1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种干细胞提取物的制备方法及其应用。
背景技术：
2.干细胞具有自我更新和分化的特性，是组织工程的万能种子细胞，可分泌多种生长因子（hgf、vegf、igf、pdgf）促进组织再生和修复。同时由于干细胞的低免疫原性，在进行同种异体移植时生物相容性极好，在治疗脱发和糖尿病创面方面都有大量的临床应用。
3.脱发患者包括雄激素脱发、油脂性脱发和病理性脱发。雄激素脱发（aga）是最常见的脱发类型，在50岁以上人群中，50%男性和45%女性都会发生不同程度的aga。虽然脱发并不危及人的生命安全，但是会影响人的外貌和自尊，造成极大的心理负担。目前经国内外药监局批准治疗aga的药物主要是甾体类5α-还原酶抑制剂，代表药物为非那雄胺、度他雄胺和依立雄胺，此类药物可以有效地控制男性型秃发患者头发的继续脱落，但是会引起不良反应包括性欲减退、勃起功能障碍、射精量减少、射精障碍、皮疹、乳房增大或压痛等。2019年英国进行的一项干细胞治疗脱发项目中，将毛囊干细胞与盐水混合并注入头皮，结果显示休眠毛囊细胞被触发进入新生长阶段，显著增加头发密度。
4.中国的糖尿病患者有1.4亿人，糖尿病患者容易发生皮肤溃疡，15-25%的患者会发展成糖尿病足。糖尿病创面属于慢性创面，可能存在多种病原微生物、炎症介质等构成不利于干细胞修复的微环境，同时糖尿病患者以中老年为主，体内的干细胞数量和活性都出现下降，以致组织修复能力下降。目前国内外有大量临床数据，证实通过在溃疡四周采取点阵注射或者静脉回输的方式，都可以促进病变和坏死的皮肤、血管、神经等组织进行再生修复，促进伤口愈合。
5.但是在以往的临床研究中，都是通过微针或注射的方式将活的干细胞移植到体内，易造成局部感染，且干细胞存活率低，要达到良好的疗效需要重复注射多次，给患者带来不便和痛苦。
6.因此，本领域亟待开发新型的干细胞提取物和应用方法，以推进干细胞技术的临床应用。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供一种干细胞提取物制备方法及其应用，能够有效治疗脱发和糖尿病创面。
8.本发明的技术方案是这样实现的：1.分离间充质干细胞。使用组织块培养、酶消化培养，从人来源的脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓、外周血、脐带血、尿液、宫内膜、经血中分离得到间充质干细胞，加入10%胎牛血清的dmem培养基进行培养，细胞接种密度为1-5
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105cells/cm2，三天后清洗掉未贴壁细胞，当间充质干细胞融合度达到80-90%，加入0.05%的胰酶消化，按1:3比例进行传代培养。
9.2.鉴定间充质干细胞。通过流式鉴定其表面干细胞标记物cd44，cd29，cd105呈阳
性，内皮细胞标记物cd31，cd45呈阴性。
10.2.在收集干细胞前2天更换培养基为无血清培养，收集p2-p5代干细胞10e7-10e8，使用1-10 mlpbs重悬细胞，对收获的干细胞进行流式检测。
11.3获得干细胞提取物。使用组织匀浆或者超声破碎技术将干细胞进行细胞破碎，显微镜下观察破碎情况。
12.4.浓缩和过滤干细胞提取物。将破碎后的干细胞经超速离心机进行离心，转速在800-150000g，使用生理盐水重悬沉淀物，并进行除菌过滤。
13.5.制备干细胞提取物终产品。将无菌处理后的干细胞提取物，按体积比例（v/v）0.5-10%加入无菌的水、生理盐水、pbs、葡萄糖溶液等溶液中的1种或多种制备成液体制剂，或者加入水凝胶（胶原、海藻酸盐、壳聚糖、玻尿酸）制成凝胶敷料。
14.6.干细胞提取物终产品的临床应用。将干细胞提取物终产品涂抹或喷洒在脱发或糖尿病创面部位，每日1-4次，持续使用4-48周。
15.本发明的优点在于：1）干细胞提取物制备工艺简便易行，易于放大和规模化生产。
16.2）相较于活的干细胞，干细胞提取物更易无菌处理，储存、运输更加方便。
17.3）避免有创操作，使用便捷，适合个人家庭使用。
18.附图说明
19.下面对间充质干细胞提取物的制备和应用进行说明。
20.图1是本发明所述的间充质干细胞流式细胞检测结果。表面干细胞标记物cd45，cd69，cd105呈阳性，内皮细胞标记物cd31，cd45呈阴性。
21.图2 是使用干细胞提取物喷雾治疗前后脱发患者的头发增量照片。
22.图3是使用干细胞提取物凝胶治疗前后糖尿病足患者的创口部位照片。
具体实施方式
23.本发明结合附图和实施例进行进一步的说明。
24.实施例1 一种干细胞提取物制备方法，包括以下步骤：1.实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
25.2.脐带间充质干细胞的分离和鉴定1）在健康产妇知情情况下获得脐带30 cm，在手术室采集后即使用无菌pbs浸泡并运送到实验室，75%酒精浸泡1分钟并冲洗后放在10 cm平皿中，无菌pbs冲洗3次。
26.2）将脐带剪成5 cm小段，用镊子撕开脐带并小心去除血管（包括2根动脉、1根静脉），小心将脐带撕成细丝。
27.3）将细丝转移到50 ml离心管中，加入10mlpbs混匀后，将手术剪插入离心管进行快速剪碎。
28.4）将剪碎的组织块接种在10cm直径的培养皿中，放置在培养箱进行培养。等待组织块附着部分有细胞爬出贴壁生长时，洗去组织块，更换培养基，继续培养72小时。
29.5）取出培养皿观察，继续培养到细胞融合度80%，加入胰酶消化并传代。
30.6）使用流式细胞仪检测间充质干细胞的表面干细胞标记物cd44，cd29，cd105的表达。
31.3.间充质干细胞的制备在收集干细胞前2天更换培养基为无血清培养，收集p2-p5代干细胞10e7-10e8，使用1-10 mlpbs重悬细胞。
32.4. 获得干细胞提取物使用超声破碎技术将干细胞进行细胞破碎，显微镜下观察破碎情况。
33.5.浓缩和过滤干细胞提取物将破碎后的干细胞经超速离心机进行离心，转速50000g，使用生理盐水重悬沉淀物，并经0.22微米滤膜进行除菌过滤。
34.6.干细胞提取物终产品将无菌处理后的干细胞提取物，按提取物浓度1%（v/v）比例加入无菌的生理盐水，并装入真空喷雾瓶中。
35.实施例2 一种干细胞提取物制备方法，包括以下步骤：1.实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
36.2. 胎盘间充质干细胞的分离和鉴定1）在健康产妇知情情况下获得胎盘，在手术室采集后即使用无菌pbs浸泡并运送到实验室，75%酒精浸泡1分钟并冲洗后，无菌pbs冲洗3次。
37.2）小心剥离胎盘蜕膜，用剪刀和镊子撕成细条状。
38.3）将细条状组织转移到50 ml离心管中，加入10mlpbs混匀后，将手术剪插入离心管进行快速剪碎。
39.4）向离心管加入10 ml 0.1%的i型胶原酶，将离心管放置在摇速90 rpm，温度37℃的恒温摇床上进行消化2小时。
40.5）取出离心管，此时组织块已消化，液体呈现粘稠状态，使用巴氏吸管进行吹打，并使用80目钢筛过滤，收集滤过液中细胞。
41.6）将滤过液进行离心，转速1200 rpm，离心5分钟，使用pbs离心洗涤2次。
42.7）将离心后的细胞平均接种到4个25 cm2培养瓶中，在co2培养箱37℃培养，24小时后观察无细胞污染现象，继续培养48小时。
43.8）取出培养瓶观察，有少量细胞贴壁，继续培养到细胞融合度80%，加入胰酶消化并传代。
44.3.间充质干细胞的制备在收集干细胞前2天更换培养基为无血清培养，收集p2-p5代干细胞10e7-10e8，使用1-10 mlpbs重悬细胞。
45.4. 获得干细胞提取物使用超声破碎技术将干细胞进行细胞破碎，显微镜下观察破碎情况。
46.5.浓缩和过滤干细胞提取物将破碎后的干细胞经超速离心机进行离心，转速10000g，使用生理盐水重悬沉淀物，并经0.22微米滤膜进行除菌过滤。
47.6.干细胞提取物终产品
将无菌处理后的干细胞提取物，按提取物浓度5%（v/v）比例加入无菌的海藻酸钠溶液（质量浓度1.5%），并装入真空瓶中。
48.实施例3 干细胞提取物治疗脱发1.患者分组。将脱发患者20人分为2组，实验组10人，安慰剂组10人，分别使用实施例1制备的干细胞提取物喷雾和安慰剂生理盐水。
49.2.使用方法，将安慰剂或干细胞提取物喷洒在脱发部位，每日2次，持续使用16周。3.效果评估，每8周对患者进行效果评估，包括头发密度、副作用。头发密度的评估按照7等级进行：-3，明显降低；-2，中等降低；-1，轻微降低；0，无变化；1，轻微增加；2，中等增加；3，明显增加。副作用包括瘙痒、红肿。
50.4.使用结果分析，在使用8周的过程中，试验组有1人出现使用部位瘙痒现象，安慰剂组无过敏现象。使用毛囊检测仪对使用前后的头发状态进行检测和拍照，对比发现，使用干细胞提取物的10名患者有4人的头发密度显著增加（具体情况见图2），3人中等增加，2人轻微增加，1人中等降低，而使用安慰剂的10名患者有3人无变化，5人轻微降低，2人明显降低。
51.实施例4 干细胞提取物治疗糖尿病足患者李先生，年龄54岁，糖尿病史9年，1年前左足内侧出现溃疡面，面积约8cm
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4cm，对创面进行清创后，早晚使用实施例2制备的干细胞提取物凝胶各1次，连续使用7周。
52.治疗效果观察，从第2周开始溃疡创口面快速愈合；第5周创口基本愈合，可见粉色部分新生皮肤；第7周治疗结束时创口完全愈合。
53.本发明仅以实施例1-4为例进行描述，并不意味着对本发明构成限制，参照本发明的描述，其他来源的间充质干细胞以及实施例的其他变形，对于本领域的技术人员是可预料的，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。