7是沉默osidp1后降低了褐飞虱卵的孵化率(均值+标准误，n＝10)。常规植株(wt)、沉默品系(r7和r8)上褐飞虱卵的孵化率。a、b等不同字母表示对照组与处理组存在显著差异(p<0.05，duncan
’
s multiple-range test)；
[0018]
图8是沉默osidp1后增强了水稻对褐飞虱产卵雌成虫的耐受性(n＝10)。15头褐飞虱产卵雌成虫为害11天后，常规植株(wt)与沉默品系(r7和r8)的耐害表型；
[0019]
图9是沉默osidp1后降低了田间褐飞虱和白背飞虱的种群密度(均值+标准误，n＝3)。a-b表示每丛常规水稻植株(wt)、沉默品系(r7和r8)上褐飞虱成虫和若虫数量；c-d表示每丛常规水稻植株(wt)、沉默品系(r7和r8)上白背飞虱的成虫和若虫数量。a、b等不同字母表示对照组与处理组存在显著差异(p<0.05，duncan
’
s multiple-range test)。
具体实施方式
[0020]
本发明利用ssh、rt-pcr和race技术，获得osidp1的全长序列。首先从ssh克隆库中分析获得osidp1基因片段，以此片段设计正向和反向引物，分别进行3
’-
race和5
’-
race获得该基因的5
’
端和3
’
端基因pcr片段，并测序拼接获得dna序列。在拼接dna序列的5
’
端和3
’
端非编码区设计引物osidp1-f1和osidp1-r1。提取褐飞虱为害24h的水稻叶鞘的总rna并反转录成cdna。以cdna为模板、osidp1-f1和osidp1-r1为引物进行pcr反应，即得到osidp1全
长序列并测序验证。随后，以osidp1-f2和osidp1-r2为引物，osidp1基因全长序列为模板进行pcr反应，扩增出权利要求1中所述的370bp长度的片段并设计构建rnai沉默载体。其次，利用qrt-pcr研究osidp1的表达情况，结果表明褐飞虱产卵雌成虫危害诱导了osidp1的转录。再次，利用农杆菌转化法得到osidp1的转基因沉默植株，通过生物学测定证明osidp1基因沉默后能够显著增加水稻对褐飞虱的抗性。该基因片段的分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻抗褐飞虱育种将起到重要的促进作用。
[0021]
实现本发明的具体技术步骤如下：
[0022]
1、水稻osidp1基因的分离和序列分析
[0023]
首先从ssh克隆库中分析获得osidp1基因片段，以此片段设计正向引物和反向引物，分别进行3
’-
race和5
’-
race获得该基因的5
’
端和3
’
端基因pcr片段，并测序拼接获得dna序列。根据拼接的dna序列，我们在其5
’
端和3
’
端非编码区设计引物osidp1-f1和osidp1-r1，以褐飞虱为害24h的水稻叶鞘总rna反转录的cdna为模板，使用kod fx高保真酶(toyobo)进行pcr反应，获得osidp1基因全长序列。osidp1序列见seq id no.1。根据该序列的开放阅读框(orf)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，见seq id no.2。
[0024]
2、褐飞虱为害前后的osidp1表达特征分析
[0025]
水稻经褐飞虱产卵雌成虫为害0、0.5、1、3、8、12、24、48h后，取为害部位叶鞘。利用minibest plant rna extraction kit(takara)试剂盒提取总rna，并利用超微量蛋白核酸分光光度计(biodrop)和甲醛凝胶变性电泳检测与评估所得rna的浓度、纯度与质量。用primescript
tm rt master mix(takara)试剂盒将500ng总rna反转录成cdna，具体操作参照产品说明书。
[0026]
荧光定量pcr(qrt-pcr)检测使用premix ex taq[probe qpcr](takara)酶预混液配制反应体系，使用cfx96
tm real-time system(bio-rad)定量pcr仪检测荧光信号。以水稻osactin基因(tigr id：loc_os03g50885)作为内参，对osidp1的诱导表达特征进行分析(图2)。
[0027]
3、osidp1基因沉默水稻品系的获得及其对褐飞虱种群适合度的影响
[0028]
将构建好的rnai沉默载体质粒(图3)电击转入农杆菌，鉴定无误后保存为工程农杆菌。以农杆菌转化法获得osidp1基因沉默水稻植株，用gus染色、southern杂交技术以及qrt-pcr等方法筛选出r7和r8两个单拷贝纯合品系(图4)供后续试验使用。实验室环境下，种群适合度试验表明：与常规水稻植株相比，沉默osidp1显著降低了褐飞虱产卵雌成虫的取食和产卵偏好(图5)、褐飞虱若虫的存活率(图6)、褐飞虱卵的孵化率(图7)，提高了植株对褐飞虱的耐受性(图8)。田间试验表明：沉默osidp1显著降低了田间褐飞虱和白背飞虱的种群数量(图9)。
[0029]
图4中，a\b\c用于邓肯氏多重比较标记差异显著性；将每个时间点需要比较的三组数据(分别是wt，r7和r8)的均值从大到小排列。例如8小时，wt品系对应的表达量最高，标记为a；r8品系对应的表达量第二高且与wt相比存在显著差异，因此标记为b；r7品系对应的表达量最低且与wt和r8相比都存在显著差异，因此标记为c。又如3小时，wt品系对应的表达量最高，标记为a；r8品系对应的表达量第二高且与wt相比存在显著差异，因此标记为b；r7品系对应的表达量最低且与wt相比存在显著差异，然而r7与r8之间不存在显著差异，因此不需要新的字母表示r7和r8之间存在显著差异，最终在r7上方标b即可。
[0030]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
[0031]
实施例1、osidp1基因的获得和序列分析
[0032]
1)水稻叶鞘总rna的提取、质量检测及cdna第一链合成
[0033]
2)以总cdna第一链为模板，进行pcr反应，获得osidp1全长基因序列
[0034]
osidp1-f1：5
’-
cctcccccaaaacctgacc-3
’
；
[0035]
osidp1-r1：5
’-
agatggcatatgcgaccacc-3
’
；
[0036]
pcr扩增条件：95℃
×
4min
→
(98℃
×
15sec
→
60℃
×
40sec
→
68℃
×
1min)
×
35循环
→
68℃
×
5min，得到特异pcr扩增产物见图1。
[0037]
3)osidp1基因序列分析
[0038]
将获得的pcr产物送南京金斯瑞公司进行测序，测序结果为序列表中的序列seq id no.1。我们将此基因命名为osidp1。
[0039]
实施例2、褐飞虱产卵雌成虫为害前后的osidp1表达特征分析
[0040]
1)褐飞虱处理
[0041]
在水稻的叶鞘基部固定一个圆筒形玻璃罩(直径4cm，高8cm，筒壁均匀分布24个直径为0.8mm的透气小孔)，在玻璃罩内接入15头褐飞虱产卵雌成虫后，顶部以海绵密封。接入褐飞虱后在不同时间点剪取为害部位的外层叶鞘，立即浸入液氮，-80℃保存备用。以套入空玻璃罩的健康水稻叶鞘作为对照。
[0042]
2)rna的提取及表达特征分析
[0043]
利用minibest plant rna extraction kit(takara)试剂盒提取总rna，并利用超微量蛋白核酸分光光度计(biodrop)和甲醛凝胶变性电泳检测与评估所得rna的浓度、纯度与质量。用primescript
tm rt master mix(takara)反转录试剂盒将500ng总rna反转录成cdna，具体操作参照产品说明书。
[0044]
荧光定量pcr(qrt-pcr)检测使用premix ex taq[probe qpcr](takara)酶预混液配制反应体系，使用cfx96
tm real-time system(bio-rad)定量pcr仪检测荧光信号。以水稻osactin基因(tigr id：loc_os03g50885)作为内参，对osidp1的诱导表达特征进行分析(图2)。具体反应体系及程序见产品说明书，定量pcr引物及探针如下：
[0045]
osactin-p：5
’-
cgtttccgctgccctgaggtcc-3
’
[0046]
osactin-f：5
’-
ggacaggttatcaccattggt-3
’
[0047]
osactin-r：5
’-
ccgcagcttccattcctatg-3
’
[0048]
osidp1-p：5
’-
cctcctcctcctcgggttcggactcgg-3
’
[0049]
osidp1-f：5
’-
gcggttcctcatcgtcctct-3
’
[0050]
osidp1-r：5
’-
cttcctccgcaggttccct-3
’
[0051]
实施例3、osidp1转基因品系的获得
[0052]
1)设计引物将权利要求3中所述的370bp的特异性区域扩出后，利用dna亚克隆方法将其正向反向连入实验室保存的pcambia1301-rnai载体，获得pcambia1301-iridp1 rnai沉默表达载体。并通过电击法，将rnai载体转入农杆菌eha105中，用于后续植物转化。rnai区引物如下：
[0053]
osidp1-f2：5
’-
gtggtcgaacaagagagttc-3
’
[0054]
osidp1-r2：5
’-
cactattaagcatcaactta-3
’
[0055]
2)用含有pcambia1301-iridp1 rnai载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织。将共侵染后的愈伤放在含有潮霉素的nbds培养基上筛选培养20天左右，待新的抗性愈伤长出后，将抗性愈伤从母体上剥离，转入新的筛选培养基nbds2继代扩繁。将扩繁后的抗性愈伤转入分化培养基ms-rg培养2-3周。待其长出嫩芽后，切除多余愈伤组织并将嫩芽转入ms-rt培养基生根，分化出完整的t0代植株。
[0056]
3)将组织培养得到的t0代水稻转入田间生长，自交收获的t1代水稻种子清水催芽10天后，单独剪取每株幼苗幼嫩的根尖部位进行gus染色，根尖显蓝的植株即为阳性植株，选取gus显色分离比(显蓝：不显色)接近3：1的品系，再进一步田间繁种，获得t2代种子。将t2代种子清水催芽后，随机挑选80株幼苗剪取根尖进行gus染色，全部显蓝的品系即为osidp1沉默的纯合品系。经southern杂交和qrt-pcr方法确定为单拷贝沉默品系后，可继续种植扩繁并用于后续生物学功能分析。
[0057]
实施例4、osidp1转基因沉默品系的抗虫功能研究
[0058]
1)雌成虫取食及产卵偏好性测定：在小塑料杯中分别固定1株常规水稻和1株突变体水稻(苗间距0.5cm)，2株水稻叶鞘基部固定一个圆筒形玻璃罩，在玻璃罩内接入15头褐飞虱产卵雌成虫后，顶部以海绵密封。分别于接虫后1、2、4、8、12、24、48h观察并记录两株苗上的着虫数。48h后，去除所有褐飞虱，镜检每株苗上的产卵量并计算产卵分布比例。每个水稻品系处理设置8个生物学重复。
[0059]
2)初孵若虫存活率测定：在单株水稻叶鞘基部套入一个圆筒形玻璃罩，并在水稻叶鞘基部接入15头褐飞虱初孵若虫后用海绵密封顶部，每天观察并记录存活虫数。每个水稻品系处理设置8个生物学重复。
[0060]
3)卵的孵化率测定：在单株水稻叶鞘基部固定一个圆筒形玻璃罩，向玻璃罩内接入15头bph产卵雌成虫，然后用海绵将玻璃罩顶口密封。产卵12h后去除所有产卵雌成虫，每天观察并记录植株上孵化出的若虫数，直至无若虫孵出后，剪取水稻为害部位，镜检每棵植株上未孵化的卵量，计算并统计卵的孵化率。每个水稻品系处理设置10个生物学重复。
[0061]
4)水稻耐害性测定：选取生长状况一致的水稻，每株接入15头褐飞虱产卵雌成虫，每个品系重复10次。每天观察水稻的生长情况并进行拍照。
[0062]
上述实验均在温室(26
±
2℃；光照14h；湿度70％-75％)中进行。
[0063]
5)田间试验：田间试验在浙江省湖州市长兴县泗安镇浙江大学长兴农业科技园(浙江大学转基因植物试验基地)中进行。试验田总面积约340m2(20m
×
17m)，划分为9个小区，每个小区约27m2(6m
×
4.5m)，且各小区间设有宽0.5m对照植株(wt)的保护行。试验田设计采用随机区组排列，将转基因品系(r7和r8)和对照植株(wt)随机种植在9个小区中，每个品系设置3个重复。采用z字形取样法，在每个小区内随机选择15个样点进行调查，记录每个样点(每丛水稻上)褐飞虱和白背飞虱的着虫数量。以15个样点的平均数作为该小区调查各项目的最终值，并统计分析。
[0064]
结果表明：与常规水稻植株相比，沉默osidp1显著降低了褐飞虱产卵雌成虫的取食和产卵偏好(图5)、褐飞虱若虫的存活率(图6)、褐飞虱卵的孵化率(图7)，提高了植株对褐飞虱的耐受性(图8)。田间试验表明：沉默osidp1显著降低了田间褐飞虱和白背飞虱的种群数量(图9)。
[0065]
实施例5、osidp1基因在水稻抗虫育种中的应用
[0066]
1)以实施例3获得的转osidp1基因片段的纯合品系水稻为材料，分析osidp1基因片段在水稻抗虫育种中的应用。
[0067]
2)褐飞虱产卵雌成虫分别危害转基因苗与对照苗，如图8所示，11天后对照水稻基本枯死，而osidp1沉默的转基因水稻仅外面的叶片枯黄。且如图9所示，田间应用osidp1沉默的水稻植株显著降低了褐飞虱和白背飞虱的种群密度。可见osidp1基因片段可以很好的应用于抗稻飞虱的水稻抗虫育种。