从车桑子中提取的二萜类化合物及其在制药中的用途

1.本发明属医药技术领域，涉及天然克罗烷型二萜类化合物及其药用用途，具体涉及三种从车桑子中分离得到的克罗烷型二萜类化合物及其药用用途；尤其是化合物10(5
→
3)-abeo-15,16-环氧1,4,13(16),14-克罗烷四烯-18,19-内酯，化合物4(5
→
19)-abeo-15,16-环氧-2,4,10(1),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸以及化合物5,10-seco-15,16-环氧-1,3,5(19),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸,及其在制备atp柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。


背景技术：

2.现有技术公开了车桑子(dodonaea viscosa(linn.)jacq.)为无患子科(sapindaceae)车桑子属植物。车桑子属植物全球约50种，我国仅车桑子一种，分布于西南部、南部至东南部。研究公开了车桑子不仅作为一种防风固沙的经济作物被应用，并且具有药用价值，其叶入药具有清热利湿、解毒消肿的功效，主治淋证、癃闭、皮肤瘙痒、痈肿、疮疖和烫火伤；车桑子中富含克罗烷型二萜、三萜、黄酮和皂苷类化合物，部分化合物具有促进脂肪细胞分化、抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b(protein tyrosine phosphatase 1b，ptp1b)和抗病毒等活性(journal of natural products 2009,72,1705；journal of natural products 2012,75,699；journal of asian natural products research 2010,12,7；tetrahedron 2001,57,2981；tetrahedron 2016,72,8036.)。
3.研究显示，高脂血症(hyperlipidemia)是由于脂肪代谢或运转异常使血清总胆固醇、甘油三酯和(或)低密度脂蛋白胆固醇过高，和(或)高密度脂蛋白胆固醇过低而引发的一种严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病；该疾患的患病原因与不健康的生活习惯和饮食习惯有关，集中发病人群为中老年人。据统计，由于现代生活方式的改变和生活水平的提高，该疾患有明显的年轻化趋势，并且容易产生动脉粥样硬化等其他并发症。降血脂的药物目前主要有他汀类药物、贝特类药物、胆固醇吸收抑制剂类以及烟酸类药物等，但长期大剂量的使用均会出现不同程度的药物耐受、肝损伤或产生一些不良反应。
4.atp柠檬酸裂解酶(atp citrate lyase,acly)是肝脏脂肪合成通路上的由介导瘦素调节糖脂代谢平衡的关键效应基因之一，其位于细胞质中，能影响脂质和胆固醇的合成，被认为是治疗高脂血症的重要靶标(european journal of medicinal chemistry 2018,157,1276)。2020年2月21日，fda批准acly抑制剂nexletol(bempedoic acid)上市，是自2002年以来批准的首个非他汀类降血脂药物(expert opinion on investigational drugs 2020,29,763)；因此，acly是治疗高脂血症的有效靶标，寻找更多的acly抑制剂对治疗该代谢性疾病药物的研发极为重要。
5.基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供克罗烷型二萜类化合物及其药用用途，具体涉及三种从车桑子中分离得到的克罗烷型二萜类化合物及其药用用途。


技术实现要素：

6.本发明的目的是基于现有技术的现状，提供克罗烷型二萜类化合物及其药用用途，具体涉及三种从车桑子中分离得到的克罗烷型二萜类化合物及其药用用途；尤其是化合物10(5
→
3)-abeo-15,16-环氧1,4,13(16),14-克罗烷四烯-18,19-内酯，化合物4(5
→
19)-abeo-15,16-环氧-2,4,10(1),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸以及化合物5,10-seco-15,16-环氧-1,3,5(19),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸,及其在制备atp柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。
7.本发明提供了三种克罗烷二萜类化合物，具体涉及结构如式(i)、(ii)和(iii)所示的化合物，所述三种化合物是从车桑子地上部分分离得到的天然化合物；其中，式(i)和(ii)结构的克罗烷二萜类化合物从车桑子中分离得到，未见有关其结构和生物活性的报道；式(iii)所示的化合物strictic acid最早从劲直白酒草(conyza stricta)中分离得到(phytochemistry 1979，18，494)，未见其相关生物活性报道；
[0008][0009]
本发明的进一步目的是提供所述化合物的药用用途。本发明经实验证实，所述式(i)、(ii)、(iii)所示的三个化合物对acly具有明显的抑制作用，可作为制备新的预防或治疗高脂血症的药物或先导化合物。
[0010]
本发明所述的化合物通过以下方法制得：
[0011]
将车桑子的干燥地上部分粉碎后，用有机溶剂或/和水提取制备得到总提取物，所用的有机溶剂可采用醇类，如乙醇，甲醇等，其中优选95％(体积比)乙醇。将总提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，浓缩至干，即得到乙酸乙酯提取物。
[0012]
将乙酸乙酯提取物进行大孔树脂hp-20柱层析，用含水乙醇梯度洗脱；其中90％(体积比)乙醇洗脱部位进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱；其中石油醚-乙酸乙酯15:1洗脱部分经高效液相制备得到式(iii)所示化合物，用波谱方法鉴定其结构为5,10-seco-15,16-环氧-1,3,5(19),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸；石油醚-乙酸乙酯10:1洗脱部分经高效液相制备得到式(i)和式(ii)所示化合物，用波谱方法鉴定式(i)化合物的结构为10(5
→
3)-abeo-15,16-环氧1,4,13(16),14-克罗烷四烯-18,19-内酯，式(ii)化合物的结构为4(5
→
19)-abeo-15,16-环氧-2,4,10(1),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸。
[0013]
本发明对式(i)、(ii)、(iii)化合物进行了acly活性测试，结果表明，所述三个化合物均具有很强的acly抑制作用，本发明的式(i)、(ii)、(iii)化合物可制备atp柠檬酸裂解酶抑制剂，以及作为研制新的预防或治疗高脂血症的药物或先导化合物。
具体实施方式
[0014]
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0015]
实施例1从车桑子中提取本发明化合物
[0016]
(1)提取：将干燥的车桑子地上部分(7.0千克)粉碎后于室温下用95％的乙醇渗漉提取，减压浓缩得到浸膏2.0千克，将此浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，浓缩至干，得到乙酸乙酯提取物650克；
[0017]
(2)分离：将乙酸乙酯提取物650克进行大孔树脂hp-20柱层析，用乙醇-水(30:70
→
70:30
→
90:10)梯度洗脱，每个梯度用量60升，收集流份；其中乙醇-水90:10流份(100克)进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(30:1
→
20:1
→
15:1
→
10:1
→
5:1
→
1:1
→
0:1)梯度洗脱，每个梯度用量5升；其中石油醚-乙酸乙酯15:1洗脱部分经高效液相制备得到式(iii)化合物15毫克，即5,10-seco-15,16-环氧-1,3,5(19),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸，洗脱剂为甲醇-水75:25,保留时间为6.5分钟；石油醚-乙酸乙酯10:1洗脱部分经高效液相制备得到式(i)和式(ii)化合物，式(i)化合物5毫克(洗脱剂为乙腈-水72：28，保留时间为19.0分钟)，即10(5
→
3)-abeo-15,16-环氧1,4,13(16),14-克罗烷四烯-18,19-内酯，式(ii)化合物6毫克(洗脱剂为乙腈-水72:28，保留时间14.5分钟)，即4(5
→
19)-abeo-15,16-环氧-2,4,10(1),13(16),14-克罗烷五烯-18-羧酸；高相液相色谱仪为岛津essentia lc-16，紫外检测波长为210nm和254nm；色谱柱为ymc c18柱(150
×
10mm,5μm)，流速为3.5ml
·
min-1
；
[0018]
式(i)化合物的理化性质及光谱数据如下：性状为无色晶体；分子式为c
20h24
o3；分子量为312；熔点：159-161℃；比旋光度值：[α]
25d
+51.7(c 0.13,甲醇)；紫外光谱最大吸收波长值(甲醇)：206(4.18)nm；红外光谱最大吸收频率值(溴化钾)：2927,1744,1448,1383,1201,1136,1044cm-1
；高分辨电喷雾电离质谱(质荷比)：正离子模式335.1616[m+na]
+
(示分子式c
20h24
o3)；核磁共振氢谱(400mhz)数据(化学位移：ppm，偶合常数：hz,溶剂：氘代氯仿)：δh:7.36(1h,br s,h-15),7.21(1h,br s,h-16),6.71(1h,br s,h-2),6.26(1h,br s,h-14),6.08(1h,br s,h-1),4.59,4.52(1h each,br d,j＝16.8,h
2-19),3.65(1h,br s,h-3),2.88(1h,br s,h-10),2.67(1h,dd,j＝19.2,9.6,h-6a),2.36-2.37(3h,m,h-6b,h
2-12),1.93(1h,m,h-7a),1.68-1.69(2h,m,h-8,h-11a),1.55-1.58(2h,m,h-7b,h-11b),0.96(3h,d,j＝6.8,h
3-17),0.83(3h,s,h
3-20)；核磁共振碳谱数据如表1所示；
[0019]
式(ii)化合物的理化性质及光谱数据如下：性状为白色无定形粉末；分子式为c
20h24
o3；分子量为312；比旋光度值：[α]
25d-68.1(c 0.67,甲醇)；紫外光谱最大吸收波长值(甲醇)：206(3.88)nm；红外光谱最大吸收频率值(溴化钾)：2927,1711,1452,1383,1202,1138,1026cm-1
；高分辨电喷雾电离质谱(质荷比)：正离子模式313.1800[m+h]
+
(示分子式c
20h24
o3)；核磁共振氢谱(400mhz)数据(化学位移：ppm，偶合常数：hz,溶剂：氘代氯仿)：δh:7.26(1h,br s,h-15),7.12(1h,d,j＝10.4,h-3),7.06(1h,br s,h-16),6.79(1h,dd,j＝10.4,6.0,h-2),6.39(1h,d,j＝7.6,h-19),6.13(2h,br s,h-1,h-14),2.20(1h,m,h-7a),2.08(1h,m,h-6a),2.03(1h,m,h-12a),1.90(1h,br d,j＝13.2,h-6b),1.72-1.75(2h,m,h-8,h-12b),1.56(1h,br t,j＝7.2,h-5),1.46-1.51(3h,m,h-7b,h
2-11),1.17(3h,s,h
3-20),1.05(3h,d,j＝6.4,h
3-17)；核磁共振碳谱数据如表1所示；
[0020]
式(iii)化合物的理化性质及光谱数据如下：性状为无色膏状物；分子式为c
20h26
o3；分子量为314；比旋光度值：[α]
25d-175.4(c 0.21,甲醇)；紫外光谱最大吸收波长值
(甲醇)：223(4.64)nm；红外光谱最大吸收频率值(溴化钾)：2920,1820,1680,1650,1500,1460,1380,1170,1055,720cm-1
；低分辨电喷雾电离质谱(质荷比)：负离子模式313.2[m-h]-；核磁共振氢谱(400mhz)数据(化学位移：ppm，偶合常数：hz,溶剂：氘代氯仿)：δh:7.41(1h,br s,h-3),7.35(1h,br s,h-15),7.22(1h,br s,h-16),6.28(1h,s,h-14),5.94(1h,d,j＝12.0hz,h-2),5.42(1h,t,j＝12.0hz,h-1),5.10(1h,br s,h-19b),4.87(1h,d,br s,h-19a),2.71(1h,m,h-6a),2.45(1h,m,h-12a),0.83-1.72(6h,m,h-6b,h
2-7,h
2-11,h-12b),0.75(3h,d,j＝6.0,h
3-17),0.73(3h,s,h
3-20)；核磁共振碳谱如表1所示。
[0021]
实施例2式(i)、(ii)、(iii)化合物对atp柠檬酸裂解酶(acly)抑制活性的测试
[0022]
基于acly在反应过程中，需要利用atp实现磷酸化(e+atp
→
e-p+adp)产生adp，因此，使用adp-glo
tm
荧光素酶试剂盒(promega co.,usa)检测adp的生成量可以检测acly酶的活性；本实施例中，在多孔板上加入2μl的acly酶，2μl的底物混合液(5μm atp，30μm柠檬酸盐，50μm辅酶a溶于缓冲液)，以及1μl溶解于10％dmso中不同浓度的待测化合物，缓冲液包括40mm tris(ph 8.0),10mm mgcl2,and 5mm dtt。离心混匀，37℃条件下反应30分钟，随后，每孔加入2.5μl的adp-glo
tm
reagent试剂，离心混匀，常温反应1h，最后，避光条件下，每孔加入5μl的adp detection试剂，离心混匀后，在多探测器酶标仪perkinelmer envision reader(perkinelmer co.,ltd.,uk)上读取各组荧光素酶响应值，使用graphpad prism 8.0计算ic
50
值
。
式(i)、(ii)、(iii)化合物都表现出了较强的acly抑制活性，ic
50
值分别为3.02
±
0.53μm，2.60
±
0.80μm和0.24
±
0.09μm,阳性对照bms-303141(2-hydroxy-n-arylbenzenesulfonamide)的ic
50
值为0.26
±
0.01μm。
[0023]
表1是式(i)、(ii)和(iii)化合物的核磁共振碳谱数据(150mhz,化学位移：ppm，溶剂：氘代氯仿)。
[0024]
表1
[0025]