一种硫酸新霉素的发酵工艺的制作方法

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种硫酸新霉素的发酵工艺。


背景技术：

[0002]
近年来，新霉素被作为一种饲料添加剂广泛应用。由于国内外饲料添加剂的使用量大，应用范围广，展示了很好的前景。近几年国内外市场对新霉素的需求有大幅度增长的趋势。开发新霉素，提高生产水平，具有广阔的市场前景和显著的经济效益。
[0003]
目前，由于国内外新霉素发酵主要追求发酵水平的提高，而不考虑发酵过程糖类物质的单耗和放罐时残糖浓度的控制，从而造成了新霉素发酵过程带来的污染物排放的居高不下，其中放罐残糖浓度有时可达到3-3.5％以上。这类生产工艺的是一个粗放的、基质浓度大幅度变化的工艺，导致发酵过程营养物质不能实施按需供给，扰乱了微生物的正常代谢，造成了生产效率的低下(产物新霉素浓度低)和原材料的浪费(初始配方和补料液组成不合理，补料过多，放罐残糖浓度过高)这不仅增加了生产成本，降低了产率，而且造成了排放物对环境的污染。同时，高浓度的总糖和间歇补料的冲击造成了菌体生长的不正常，同时由于氨氮浓度的粗放控制，影响了产物的生成，产抗期的产物浓度增长速率较低，最终产物浓度低。传统工艺十分强调大量补糖的必要性。盲目的大量补加淀粉水解糖液，导致在产物合成期，仍存在多次菌体大量增殖的过程，降低了产物合成速率。同时，由于微生物不能利用多糖，生物反应器中累积了大量微生物不可利用的多糖，该部分多糖随废水排放，造成环境的污染和资源的浪费。
[0004]
针对上述问题，本发明通过对种子培养基、发酵培养基和补糖料的优化，提供了一种硫酸新霉素的发酵工艺。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种硫酸新霉素的发酵工艺，至少包括以下步骤：
[0006]
(1)斜面培养基配制：斜面培养基灭菌后，趁热摇匀，铺成斜面，于28
±
0.5℃下培养1-5天，检查无菌后备用，得斜面培养基；
[0007]
(2)斜面接种：将砂土孢子溶于无菌水，均匀涂布在斜面培养基上，于28
±
0.5℃下培养5-10天，并置于1-8℃下保存备用，得斜面孢子；
[0008]
(3)孢子悬液制备：向斜面孢子中加入玻璃珠，振摇打下孢子；然后加入无菌水摇匀，密封置于1-8℃下保存备用，得孢子悬液；
[0009]
(4)种子罐培养：将孢子悬液接种到种子罐中的种子培养基上，然后开启搅拌，并通入无菌空气，培养30-50h，得培养液；
[0010]
(5)发酵罐培养：将培养液接入发酵罐中的发酵培养基上，开启搅拌，通入无菌空气，并定时检测，发酵培养200-260h后放罐，即得。
[0011]
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述斜面培养基的制备原料，按重
量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖0.5-2％、牛肉膏0.01-0.5％、蛋白胨0.1-0.5％、玉米浆0.01-0.3％、氯化钠0.1-1％、琼脂1-5％、水补足余量。
[0012]
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(4)中，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1-4％、玉米浆0.5-2％、蛋白胨0.1-1％、玉米淀粉0.5-2％、花生饼粉0.5-2％、酵母膏1-3％、豆油0.1-1％、碳酸钙1-2％、硫酸铵0.05-0.3％、磷酸氢二钠0.05-0.3％、水补足余量。
[0013]
作为本发明一种优选的技术方案，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1％、花生饼粉0.5％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0014]
作为本发明一种优选的技术方案，所述种子培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
(1)向种子罐中加至少一半的水，然后加入葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、玉米淀粉、花生饼粉、酵母膏、硫酸铵、磷酸氢二钠，搅拌均匀，并用碱调节ph值为7-8；
[0016]
(2)加入碳酸钙，用剩余的水冲洗罐壁；然后加入豆油，关闭罐盖；
[0017]
(3)将种子罐加热至115-130℃，控制罐内压力为0.1-0.15mpa，保温20-50min，进行灭菌；
[0018]
(4)灭菌结束后，向罐内通入无菌空气，并将种子罐冷却至30-40℃，即得。
[0019]
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(5)中，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1-3％、玉米浆0.05-0.3％、蛋白胨0.5-2％、籼米粉6-8％、花生饼粉1.5-3.5％、黄豆饼粉0.1-1％、酵母膏0.5-2％、豆油0.05-0.2％、氯化钠0.4-0.5％、碳酸钙0.3-0.7％、硫酸铵0.3-0.8％、淀粉酶0.01-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、磷酸二氢钠0.01-0.1％、水补足余量。
[0020]
作为本发明一种优选的技术方案，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆3％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏1％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0021]
作为本发明一种优选的技术方案，所述发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0022]
(1)向发酵罐中加入至少1/4的水，然后加入籼米粉和淀粉酶，加热至55-70℃，搅拌10-40min；
[0023]
(2)向发酵罐中加入黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、氯化钠、碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，并加入剩余的水，搅拌均匀；然后加入豆油，关闭罐盖；
[0024]
(3)将发酵罐加热至115-130℃，控制罐内压力为0.1-0.15mpa，保温20-50min，进行灭菌；
[0025]
(4)灭菌结束后，向罐内通入无菌空气，并将发酵罐冷却至30-40℃，即得。
[0026]
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(5)中，所述发酵培养过程中，还原糖的重量比维持在0.5-3％之间，氨氮含量控制在4-25mg/ml之间。
[0027]
本发明的第二个方面提供了一种硫酸新霉素，根据上述的硫酸新霉素的发酵工艺制得。
[0028]
有益效果
[0029]
本发明提供了一种硫酸新霉素的发酵方法，首先，通过对种子培养基物料的复配和优化，提高种子菌浓；其次，通过对发酵培养基物料的复配和优化，提高发酵所得硫酸新霉素的效价；最后，通过对补料的复配和优选，避免了糖浓度突然过高造成生长波动，同时也可以降低镁离子和锌离子无机盐的浓度过高抑制产物合成的问题。
具体实施方式
[0030]
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
[0031]
如本文所用术语“由
…
制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0032]
连接词“由
…
组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由
…
组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
[0033]
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0034]
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0035]
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
[0036]
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种硫酸新霉素的发酵工艺，至少包括以下步骤：
[0037]
(1)斜面培养基配制：斜面培养基灭菌后，趁热摇匀，铺成斜面，于28
±
0.5℃下培养1-5天，检查无菌后备用，得斜面培养基；
[0038]
(2)斜面接种：将砂土孢子溶于无菌水，均匀涂布在斜面培养基上，于28
±
0.5℃下培养5-10天，并置于1-8℃下保存备用，得斜面孢子；
[0039]
(3)孢子悬液制备：向斜面孢子中加入玻璃珠，振摇打下孢子；然后将加入无菌水摇匀，密封置于1-8℃下保存备用，得孢子悬液；
[0040]
(4)种子罐培养：将孢子悬液接种到种子罐中的种子培养基上，然后开启搅拌，并通入无菌空气，培养30-50h，得培养液；
[0041]
(5)发酵罐培养：将培养液接入发酵罐中的发酵培养基上，开启搅拌，通入无菌空气，并定时检测，发酵培养200-260h后放罐，即得。
[0042]
斜面培养基配制
[0043]
本发明中，下面培养基配制为：斜面培养基配制：斜面培养基灭菌后，趁热摇匀，铺成斜面，于28
±
0.5℃下培养1-5天，检查无菌后备用，得斜面培养基。
[0044]
在一种优选的实施方式中，所述斜面培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖0.5-2％、牛肉膏0.01-0.5％、蛋白胨0.1-0.5％、玉米浆0.01-0.3％、氯化钠0.1-1％、琼脂1-5％、水补足余量。
[0045]
在一种更优选的实施方式中，所述斜面培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1％、牛肉膏0.25％、蛋白胨0.3％、玉米浆0.18％、氯化钠0.4％、琼脂2.6％、水补足余量。
[0046]
在一种优选的实施方式中，所述斜面培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0047]
(1)将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、氯化钠、琼脂和水混合均匀，然后用碱调节ph至7-8后，分装，密封；
[0048]
(2)用0.10-0.15mpa、温度110-130℃蒸汽灭菌10-50min，即得。
[0049]
在一种优选的实施方式中，所述碱，没有特别的限制，可提及氢氧化钾、氢氧化钠等。
[0050]
在一种优选的实施方式中，所述ph调节至7.5-7.6。
[0051]
斜面接种
[0052]
本发明中，斜面接种为：将砂土孢子溶于无菌水，均匀涂布在斜面培养基上，于28
±
0.5℃下培养5-10天，并置于1-8℃下保存备用，得斜面孢子；
[0053]
在一种优选的实施方式中，所述接种培养时间为6-8天。
[0054]
在一种优选的实施方式中，所述保存温度为4
±
2℃。
[0055]
在一种优选的实施方式中，所述斜面孢子的保存期为60天。
[0056]
孢子悬液制备
[0057]
本发明中，所述孢子悬液制备为：向斜面孢子中加入玻璃珠，振摇打下孢子；然后加入无菌水，摇匀，密封，置于1-8℃下保存备用，得孢子悬液。
[0058]
在一种优选的实施方式中，所述孢子悬液的制备为：取斜面孢子，在接种室内加入玻璃珠，振摇打下孢子，然后加入无菌水，摇匀，密封，置于2-6℃冰箱中保存备用。
[0059]
在一种优选的实施方式中，所述孢子悬液的保质期为24h。
[0060]
种子罐培养
[0061]
本发明中，所述种子罐培养为：将孢子悬液接种到种子罐中的种子培养基上，然后开启搅拌，并通入无菌空气，培养30-50h，得培养液。
[0062]
在一种优选的实施方式中，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1-4％、玉米浆0.5-2％、蛋白胨0.1-1％、玉米淀粉0.5-2％、花生饼粉0.5-2％、酵母膏1-3％、豆油0.1-1％、碳酸钙1-2％、硫酸铵0.05-0.3％、磷酸氢二钠0.05-0.3％，水补足余量。
[0063]
在一种更优选的实施方式中，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1％、花生饼粉0.5％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0064]
在一种优选的实施方式中，所述种子培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0065]
(1)向种子罐中加至少一半的水，然后加入葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、玉米淀粉、花生饼粉、酵母膏、硫酸铵、磷酸氢二钠，搅拌均匀，并用碱调节ph值为7-8；
[0066]
(2)加入碳酸钙，用剩余的水冲洗罐壁；然后加入豆油，关闭罐盖；
[0067]
(3)将种子罐加热至115-130℃，控制罐内压力为0.1-0.15mpa，保温20-50min，进行灭菌；
[0068]
(4)灭菌结束后，向罐内通入无菌空气，并将种子罐冷却至30-40℃，即得。
[0069]
在一种更优选的实施方式中，所述碱，没有特别的限制，可提及氢氧化钠、氢氧化钾等。
[0070]
在一种更优选的实施方式中，所述ph值为7.5
±
0.1。
[0071]
在一种优选的实施方式中，所述灭菌过程中，种子罐的加热温度为121
±
2℃。
[0072]
在一种更优选的实施方式中，所述灭菌过程中，所述种子罐内的压力为0.11
±
0.1mpa。
[0073]
本发明在原有培养基配比基础上，采用正交实验，对培养基的碳氮比例进行优化，以菌浓为指标，得出各个物料的最优水平。通过多次平行正交实验，结果分析表明，种子菌浓影响主次顺序为：葡萄糖＞酵母膏＞硫酸铵＞玉米浆＞花生饼粉＞玉米淀粉＞蛋白胨。然而发明人却意外发现，虽然葡萄糖对菌浓的影响最大，但是本体系中，减少葡萄糖用量，同时提高酵母膏的用量，反而能够提高菌浓，并确定最佳组合为玉米浆1.0％，蛋白胨0.3％，酵母膏3.0％，花生饼粉0.5％，玉米淀粉1.0％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.1％，碳酸钙1.4％、磷酸二氢钠0.1％，豆油1％、水补足余量。发明人认为可能的原因是，种子培养基物料相对较少，接种完毕后，前期需要快速消耗易消耗的有机糖、氮源类物质，在发酵生产前期快速生长繁殖，本体系对种子培养基的优化控制与调整中，减少碳源类物料如葡萄糖，而增加少部分有机速效氮源类物料，如酵母膏和蛋白胨后，种子生长更加迅速，通过补料来供给持续生长代谢，提高生产水平，降低生产成本。经测试，本发明利用最佳组合进行种子摇瓶培养，种子菌浓可达到36.0％。本体系种子培养基物料的优化，不仅简化了配料的操作，提高了配料的效率，降低了配料出现差错的风险，说明通过减少配方中原材料中葡萄糖的含量，不会降低菌浓。
[0074]
发酵罐培养
[0075]
本发明中，所述发酵罐培养为：将培养液接入发酵罐中的发酵培养基上，开启搅拌，通入无菌空气，并定时检测，发酵培养200-260h后放罐，即得。
[0076]
在一种优选的实施方式中，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1-3％、玉米浆0.05-0.3％、蛋白胨0.5-2％、籼米粉6-8％、花生饼粉1.5-3.5％、黄豆饼粉0.1-1％、酵母膏0.5-2％、豆油0.05-0.2％、氯化钠0.4-0.5％、碳酸钙0.3-0.7％、硫酸铵0.3-0.8％、淀粉酶0.01-0.05％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、磷酸二氢钠0.01-0.1％、水补足余量。
[0077]
在一种优选的实施方式中，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包
括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆3％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏1％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0078]
在一种优选的实施方式中，所述发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0079]
(1)向发酵罐中加入至少1/4的水，然后加入籼米粉和淀粉酶，加热至55-70℃，搅拌10-40min；
[0080]
(2)向发酵罐中加入黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、氯化钠、碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，并加入剩余的水，搅拌均匀；然后加入豆油，关闭罐盖；
[0081]
(3)将发酵罐加热至115-130℃，控制罐内压力为0.1-0.15mpa，保温20-50min，进行灭菌；
[0082]
(4)灭菌结束后，向罐内通入无菌空气，并将发酵罐冷却至30-40℃，即得。
[0083]
在一种优选的实施方式中，所述灭菌过程中，发酵罐的加热温度为121
±
2℃。
[0084]
在一种更优选的实施方式中，所述灭菌过程中，所述发酵罐内的压力为0.11
±
0.1mpa。
[0085]
本发明中，将培养液接入发酵罐中的方法，没有特别的限制，可利用压差将培养液接入发酵罐。
[0086]
在一种优选的实施方式中，所述无菌气的流量为15-30l/min。
[0087]
在一种优选的实施方式中，所述发酵罐罐压为0.04-0.06mpa。
[0088]
在一种优选的实施方式中，所述发酵罐温度为35
±
1℃。
[0089]
在一种优选的实施方式中，所述发酵过程中，每6小时记录ph值、粘度、罐温、罐压、空气流量、搅拌转速；取样检测罐内还原糖、总糖、氨氮的量，并进行无菌检查。
[0090]
在一种优选的实施方式中，所述发酵第4天开始每24h检测一次生物效价。
[0091]
本发明中，发明人通过正交试验对发酵培养基的配料进行优化调整，其发酵产量为对照组128％，生物效价13058u/ml。另外，发明人意外发现，本发明培养基的制备原料均添加一定量的豆油，有利于罐内发酵液的消泡。发明人认为可能的原因是，发酵生产过程极易产生泡沫，泡沫会降低发酵液中的溶解氧，影响菌丝的正常代谢，也会降低发酵罐的装料系数，减少放罐体积，从而降低罐批产量。因此，控制好泡沫是提高发酵水平的重要环节。正常情况下，发酵常使用消泡剂来消除泡沫。然而，消泡剂价格昂贵，用量过多还会对发酵产生副作用。本发明中，直接添加玉米浆和豆油两种组分，含油量较多，它在提供有机碳/氮源的同时，还能提供一定量的植物油，对发酵液起到抑泡的作用，有效地增大放罐体积。
[0092]
本发明中，所述发酵培养过程中，还原糖的重量比维持在0.5-3％之间，氨氮含量控制在4-25mg/ml之间。
[0093]
在一种优选的实施方式中，根据还原糖和氨氮的利用情况，须及时补入一定量的糖和氨氮，即称为糖补料和氮补料，以保持还原糖和氨氮的量在工艺要求范围内，放罐前6-20h停止补糖。
[0094]
在一种优选的实施方式中，所述糖补料，按重量百分比计，至少包括以下组分：籼米粉15-25％、葡萄糖15-35％、硫酸锌0.01-0.1％、0.05-0.5％硫酸镁、水补足余量。
[0095]
在一种更优选的实施方式中，所述糖补料，按重量百分比计，至少包括以下组分：
籼米粉20％、葡萄糖20％、硫酸锌0.05％、0.2％硫酸镁、水补足余量。
[0096]
在一种优选的实施方式中，所述氮补料为硫酸铵。
[0097]
在一种更优选的实施方式中，所述补料采用流加的方式进行；所述第一次补料为发酵后60-100h，放罐前6-20h停止补糖。
[0098]
发明人认为，传统发酵工艺采用淀粉类多糖和葡萄糖作为碳源补充，淀粉类多糖的优点是价格低廉，但是高浓度的料液会增加操作难度，粘稠度高，灭菌难彻底；而葡萄糖作为速效碳源，纯葡萄糖补料会造成ph波动，影响菌体代谢。而本发明采用复合补料的方式能够较好的解决上述技术问题，尤其是发酵开始80h后开始流加补料，能够显著促进发酵和新霉素的合成。发明人认为可能的原因是，发酵80h流加补料可快速作用于新霉素合成途径的酶系，快速实现新霉素c向新霉素b的合成；若提前加入会导致菌丝生长受到影响，降低效价；延后加入会降低营养剂的作用效果，新霉素c向新霉素b的转化率会降低，达不到作用效果。同时，本发明发酵培养基具备种子生长良好的营养条件，如果直接加入到培养基中会使前期培养基成分发生改变，不利于发酵前期种子的快速生长，会对前期种子的生长代谢产生不利影响，从而导致发酵效价比较低，因此必须采用流加，否则无法实现效价的提高。其次，本发明控制的每次流加补料的量为150-250ml，优选200ml，流加量过高会影响菌体代谢，过小会降低转化率，达不到作用效果。
[0099]
发明人在试验过程中还发现，镁离子可提高氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产抗生素的耐受能力，提高抗生素的产量，然而镁离子在碱性溶液中会形成沉淀，所以在配料中直接添加镁离子易造成损失；锌离子是链霉菌发酵的必须微量元素，低浓度可促进菌丝生长和抗生素的合成，高浓度则抑制抗生素合成。因此，本发明补料方式采用少量多次的方式，可以避免糖浓度突然过高造成生长波动，同时也可以降低镁离子和锌离子无机盐的浓度过高抑制产物合成。另外，本发明必须控制流加物质的用量比例，用量比例改变都会影响发酵液效价、新霉素b和c的含量，用量多一是会造成营养物质饱和效价不会再提高，二是会造成抑制、阻遏作用，发酵液效价不仅不会提高反而会下降；用量少，发酵液效价无法提高或者提高幅度很小，因而严格控制用量比例至关重要。
[0100]
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0101]
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
[0102]
实施例
[0103]
实施例1
[0104]
实施例1提供了一种硫酸新霉素的发酵工艺，至少包括以下步骤：
[0105]
(1)斜面培养基配制：斜面培养基灭菌后，趁热摇匀，铺成斜面，于28
±
0.5℃下培养3天，检查无菌后备用，得斜面培养基；
[0106]
所述斜面培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、牛肉膏0.25％、蛋白胨0.3％、玉米浆0.18％、氯化钠0.4％、琼脂2.6％、水补足余量；
[0107]
所述斜面培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0108]
(a)将葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、氯化钠、琼脂和水混合均匀，然后用氢氧化钠调节ph至7.5后，分装，密封；
[0109]
(b)用0.15mpa、温度120℃蒸汽灭菌30min，即得；
[0110]
(2)斜面接种：将砂土孢子溶于无菌水，均匀涂布在斜面培养基上，于28
±
0.5℃下培养7天，并置于4℃下保存备用，得斜面孢子；
[0111]
(3)孢子悬液制备：向斜面孢子中加入玻璃珠，振摇打下孢子；然后将加入无菌水摇匀，密封置于1-8℃下保存备用，得孢子悬液；
[0112]
所述孢子悬液的制备为：取斜面孢子，在接种室内加入玻璃珠，振摇打下孢子，然后加入适量无菌水，摇匀，密封，置于4℃冰箱中保存备用；
[0113]
(4)种子罐培养：将孢子悬液接种到种子罐中的种子培养基上，然后开启搅拌，并通入无菌空气，培养40h，得培养液；
[0114]
所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1％、花生饼粉0.5％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量；
[0115]
所述种子培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0116]
(a)向种子罐中加至少一半的水，然后加入葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、玉米淀粉、花生饼粉、酵母膏、硫酸铵、磷酸氢二钠，搅拌均匀，并用氢氧化钠调节ph值为7.5
±
0.1；
[0117]
(b)加入碳酸钙，用剩余的水冲洗罐壁；然后加入豆油，关闭罐盖；
[0118]
(c)将种子罐加热至122℃，控制罐内压力为0.12mpa，保温30min，进行灭菌；
[0119]
(d)灭菌结束后，向罐内通入无菌空气，并将种子罐冷却至350℃，即得；
[0120]
(5)发酵罐培养：将培养液接入发酵罐中的发酵培养基上，开启搅拌，通入无菌空气，并定时检测，发酵培养250h后放罐，即得；
[0121]
所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆3％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏1％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量；
[0122]
所述发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0123]
(1)向发酵罐中加入至少1/4的水，然后加入籼米粉和淀粉酶，加热至60℃，搅拌20min；
[0124]
(2)向发酵罐中加入黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、氯化钠、碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，并加入剩余的水，搅拌均匀；然后加入豆油，关闭罐盖；
[0125]
(3)将发酵罐加热至122℃，控制罐内压力为0.12mpa，保温30min，进行灭菌；
[0126]
(4)灭菌结束后，向罐内通入无菌空气，并将发酵罐冷却至35℃，即得；
[0127]
所述发酵培养过程中，还原糖的重量比维持在0.5-3％之间，氨氮含量控制在4-25mg/ml之间；根据还原糖和氨氮的利用情况，须及时补入一定量的糖和氨氮，即称为糖补料和氮补料，以保持还原糖和氨氮的量在工艺要求范围内，放罐前6-20h停止补糖；所述补料采用流加的方式进行；所述第一次补料为发酵后80h；
[0128]
所述糖补料，按重量百分比计，包括以下组分：籼米粉20％、葡萄糖20％、硫酸锌0.05％、0.2％硫酸镁、水补足余量；所述氮补料为硫酸铵溶液。
[0129]
实施例2
[0130]
实施例2与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉0.5％、花生饼粉0.5％、酵母膏1.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0131]
实施例3
[0132]
实施例3与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.5％、蛋白胨0.5％、玉米淀粉1.0％、花生饼粉1.0％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0133]
实施例4
[0134]
实施例4与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.5％、蛋白胨0.7％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉1.5％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.15％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0135]
实施例5
[0136]
实施例5与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1.0％、花生饼粉1.0％、酵母膏1.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.15％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0137]
实施例6
[0138]
实施例6与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1.0％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.5％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉1.5％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0139]
实施例7
[0140]
实施例7与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖2.0％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.7％、玉米淀粉0.5％、花生饼粉0.5％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0141]
实施例8
[0142]
实施例8与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖2.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉0.5％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.15％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0143]
实施例9
[0144]
实施例9与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖3.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉0.5％、花生饼粉1.0％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0145]
实施例10
[0146]
实施例10与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.7％、玉米淀粉1.0％、花生饼粉1.5％、酵母膏1.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0147]
实施例11
[0148]
实施例11与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖2.0％、玉米浆0.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1.0％、花生饼粉1.5％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0149]
实施例12
[0150]
实施例12与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖3.0％、玉米浆0.5％、蛋白胨0.5％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉0.5％、酵母膏1.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0151]
实施例13
[0152]
实施例13与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1.0％、玉米浆0.5％、蛋白胨0.7％、玉米淀粉0.5％、花生饼粉1.0％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.15％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0153]
实施例14
[0154]
实施例14与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖3.0％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉0.5％、花生饼粉1.5％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0155]
实施例15
[0156]
实施例15与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖2.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉0.5％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.15％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0157]
实施例16
[0158]
实施例16与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖2.0％、玉米浆1.0％、蛋白胨0.7％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉1.0％、酵母膏1.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0159]
实施例17
[0160]
实施例17与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉1.0％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0161]
实施例18
[0162]
实施例18与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖1.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.3％、玉米淀粉1.5％、花生饼粉1.0％、酵母膏3.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.1％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余量。
[0163]
实施例19
[0164]
实施例19与实施例1的区别在于，所述种子培养基的制备原料，按重量百分比计，至少包括以下组分：葡萄糖3.0％、玉米浆1.5％、蛋白胨0.7％、玉米淀粉1.0％、花生饼粉0.5％、酵母膏2.0％、豆油1％、碳酸钙1.4％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钠0.1％，水补足余
量。
[0165]
实施例20
[0166]
实施例20与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.1％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.4％、黄豆饼粉0.3％、酵母膏3％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0167]
实施例21
[0168]
实施例21与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.1％、蛋白胨1％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.5％、酵母膏4％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.6％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0169]
实施例22
[0170]
实施例22与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.1％、蛋白胨1.5％、籼米粉7％、花生饼粉3.2％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏5％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.8％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0171]
实施例23
[0172]
实施例23与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.2％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.4％、黄豆饼粉0.5％、酵母膏3％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.8％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0173]
实施例24
[0174]
实施例24与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.2％、蛋白胨1％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏4％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0175]
实施例25
[0176]
实施例25与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.2％、蛋白胨1.5％、籼米粉7％、花生饼粉3.2％、黄豆饼粉0.3％、酵母膏5％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.6％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0177]
实施例26
[0178]
实施例26与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.3％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.4％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏3％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.8％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0179]
实施例27
[0180]
实施例27与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.3％、蛋白胨1％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉
0.3％、酵母膏4％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0181]
实施例28
[0182]
实施例28与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.3％、蛋白胨1.5％、籼米粉7％、花生饼粉3.2％、黄豆饼粉0.5％、酵母膏5％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.6％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0183]
实施例29
[0184]
实施例29与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.1％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉3.2％、黄豆饼粉0.5％、酵母膏3％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0185]
实施例30
[0186]
实施例30与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.1％、蛋白胨1％、籼米粉7％、花生饼粉2.4％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏4％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.6％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0187]
实施例31
[0188]
实施例31与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.1％、蛋白胨1.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.3％、酵母膏5％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.8％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0189]
实施例32
[0190]
实施例32与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.2％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉3.2％、黄豆饼粉0.3％、酵母膏3％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.6％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0191]
实施例33
[0192]
实施例33与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.2％、蛋白胨1％、籼米粉7％、花生饼粉2.4％、黄豆饼粉0.5％、酵母膏4％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.8％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0193]
实施例34
[0194]
实施例34与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.2％、蛋白胨1.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏5％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0195]
实施例35
[0196]
实施例35与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，
包括以下组分：葡萄糖1％、玉米浆0.3％、蛋白胨0.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.8％、黄豆饼粉0.8％、酵母膏3％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.6％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0197]
实施例36
[0198]
实施例36与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖2％、玉米浆0.3％、蛋白胨1％、籼米粉7％、花生饼粉3.2％、黄豆饼粉0.3％、酵母膏4％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.8％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0199]
实施例37
[0200]
实施例37与实施例1的区别在于，所述发酵培养基的制备原料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖3％、玉米浆0.3％、蛋白胨1.5％、籼米粉7％、花生饼粉2.4％、黄豆饼粉0.5％、酵母膏5％、豆油0.2％、氯化钠0.45％、碳酸钙0.5％、硫酸铵0.4％、淀粉酶0.03％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸二氢钠0.05％、水补足余量。
[0201]
实施例38
[0202]
实施例38与实施例1的区别在于，所述糖补料，按重量百分比计，包括以下组分：籼米粉20％、玉米淀粉20％、水补足余量。
[0203]
实施例39
[0204]
实施例39与实施例1的区别在于，所述糖补料，按重量百分比计，包括以下组分：葡萄糖40％、水补足余量。
[0205]
性能测试
[0206]
1.菌浓测试
[0207]
原理：通过检测一定量培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
[0208]
方法：取供试品约30ml，置50ml量筒中，加入一滴消泡剂，记录取样体积(v)。置于离心机中，5000rpm，离心5分钟，取出离心管，到处上清液至50ml量筒中，记录体积(v1)。
[0209]
计算：菌浓＝(v-v1)/v*100％；
[0210]
v：所取待测培养液的体积，ml；
[0211]
v1：离心上清液的体积，ml。
[0212]
实施例1-19测试种子罐培养后培养液的菌浓。
[0213]
2.效价测试(生物检定法)
[0214]
检菌：为金黄色葡萄球菌[cmcc(b)26 003]。
[0215]
菌液制备：试管斜面临用时，用5ml 0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下。
[0216]
双碟平板的制备：配制底层培养基抗生素检定培养基ⅱ号110ml，上层60ml，摇匀，至115℃灭菌30分钟。灭菌后趁热在已灭菌的玻璃平板上倒入下层，冷却。上层培养基置水浴锅冷却至48℃～50℃时，加入金黄色葡萄球菌的斜面菌悬液0.1ml，混匀后立即倒入玻璃平板上，使其均匀铺满整个平板。在冷却后的上层培养基上，均匀放上无菌的干燥牛津杯。每板六排七列，共42个牛津杯。
[0217]
中间体：取发酵液用草酸酸化至ph＝3左右，离心沉淀，吸取上层液用含3％nacl ph＝7.8磷酸盐缓冲液根据估计效价稀释到10u/ml(dt1)、20u/ml(dt2)。
[0218]
标准品的稀释：精密称取标准品20～30mg，用含3％nacl ph＝7.8磷酸盐缓冲液稀
释成10u/ml(ds1)、20u/ml(ds2)。
[0219]
滴碟、培养与结果计算：将ds2、dt2、ds1、dt1分别加入牛津杯中，盖好盖板，置于35～37℃培养箱中培养14～16个小时。
[0220]
测量抑菌圈：用抑菌圈测量系统分别测量ds2、dt2、ds1、dt1的抑菌圈直径，准确至0.001mm，为消除边缘效应，周围一圈不计，只测量中间二十个抑菌圈的直径。
[0221]
相对效价计算：相对效价＝供试品抑菌圈直径/对照品抑菌圈直径x100％。
[0222]
效价计算：在电脑计算软件中分别输入ds2、dt2估计效价(at)，经计算后得出r值、pt值及fl％。r值应在0.9～1.1之间，同时fl％应不大于5％。否则应调正at后重新检验。
[0223]
实施例1、20-37计算发酵罐培养后发酵液的相对效价。实施例1、38-39计算放罐后发酵液的效价。实施例测试结果见表1；“/”表示未测试该项。
[0224]
表1.实施例性能测试结果
[0225]
[0226][0227]
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。