减毒鼠伤寒沙门菌及其构建方法与应用与流程

1.本发明涉及基因工程与免疫技术领域，尤其涉及一种减毒鼠伤寒沙门菌及其构建方法与应用。


背景技术：

2.沙门菌是一种重要的食源性病原菌，可诱发宿主，包括人类、鸟类、哺乳类和爬行类动物发生急性肠炎、菌血症或者长期的慢性感染。根据临床症状可分为伤寒沙门菌和非伤寒沙门菌两类病原体，其中非伤寒沙门菌有2500多种血清型，通常诱发人产生胃肠道症状，包括腹泻和呕吐，但在婴幼儿、老人以及免疫缺陷人群中会诱发严重的高发病率和死亡率的入侵性疾病(如败血症)。鼠伤寒沙门菌是非伤寒沙门菌中导致入侵性疾病的最主要的致病菌之一。随着沙门菌的进化，其感染也会导致健康成年人或沙门菌的长期携带者发生或发展为入侵性非伤寒沙门菌感染。另外，由于抗生素的大量滥用以及环境和食物中抗生素的残留导致沙门菌的耐药性愈来愈多重且普遍，研制高效沙门菌疫苗研究对沙门菌病的防控亦愈来愈重要。
3.伤寒沙门菌疫苗ty21a已被应用于人类来防控伤寒沙门菌的感染，但至今仍无一株批准的可应用于人类的非伤寒沙门菌疫苗，因此非伤寒沙门菌的疫苗研究仍任重道远。另外沙门菌作为兼性胞内菌可在宿主吞噬细胞内形成沙门小体，逃避胞内杀伤作用，从而导致全身感染或形成长期的慢性感染。因此，可同时诱导抗体应答和细胞免疫应答的减毒活疫苗将更适宜于沙门菌病的防控，其所诱导的免疫反应可同时清除定殖于胞内和胞外的沙门菌，并且可提供长期的免疫保护。
4.为此，本领域技术人员已经做了很多努力，比如公开号为cn105132350a的中国专利申请，就公开了一种缺失自有rfbb基因和rffg基因的减毒鼠伤寒沙门菌，又比如公开号为 cn105462907a的中国专利申请，公开了一种缺失自有rfbk和cpsg基因的减毒鼠伤寒沙门菌，他们都具有较好的减毒效果和免疫原性。但是，减毒疫苗的开发，需要更丰富的备选靶向基因，以便能获得更优的选择。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一，就在于提供一种新的减毒鼠伤寒沙门菌，以解决上述问题。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种减毒鼠伤寒沙门菌，所述减毒鼠伤寒沙门菌缺失自有fnr基因、arca基因和flic基因，所述减毒鼠伤寒沙门菌的分类命名为salmonella enterica slt39,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为： cctcc m 2020499，保藏时间为：2020年9月14日。
7.选择合适的毒力基因是构建沙门菌减毒疫苗的前提，而其中最大的挑战在于缺失靶基因后菌株既要高度减毒又要保持良好的免疫原性，因而缺失基因的靶向是十分关键的。本申请的发明人经过筛选，发现同时缺失arca(双组份调控系统调节子)、fnr(延胡索酸盐和硝酸盐还原反应蛋白)及flic(鞭毛亚单位蛋白)三个基因可大幅降低细菌的毒力，同
时其口服免疫可产生显著的抗体应答和高水平的免疫保护效果。这证实该减毒菌株是一种合适的沙门菌弱毒疫苗候选株。
8.本发明的目的之二，在于提供上述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，采用的技术方案为，采用自杀质粒同源重组方法，缺失鼠伤寒沙门菌atcc14028的fnr基因、arca基因和 flic基因。
9.作为优选的技术方案，所述自杀质粒同源重组方法包括以下步骤：
10.(1)分别构建自杀质粒pre112
‑
δfnr、pre112
‑
δarca和pre112
‑
δflic；
11.(2)将步骤(1)构建好的自杀质粒与与鼠伤寒沙门菌atcc14028菌株进行接合转移，筛选阳性菌落，然后将阳性菌落置于培养基中增殖培养；
12.(3)通过pcr筛选得到同时缺失fnr基因、arca基因和flic基因的突变菌株atcc14028 (δfnrδarcaδflic)。
13.作为优选的技术方案，步骤(1)中，自杀质粒的构建方法为：
14.(1)突变引物设计：根据genbank公布的来源于鼠伤寒沙门菌atcc14028全基因组序列，设计用于分别扩增fnr基因、arca基因和flic基因的上、下游同源臂的引物；
15.(2)上、下游同源臂的扩增：采用步骤(1)的引物通过pcr分别对fnr基因、arca基因和flic基因的上、下游同源臂进行扩增，得到扩增产物；
16.(3)上、下游同源臂的融合；将步骤(2)所得的扩增产物采用引物和高保真酶进行 pcr扩增，得到融合片段；
17.(4)酶切处理：分别用kpni和smai酶酶切步骤(3)所得的融合片段和pre112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；
18.(5)连接：利用连接酶将步骤(4)酶切后的融合片段与pre112质粒连接，过夜，转化sm10λpir大肠杆菌感受态细胞中，待其长出后，进行pcr鉴定，获得阳性重组自杀质粒pre112
‑
δfnr、pre112
‑
δarca和pre112
‑
δflic。
19.作为进一步优选的技术方案，步骤(1)中，每种基因各设计两对扩增引物。
20.作为更进一步优选的技术方案，所采用的引物序列如下：
δflic)具有高效减毒、免疫原性强、保护效率高三方面的特性；本发明提供的减毒鼠伤寒沙门菌slt39的ld
50
为2.9
×
109cfu，较野生株atcc14028具有104倍的减毒，且slt39以不同剂量免疫小鼠后均可诱导高水平的血清抗体反应和黏膜免疫反应，以108cfu进行免疫可以获得100％的保护，适合作为鼠伤寒沙门菌基因工程减毒疫苗的候选，为活减毒疫苗的开发提供更多的靶向基因的可能性。
附图说明
31.图1为pcr鉴定pcr鉴定沙门菌slt36arca缺失株的电泳结果图；
32.图2为pcr鉴定slt35、slt36、slt38单缺失株和slt37双缺失株电泳结果图；
33.图3为pcr鉴定slt39三缺失株的基因表型电泳结果图；
34.图4为两个dna片段的扩增电泳结果图；
35.图5为slt35在缺失株中回补fnr基因、在slt36缺失株中回补arca基因、在slt38 中回补flic基因结果图；
36.图6为回补株的运动表型鉴定结果图；
37.图7为鼠伤寒沙门菌野生株和各缺失株于感染5天后在小鼠pps(a)、脾脏(b)和肝脏(c)的定殖水平图；
38.图8为elisa检测减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株slt39和免疫对照株slt04两次免疫后针对沙门菌的血清igg抗体、亚型igg1和igg2a应答以及igg2a/igg1的比值图；
39.图9为elisa检测免疫后针对鼠伤寒沙门菌的黏膜iga抗体检测，分别是粪便中(a)、小肠
‑
十二指肠(b)、盲肠(c)黏膜表面的iga水平；
40.图10为各免疫组经鼠伤寒沙门菌野毒株攻毒后组织中的细菌载量测定结果图。
具体实施方式
41.下面将结合附图对本发明作进一步说明。
42.实施例1：
43.鼠伤寒沙门菌缺失自有fnr基因、arca基因和flic基因的突变菌株的构建与回补，具体步骤为：
44.本申请以鼠伤寒沙门菌atcc14028为基础菌株，通过自杀质粒pre112介导的同源重组法构建了命名为slt39(δfnrδarcaδflic)的突变株，并构建了其余四种对比突变株，分别为slt35(δfnr)、slt36(δarca)、slt37(δfnrδarca)和slt38(δflic)。突变株构建所用引物如表1所示；
45.三种基因的缺失顺序为：fnr、arca和flic；下面以arca基因的缺失为例简述缺失株、回补株构建方法，具体如下：
46.1.1 arca突变引物设计
47.根据genbank公布的来源于鼠伤寒沙门菌atcc14028全基因组序列，设计两对引物 darca 1f/darca 1r、darca 2f/darca 2r分别扩增arca基因的上、下游同源臂，扩增片段大小分别为421bp和462bp。引物均由北京华大基因公司合成，序列如表1所示：
48.表1.构建沙门菌突变株所需引物
[0049][0050][0051]
1.2 arca基因上、下游同源臂的扩增以及融合
[0052]
1)挑取atcc14028单菌落于5ml lb液体培养基中过夜培养(37℃，180rpm)，用天根生化科技有限公司的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组抽提；
[0053]
2)上、下游同源臂的扩增：pcr扩增反应在50μl的体系中进行，反应体系如下：模板dna(细菌基因组)1μl，2
×
prime star max(宝生物有限公司)25μl，上游引物1 μl，上游引物1μl，ddh2o 22μl。扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃30sec，72℃15sec。30个循环后，72℃延伸5min。扩增的pcr 产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小与预期大小相符；
[0054]
3)上、下游同源臂的融合：将上下游同源臂的pcr提纯产物按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用引物darca
‑
1f/darca
‑
2r和高保真酶prime star max 进行pcr扩增，得到融合片段；
[0055]
1.3 pre112
‑
δarca自杀质粒的构建
[0056]
1)融合片段和自杀质粒pre112酶切处理：分别用kpni和smai酶酶切融合片段和 pre112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段。
[0057]
2)连接：利用t4 dna连接酶将酶切后的融合片段与pre112质粒连接，16℃，过夜，转化sm10λpir大肠杆菌感受态细胞中，待其长出后进行pcr鉴定，获得阳性重组自杀质粒pre112
‑
δarca。将质粒抽提后送往生工生物技术有限公司进行测序与鉴定。
[0058]
1.4 atcc14028δarca缺失株的构建与鉴定
[0059]
1)构建过程：将构建好的重组自杀质粒pre112
‑
δarca
‑
sm10与鼠伤寒沙门菌atcc14028 菌株进行接合转移，在氯霉素抗性的lb平板上筛选阳性菌落。接着将阳性菌落
置于不含氯霉素抗性的lb液体培养基中增殖培养，然后涂于10％蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行pcr鉴定。
[0060]
2)pcr鉴定：以待检菌落为模板，用引物darca
‑
1f/darca
‑
2r进行pcr扩增。菌株缺失arca后，引物darca
‑
1f/darca
‑
2r扩增产物为融合同源臂δarca
‑
ud，796bp。若未缺失成功则pcr产物条带大小为1513bp。如图1所示，缺失株pcr鉴定条带大小与理论相符，表明arca基因缺失株构建成功。图1中：两泳道为用darca
‑
1f/darca
‑
2r对缺失株和野生株进行扩增的产物大小，分别为796bp和1513bp，即得到slt36(δarca)。
[0061]
1.5其他突变株的构建与鉴定
[0062]
应用相似的方法构建slt35(δfnr)、slt37(δfnrδarca)和slt38(δflic)和slt39 (δfnrδarcaδflic)，其电泳检测结果如图2和3所示。
[0063]
1.6回补株的构建与鉴定
[0064]
重组回补质粒pczb1
‑
arca的构建：通过对pczb1和arca基因片段进行双酶切连接，构建质粒pczb1
‑
arca。具体如下：
[0065]
2.1 arca基因片段的扩增
[0066]
以鼠伤寒沙门菌atcc14028的基因组为模板，利用引物arca
‑
f/arca
‑
r扩增获得717bp 的序列；所用引物序列如下表2所示。
[0067]
表2.构建重组回补质粒pczb1
‑
arca所需引物
[0068][0069]
所用dna聚合酶为prime star max(宝生物有限公司)，pcr扩增反应在50μl的体系中进行，反应体系为：模板dna 1μl，2
×
prime star max 25μl，上游引物1μl，上游引物1μl，ddh2o 22μl。扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃ 10s，55℃30s，72℃15s。30个循环后，72℃延伸5min。如图4所示，扩增的pcr 产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，两个片段大小与预期大小相符。图4中：泳道1，利用引物arca
‑
f/arca
‑
r扩增arca序列；泳道2，利用引物fnr
‑
f/fnr
‑
r扩增fnr序列。m， dna markerⅲ。
[0070]
2.2质粒pczb1
‑
arca的构建
[0071]
分别用noti
‑
hf和hind
ⅲ‑
hf酶酶切扩增片段和pczb1质粒，将扩增片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段。利用t4 dna连接酶将酶切后的扩增片段和质粒连接， 16℃，过夜，然后将连接产物转化top.10大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行pcr鉴定，将质粒抽提后送往生工生物技术有限公司进行测序，证实构建的质粒是正确的。
[0072]
2.3鼠伤寒沙门菌缺失株的回补
[0073]
将重组的回补质粒pczb1
‑
arca电转化进slt36，pczb1
‑
fnr电转化进入slt35， pczb1
‑
flic电转入slt38，构建相应的回补株。
[0074]
类似的，首先利用引物对fnr
‑
f/fnr
‑
r、arca
‑
f/arca
‑
r和flic
‑
f/flic
‑
r分别扩增出 fnr、arca和flic的片段。然后将扩增产物利用dna回收试剂盒提纯之后进行noti
‑
hf和hind
ⅲ‑
hf的双酶切，同时质粒pczb1也用相同的酶进行酶切。然后将酶切后的片段和质粒进行dna回收之后利用t4连接酶进行连接，构建回补质粒pcz23,pcz24和pcz25，分别对 fnr、arca和flic的缺失株进行回补，其结果如图5所示，
[0075]
图6为回补株的运动表型鉴定，从图6中可以看出，缺失株的运动能力均出现明显下降，但回补后运动能力恢复至与野生株无明显差异。
[0076]
实施例2
[0077]
减毒鼠伤寒沙门菌的免疫保护效应测定
[0078]
2.1突变株的毒力(半数致死量，ld
50
)测定
[0079]
为了确保所构建疫苗株的安全性，在balb/c小鼠上测定了各菌株的ld
50
。将atcc14028、 slt35(δfnr)、slt36(δarca)、slt37(δfnrδarca)、slt38(δflic)和slt39(δfnr δarcaδflic)经口接种7周龄balb/c小鼠，感染剂量为104‑
109cfu，如表3所示。攻毒后记录动物死亡情况，按照reed/muench法计算半数致死量。如表3所示，野生株 atcc14028的ld
50
为1.9
×
105cfu，slt35和slt38的ld
50
分别为2.1
×
106cfu和3.3
×
10
6 cfu，只有10倍左右的减毒，slt39的ld
50
为2.9
×
109cfu，较野生株有104倍的减毒，而其他缺失株的ld
50
与野生株的差异不明显。其中slt39相较于其他菌株来说是安全的，可用于免疫保护评价。
[0080]
表3.各疫苗株半数致死量的测定
[0081][0082]
2.2缺失株定殖能力的检测
[0083]
将7周龄balb/c小鼠18只，随机分成6组，分别口服感染约1
×
109cfu的野生株 atcc14028和5株缺失株slt35、slt36、slt37、slt38和slt39，感染5天后取小鼠的脾脏、肝脏和派尔氏淋巴结(peyer’s patches，pps)，称量后加入pbs进行研磨，对组织悬液适当稀释后滴于lb固体培养基上进行菌落计数。缺失株的定殖水平按照每克组织含菌落数(cfu/g)进行计算，如图7所示。结果显示，slt36和slt38与野生株的定殖水平相当，但slt35、slt37和slt39的定殖水平较野生株都明显降低，其中slt39的定殖水平最低。结合缺失株的毒力以及定殖能力结果显示，slt39的毒力高度减弱并且也能保持一定但相对较低的定殖水平，因此可以作为候选疫苗株进行免疫保护评估。
[0084]
2.3减毒鼠伤寒沙门菌的免疫原性与免疫保护评价
[0085]
1)抗体水平检测
[0086]
购买6周龄balb/c小鼠，随机分为每组25只，饲养一周适应环境后对其免疫接种。免疫组小鼠分别口服108或107cfu的slt39，免疫对照组口服109cfu的slt04(δcrp)，空白对照组口服20μl的pbs。第一次免疫后28天进行同剂量同途径的第二次免疫。每次免疫后21天采集血清、粪便、盲肠和小肠(十二指肠)的冲洗液，通过elisa方法检测针对沙门菌的血清抗体igg、igg1和igg2a以及黏膜抗体iga。如图8a
‑
c所示，相较于pbs 组，slt39的免疫组和slt04的免疫组在两次免疫后均可诱导显著水平的总igg和igg2a，而抗体igg1水平仅在第二次免疫后在三个免疫组中有明显的升高。另外在第二次的加强免疫后，slt39的两个不同浓度的免疫组所诱导的抗体水平相当，且与免疫对照组slt04也类似，除低剂量的slt39免疫组的亚型抗体igg1的水平略低于slt04外。再者，如图8d，各免疫组在两次免疫后的抗体igg2a/igg1的比例均大于2，预示slt39主要可诱导宿主产生 th1型免疫反应。其次，如图10所示，在二次加强免疫后，slt39以及slt04均可诱导显著水平的iga反应，无论是在粪便、盲肠或十二指肠中，并且在粪便中检测到的slt04以及slt39的两个免疫组的iga水平是相当的。但是，在三个免疫组中，盲肠以及十二指肠黏膜的iga抗体水平在低剂量的slt39免疫组中是最高的。以上结果显示slt39以不同剂量免疫小鼠后均可诱导高水平的血清抗体反应和黏膜免疫反应。
[0087]
需要说明的是，本实施例的slt04(δcrp)，是已知的源于atcc14028野生株的crp缺失株，crp可编码一种全局调控蛋白
‑
环腺嘌呤受体蛋白，它与沙门菌的毒力岛基因的表达并且与细菌的多重耐药相关；crp基因已被证明可作为减毒活疫苗的靶向基因，该基因的缺失可实现大幅度的减毒并且可以诱导宿主产生明显的免疫反应。
[0088]
2)免疫保护效力
[0089]
加强免疫后1个月，用100
×
ld
50
即5
×
107cfu的鼠伤寒沙门菌强毒株atcc14028对各免疫组小鼠进行口服挑战接种，然后记录攻毒后各组小鼠的死亡情况，并在攻毒后6天采集幸存小鼠的pps、脾脏和肝脏检测组织中的攻毒细菌载量。如图9所示，与pbs对照组相比，slt39的两不同剂量免疫组与slt04免疫组类似，在pps、脾脏和肝脏中的细菌载量均明显降低。同时，如表4所示，经鼠伤寒沙门菌强毒株atcc14028攻毒后，pbs组小鼠全部死亡，高剂量slt39免疫组和slt04免疫组的小鼠全部存活，即100％的保护率，低剂量slt39 免疫组的小鼠有8只存活，保护率为80％。这表明本申请构建的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗以 108cfu进行免疫可以用以预防鼠伤寒沙门菌。
[0090]
表4.疫苗株针对鼠伤寒沙门菌野毒株的免疫保护效力
[0091][0092]
综上，本申请利用自杀质粒pre112介导的同源重组法构建了5株鼠伤寒沙门菌缺失株，并通过ld
50
与定殖能力的检测对缺失株的毒力进行评估之后筛选出减毒候选疫苗株slt39 (δfnrδarcaδflic)。然后基于balb/c小鼠的免疫保护实验证实，slt39能够诱导较高水平的血清特异性抗体反应和黏膜免疫反应，并且也能对组织中定殖的攻毒菌进行一定的清除。再者，针对鼠伤寒沙门菌的致死攻毒挑战，107cfu免疫剂量的slt39可提供的80％的保护率，而108cfu免疫剂量的slt39可提供100％的保护率。这表明本申请构建的减毒鼠伤寒沙门菌slt39可以用以预防鼠伤寒沙门菌的感染，也为沙门菌作为载体疫苗奠定了理论基础。
[0093]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。