一种类肝素的制备方法与流程

[0001]
本发明涉及化工技术领域，尤其涉及一种类肝素的制备方法。


背景技术：

[0002]
类肝素即类似肝素的物质，是在化学结构上与肝素有一定程度的类似、具有抗凝血活性的酸性黏多糖类物质。类肝素可以通过与血管内皮表面结合，促进了具有抗血栓活性的内源性氨基多糖的释放，可改善局部微循环，增加血流量及血流速度，从而改善中间代谢，促进皮肤营养的供给及废物的排泄，从而具有抗血栓形成、消炎、止痛、改善患处血液循环、吸收渗出物、治愈水肿及浮肿、促进组织修复等作用；在角质软化剂、天然保湿剂的协同作用下，能够抑制胶原纤维的过度增长，减轻瘢痕形成；并能保留皮肤表面水分，使胶原纤维软化，弹性增强，对增生性瘢痕有软化作用。临床适用于血管栓塞、静脉曲张、浅表静脉炎、软化疤痕等。
[0003]
同时，以硫酸软骨素进行制备的类肝素作为硫酸化多糖、抗菌谱广，对许多致病菌如化脓性菌(金黄色葡萄球菌)、肠道菌群(大肠杆菌)、致病性真菌(白色念珠菌)、病毒(脊髓灰质炎病毒)等有良好的抑制作用，能够有效地控制发炎病症，改善患处血液循环，吸收渗液，治愈水肿及浮肿。
[0004]
petitou等人在美国专利“硫酸软骨素和硫酸皮肤素类硫酸化的硫酸软骨素类衍生物的制备”(us5382570)曾经公开了硫酸化硫酸软骨素的制备方法，但是该方法具有工艺复杂、试剂成本高、不利于工业化生产以及所得产物具有不同的结构和活性等特征，从而限制了其应用。
[0005]
公开号为cn1789287a的专利说明书中公开了一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法，其中公开了使用氯磺酸、浓硫酸制备多硫酸化硫酸软骨素的方法，但是由于氯磺酸和浓硫酸具有高度危险性，操作有难度，工业生产中对设备要求高，因而应用受到限制。另外，申请人重复上述文献，产物的收率较低，操作难度高，因而不适合大规模工业化生产。
[0006]
公开号为cn104877042a的专利说明书中公开了一种类肝素的制备方法，其中公开了使用不同磺化剂制备类肝素的方法，但是没有太多说明类肝素的相关数据，申请人重复上述文献方法时，产物杂质较多，分子量分布不均，不利于产物的使用，并且引入较多有机试剂，不适合大规模工业化生产。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述问题，提供一种类肝素的制备方法，该方法成本低，环保，所用有机试剂少，易于掌握，制备所得类肝素具有分子量稳定、杂质含量低、安全有效、磺化程度稳定的优点。
[0008]
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
[0009]
一种类肝素的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
1)前处理：将甲酰胺、极性有机溶剂按1：1-10比例混合；
[0011]
2)磺化反应：将硫酸软骨素溶解于6-10倍体积的步骤1)得到的溶剂中，混合均匀后加入吡啶三氧化硫，于50-90℃的温度下反应2-10h；
[0012]
3)纳滤除胺：将步骤2)中的混合溶液冷却至室温后，调节ph至7，使用截流分子量为300-3000的纳滤膜进行纳滤操作，纳滤操作期间持续添加去离子水，测得透过液电导率在300-600停止添加去离子水；待固体总重与截流液体积的比值为10-50％w/v时停止纳滤操作，收集液体；
[0013]
4)离子交换树脂脱蛋白：将步骤3)所得液体依次经过强酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂，进行大分子蛋白处理，收集ph＜5的部分，然后用碱液调节ph至6.5-7.8；
[0014]
5)过氧化氢脱色：将步骤4)所得溶液过滤浓缩后，将ph调节至9-11，加入过氧化氢进行脱色3-12h；
[0015]
6)纳滤除盐和冷冻干燥：将步骤5)所得溶液过滤浓缩后，将ph调节至6-7，使用纳滤膜进行纳滤操作，纳滤操作期间持续添加去离子水，测得透过液电导率在1-300时停止添加去离子水；待固体总重与截流液体积的比值为10-80％w/v时停止纳滤操作，收集液体，冷冻干燥得类肝素。
[0016]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤1)中，所述极性有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或吡啶。
[0017]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤1)中，将甲酰胺、极性有机溶剂按1：1-5比例混合。
[0018]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤1)中，将甲酰胺、极性有机溶剂按1：1比例混合。
[0019]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤3)中，所述纳滤膜的截流分子量为300-3000。
[0020]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤4)中，所述碱液为质量百分比浓度为30％的naoh溶液。
[0021]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤5)中，所述过氧化氢的质量百分比浓度为30％。
[0022]
进一步地，如上所述类肝素的制备方法，步骤6)中，所述纳滤膜的截流分子量为300-3000。
[0023]
本发明的有益效果是：
[0024]
本发明提供类肝素钠的制备方法，其合成工艺简单，生产操作易于控制，生产设备无特殊要求，有机试剂使用少，环保易处理，产品分子量范围稳定、理化指标控制在质量标准范围内，同时产品收率正常，纯度高，杂质少，适合大规模工业化生产。
[0025]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附
图。
[0027]
图1为本发明实施例一的分子量gpc图谱。
[0028]
图2为本发明对比例一的分子量gpc图谱。
[0029]
图3为本发明对比例二的分子量gpc图谱。
[0030]
图4为本发明对比例三的分子量gpc图谱。
具体实施方式
[0031]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例一
[0033]
一种类肝素的制备方法，包括如下步骤：
[0034]
1)前处理：将甲酰胺同n，n-二甲基甲酰胺按1：1比例混合，制备1000ml混合溶剂。
[0035]
2)磺化反应：将100g硫酸软骨素溶解于1000ml步骤1)溶剂中，混合均匀后加入吡啶三氧化硫，加热升温至70℃搅拌反应5h。
[0036]
3)纳滤除胺：将步骤2)中的混合溶液冷却至室温后，用质量百分比浓度为30％的naoh溶液调节ph值至8
±
0.3后，加入3l去离子水，使用截流分子量为300的纳滤膜进行纳滤操作，期间一直补加去离子水，测得透过液电导率为350，停止加水，当截流液体积为500ml时，放出液体。
[0037]
4)离子交换树脂脱蛋白：步骤3)所得液体依次经过500ml强酸性阳离子交换树脂、500ml强碱性阴离子交换树脂，收集ph＜5的部分，然后用质量百分比浓度为30％的naoh溶液调节溶液ph至7
±
0.5。
[0038]
5)过氧化氢脱色：将步骤4)所得溶液过滤浓缩至200ml，将ph值调节至10
±
0.3，加入15ml质量浓度为30％的过氧化氢溶液进行脱色8h。
[0039]
6)纳滤除盐和冷冻干燥：将步骤5)所得溶液过滤浓缩后，将ph值调节至7
±
0.3，使用截流分子量为2000的纳滤膜进行纳滤操作，期间一直添加去离子水，测得透过液电导率在200时停止加水。当截流液体积为500ml时停止加水，收集液体，冷冻干燥得类肝素。
[0040]
本实施例分子量gpc图谱可见图1，可以看到分子量分布均匀，在图谱中只有一个峰，基本无其他大小分子，分子量大小适中。
[0041]
相关安全性以及功效性数据见表2所示。
[0042]
对比例一
[0043]
一种类肝素的制备方法，包括如下步骤：
[0044]
1)前处理：将甲酰胺同n，n-二甲基甲酰胺按1：1比例混合，制备1000ml混合溶剂。
[0045]
2)磺化反应：将100g硫酸软骨素溶解于1000ml步骤1)溶剂中，混合均匀后加入吡啶三氧化硫，加热升温至70℃搅拌反应5h，用质量百分比浓度为30％的naoh溶液调节ph值至8
±
0.3。
[0046]
3)离子交换树脂脱蛋白：步骤2)所得液体依次经过500ml强酸性阳离子交换树脂、500ml强碱性阴离子交换树脂，收集ph＜5的部分，然后用质量百分比浓度为30％的naoh溶
液调节溶液ph至7
±
0.5。
[0047]
4)过氧化氢脱色：将步骤3)所得溶液过滤浓缩至200ml，将ph值调节至10
±
0.3，加入15ml质量浓度为30％的过氧化氢溶液进行脱色8h。
[0048]
5)纳滤除盐和冷冻干燥：将步骤4)所得溶液过滤浓缩后，将ph值调节至7
±
0.3，使用截流分子量为2000的纳滤膜进行纳滤操作，期间一直添加去离子水，测得透过液电导率在200时停止加水。当截流液体积为500ml时停止加水，收集液体，冷冻干燥得类肝素。
[0049]
较于实施例一：对比例一没有进行纳滤除胺的步骤，后续则按照相同的步骤进行，最后进行相同的检测时，含氮量远远高于本发明实施例一的结果，具体检测可见下表1对比。
[0050]
本对比例分子量gpc图谱可见图2，可以看到分子量分布不均匀，存在多种分子量的产品。
[0051]
对比例二
[0052]
一种类肝素的制备方法，包括如下步骤：
[0053]
1)前处理：将甲酰胺同n，n-二甲基甲酰胺按1：1比例混合，制备1000ml混合溶剂。
[0054]
2)磺化反应：将100g硫酸软骨素溶解于1000ml步骤(1)溶剂中，混合均匀后加入吡啶三氧化硫，加热升温至70℃搅拌反应5h。
[0055]
3)纳滤除胺：将步骤(2)中的混合溶液冷却至室温后，用质量百分比浓度为30％的naoh溶液调节ph值至8
±
0.3后，加入3l去离子水，使用截流分子量为300的纳滤膜进行纳滤操作，期间一直补加去离子水，测得透过液电导率为350，停止加水，当截流液体积为500ml时，放出液体。
[0056]
4)过氧化氢脱色：将步骤(3)所得溶液过滤浓缩至200ml，将ph值调节至10
±
0.3，加入15ml质量浓度为30％的过氧化氢溶液进行脱色8h。
[0057]
5)纳滤除盐和冷冻干燥：将步骤(4)所得溶液过滤浓缩后，将ph值调节至7
±
0.3，使用截流分子量为2000的纳滤膜进行纳滤操作，期间一直添加去离子水，测得透过液电导率在200时停止加水。当截流液体积为500ml时停止加水，收集液体，冷冻干燥得类肝素。
[0058]
较于实施例一：对比例二没有进行离子树脂除蛋白的步骤，后续则按照相同的步骤进行，最后进行相同的检测时，含氮量和蛋白质含量远远高于本发明实施例一的结果，具体检测可见下表1对比。
[0059]
本对比例分子量gpc图谱可见图3，可以看到分子量分布不均匀，存在多种分子量的产品。
[0060]
相关安全性以及功效性数据见表2所示。
[0061]
对比例三
[0062]
一种类肝素的制备方法，包括如下步骤：
[0063]
1)前处理：将甲酰胺同n，n-二甲基甲酰胺按1：1比例混合，制备1000ml混合溶剂。
[0064]
2)磺化反应：将100g硫酸软骨素溶解于1000ml步骤(1)溶剂中，混合均匀后加入吡啶三氧化硫，加热升温至70℃搅拌反应5h。
[0065]
3)纳滤除胺：将步骤(2)中的混合溶液冷却至室温后，用质量百分比浓度为30％的naoh溶液调节ph值至8
±
0.3后，加入3l去离子水，使用截流分子量为300的纳滤膜进行纳滤操作，期间一直补加去离子水，测得透过液电导率为350，停止加水，当截流液体积为500ml
时，放出液体。
[0066]
4)离子交换树脂脱蛋白：步骤(3)所得液体依次经过500ml强酸性阳离子交换树脂、500ml强碱性阴离子交换树脂，收集ph＜5的部分，然后用质量百分比浓度为30％的naoh溶液调节溶液ph至7
±
0.5。
[0067]
5)过氧化氢脱色和冷冻干燥：将步骤(4)所得溶液过滤浓缩至200ml，将ph值调节至10
±
0.3，加入15ml质量浓度为30％的过氧化氢溶液进行脱色8h后进行冷冻干燥，得类肝素样品。
[0068]
较于实施例一：对比例三没有进行纳滤除盐的步骤，后续则按照相同的步骤进行，最后进行相同的检测时，部分盐离子含量远远高于本发明实施例一的结果，具体检测可见下表1对比：
[0069]
表1检测结果对比表
[0070][0071]
本对比例分子量gpc图谱可见图4，可以看到分子量分布不均匀，同时存在多种分子量的产品。
[0072]
相关安全性以及功效性数据见表2所示：
[0073]
表2相关安全性以及功效性数据对比表
[0074][0075][0076]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。