一种小鼠DNA的鉴定方法与流程

一种小鼠dna的鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，尤其是一种小鼠dna的鉴定方法。


背景技术：

2.在生物学研究中，转基因技术可用于基因过表达、基因表达沉默、在特定的细胞群中表达基因、表达外源性或突变的基因等研究。转基因动物是指通过基因工程的方法人为地将外源基因导人动物的受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组进行整合，随细胞的分裂而增殖，并且能稳定地遗传给后代的一类动物。转基因小鼠的建立比其它大型转基因哺乳动物的建立要省时、省力，是研究人类疾病的重要工具，在生命科学领域得到越来越广泛的应用。
3.在采用转基因小鼠开展科学研究之前，需要将小鼠进行扩繁，且对其基因型进行鉴定，选取特定基因型的小鼠进行后续的研究。小鼠的基因型鉴定，包括小鼠基因组dna的提取，dna目的片段的扩增和dna电泳。目前常用的提取dna方法包括高盐提取法和酚/氯仿提取法，这些方法的不足之处是操作步骤比较繁琐，时间偏长，如离心次数多、蛋白酶k消化过夜等；涉及的试剂较多，如蛋白酶k、氯仿、乙醇等。在一些商品化的试剂盒(promega、vazyme、beyotime公司等)中，dna提取部分耗时30min到数小时之间，其含有的耗材及多种试剂增加了实验成本和时间成本，在一定程度上限制了小鼠基因型鉴定的效率,为此，本发明提出了一种小鼠基因型的鉴定方法。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中的问题，本发明提出的一种小鼠dna的鉴定方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种鉴定小鼠dna的检测引物，包括primer1f/r、primer2f/r引物中的至少一组：
7.primer1f：cagcagggtgatttaaagggttc；
8.primer1r：ggacgtcgcagagtaaagcca；
9.primer2f：ggctgtgcttcagtgttagagac；
10.primer2r：ctacagagtcattccacggagc。
11.一种小鼠dna的鉴定方法，包括如下步骤：
12.s1：取小鼠趾甲放入容器中；
13.s2：向容器中加入25～50mm naoh溶液，96℃恒温加热10min；
14.s3：先降温至40℃，再自然冷却至25℃；
15.s4：加入ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液，涡旋5s；
16.s5：离心3min，取上清；
17.s6：用primer1f/r、primer2f/r引物进行pcr反应。
18.一种小鼠趾甲dna的提取试剂盒，包括primer1f/r、primer2f/r、25～50mm naoh溶液以及ph为8.0的1m tris、2～5mm edta溶液。
19.一种小鼠趾甲dna的提取试剂盒的配制方法，包括将0.1～0.2g naoh溶解于100ml ddh2o中，配成25～50mm naoh溶液；
20.取12.114g tris，0.05845～0.14612g edta溶解于ddh2o中，用盐酸调ph至8.0，定容至100ml，配成ph为8.0的1m tris、2～5mm edta溶液。
21.进一步地，所述pcr反应的成分体积为：
[0022][0023]
进一步地，所述pcr反应的条件包括：
[0024]
预变性：94℃，5min、1cycle；
[0025]
pcr反应：94℃变性，30s、56℃退火，30s、72℃延伸，45s、35cycle；
[0026]
彻底延伸：72℃，10min。
[0027]
进一步地，所述鉴定方法还包括电泳检测：对pcr反应的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，恒压130v，30min。
[0028]
进一步地，所述25～50mm naoh溶液的体积为100μl，所述ph为8.0的1m tris、2～5mm edta溶液的体积为20μl。
[0029]
本发明的有益效果：
[0030]
本发明采用25～50mm的naoh溶液处理小鼠趾甲，加热煮沸后用酸中和，使得细胞内的核酸释放到水溶液中来，裂解产物可以直接用于pcr检测，并设计出相应的引物，无需使用异丙醇或乙醇进行纯化，本发明的dna提取过程耗时15min左右，能快速获取dna，缩减了提取dna的流程，节约了试剂成本，显著地提高了效率。
附图说明
[0031]
图1为本发明实施方式公开的方法对ndufa7转基因敲除小鼠以及同窝出生的野生型小鼠进行基因鉴定的结果；
[0032]
图2为高盐法提取dna，进行小鼠基因型鉴定的结果；
[0033]
其中“+/+”表示野生型小鼠，“+/
‑”
表示杂合型基因敲除小鼠，
“‑
/
‑”
表示纯合型基因敲除小鼠。primer1靶向扩增野生型小鼠，primer2靶向扩增转基因小鼠。
具体实施方式
[0034]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0035]
以下小鼠趾甲dna的提取的实施例为实施例2
‑
5，实施例2采用50mm naoh溶液，ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液的试剂浓度为例；实施例3采用50mm naoh溶液，ph为8.0的1m tris、2mm edta溶液的试剂；实施例4采用25mm naoh溶液，ph为8.0的1m tris、2mm edta溶液的试剂；实施例5均采用25mm naoh溶液，ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液的试剂浓度来阐述本发明的方法。
[0036]
实施例1：试剂的配制，此处以50mm naoh溶液，ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液的试剂浓度为例，其它浓度均可按照本实施例的方法进行相应的配制。
[0037]
50mm naoh溶液：将0.2g naoh溶解于100ml ddh2o(双蒸水)中；
[0038]
ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液：称取12.114g tris，0.14612g edta溶解于ddh2o中，用盐酸调ph至8.0，定容至100ml。
[0039]
实施例2：小鼠基因组dna的提取
[0040]
剪取小鼠趾跟处2mm的趾甲放入洁净的离心管中，在离心管中加入100μl 50mm naoh溶液，将离心管置于金属浴中，96℃恒温加热10min；
[0041]
在金属浴中冷却降温至40℃左右，再自然冷却至室温(25℃)，对其进行裂解，再向离心管中加入ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液，涡旋5s，一方面中和强碱，另一方面ph为8.0的tris为dna提供保护环境，edta能螯合mg
2+
，抑制dnase(脱氧核糖核酸酶)的活性，使得在该环境下dna呈稳定状态；
[0042]
室温(25℃)下，将离心管放置于离心机中，12000rpm，离心3min，取上清，耗时约15min。
[0043]
实施例3：小鼠基因组dna的提取
[0044]
剪取小鼠趾跟处2mm的趾甲放入洁净的离心管中，在离心管中加入100μl 50mm naoh溶液，将离心管置于金属浴中，96℃恒温加热10min；
[0045]
在金属浴中冷却降温至40℃左右，再自然冷却至室温(25℃)，对其进行裂解，再向离心管中加入ph为8.0的1m tris、2mm edta溶液，涡旋5s，一方面中和强碱，另一方面ph为8.0的tris为dna提供保护环境，edta能螯合mg
2+
，抑制dnase(脱氧核糖核酸酶)的活性，使得在该环境下dna呈稳定状态；
[0046]
室温(25℃)下，将离心管放置于离心机中，12000rpm，离心3min，取上清，耗时约15min。
[0047]
实施例4：小鼠基因组dna的提取
[0048]
剪取小鼠趾跟处2mm的趾甲放入洁净的离心管中，在离心管中加入100μl 25mm naoh溶液，将离心管置于金属浴中，96℃恒温加热10min；
[0049]
在金属浴中冷却降温至40℃左右，再自然冷却至室温(25℃)，对其进行裂解，再向离心管中加入ph为8.0的1m tris、2mm edta溶液，涡旋5s，一方面中和强碱，另一方面ph为8.0的tris为dna提供保护环境，edta能螯合mg
2+
，抑制dnase(脱氧核糖核酸酶)的活性，使得在该环境下dna呈稳定状态；
[0050]
室温(25℃)下，将离心管放置于离心机中，12000rpm，离心3min，取上清，耗时约15min。
[0051]
实施例5：小鼠基因组dna的提取
[0052]
剪取小鼠趾跟处2mm的趾甲放入洁净的离心管中，在离心管中加入100μl 25mm naoh溶液，将离心管置于金属浴中，96℃恒温加热10min；
[0053]
在金属浴中冷却降温至40℃左右，再自然冷却至室温(25℃)，对其进行裂解，再向离心管中加入ph为8.0的1m tris、5mm edta溶液，涡旋5s，一方面中和强碱，另一方面ph为8.0的tris为dna提供保护环境，edta能螯合mg
2+
，抑制dnase(脱氧核糖核酸酶)的活性，使得在该环境下dna呈稳定状态；
[0054]
室温(25℃)下，将离心管放置于离心机中，12000rpm，离心3min，取上清，耗时约15min。
[0055]
实施例6：对上述实施例2
‑
5中提取的小鼠的dna分别进行pcr反应
[0056]
设计鉴定小鼠基因型的引物，本实施例中为检测野生型小鼠和ndufa7转基因敲除小鼠分别设计出primer1(引物1)和primer2(引物2)：
[0057]
引物设计
[0058]
采用引物设计软件primer premier 5.0进行设计，设计原则为：引物长度为18～25bp，gc％为40％～60％左右，两条引物之间的tm值差别较小，选取能够涵盖目标片段的引物。共设计两对引物primer1f/r和primer2f/r，引物信息如表1，序列表中序列编号为seq id no:1～seq id no:4。所有引物设计完成后委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0059]
表1引物序列信息
[0060][0061][0062]
用设计好的鉴定小鼠基因型的引物进行pcr实验，pcr反应体系如下表2所示：
[0063]
表2 pcr反应的成分体积为：
[0064][0065]
pcr反应条件为：预变性：94℃，5min、1cycle；
[0066]
pcr反应：94℃变性，30s、56℃退火，30s、72℃延伸，45s、35cycle；
[0067]
彻底延伸：72℃，10min。
[0068]
实施例7：dna电泳检测
[0069]
pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，恒压130v，30min。在凝胶成像仪中进行观察并拍摄图片；
[0070]
实施例2
‑
5中提取的小鼠的dna的拍摄图片相同且均如图1所示。
[0071]
实施例8：对比实验
[0072]
使用高盐法提取小鼠dna，通过用高盐浓度的nacl溶解dna，去除在高盐中不能溶解的杂质,具体步骤如下：
[0073]
1、剪取小鼠2mm趾甲，加入500μl消化液(配方：6.7ml 5m nacl，0.4ml 0.5m edta，0.8ml 1m tris
‑
hcl,ph为8，0.7ml 20mg/ml proteinase k，3.5ml 20％sds,ddh2o定容至100ml)，55℃消化过夜；
[0074]
2、加入130μl 5m nacl，混匀后静置10min，4℃，13000rpm离心10min；
[0075]
3、取上清，加入2.5倍体积的95％的乙醇，混匀，4℃，13000rpm离心10min，沉淀dna；
[0076]
4、弃上清，向dna中加入500μl 70％乙醇进行洗涤，4℃，12000rpm离心5min；
[0077]
弃上清，在空气中干燥10min，加入ddh2o使dna充分溶解，完成dna的提取，除消化过夜外，耗时1h左右；
[0078]
5、按照实施例3和实施例4的方法，最终拍摄的电泳图片如图2所示。
[0079]
结果分析：如图1、图2所示，第一泳道中的为dl1000 dna marker，primer1能扩增野生型小鼠基因中771bp的片段，而primer2能扩增基因敲除鼠中450bp的片段。pcr结果中仅有771bp的带为野生型小鼠，仅有450bp的带为纯合型敲除鼠，而两条片段均能扩增出来的为杂合型敲除小鼠，两种方法提取出的小鼠的dna基因型鉴定结果并无差异，说明本方法可用于快速地鉴定小鼠的基因型，且涉及的试剂少；
[0080]
而高盐法提取小鼠dna涉及的试剂较多，步骤繁琐，耗时长，除消化过夜外，其余操作还需要30min～1h左右。
[0081]
本发明可快速地进行基因型鉴定，涉及的试剂少，提取dna操作为15min左右，适用
于高通量的或大批量的小鼠基因型鉴定。
[0082]
实施例9，一种小鼠趾甲dna的提取试剂盒，包括上述引物primer1f/r、primer2f/r、25～50mm naoh溶液以及ph为8.0的1m tris、2～5mm edta溶液；
[0083]
试剂盒的配制包括将0.1～0.2g naoh溶解于100ml ddh2o中，配成25～50mm naoh溶液；
[0084]
取12.114g tris，0.05845～0.14612g edta溶解于ddh2o中，用盐酸调ph至8.0，定容至100ml，配成ph为8.0的1m tris、2～5mm edta溶液，所述25～50mm naoh溶液的体积为100μl，所述ph为8.0的1m tris、2～5mm edta溶液的体积为20μl。
[0085]
上述实施例中单位m表示mol/l，mm表示mmol/l。
[0086]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0087]
[0088]