一种抗人EGFR的纳米抗体及应用的制作方法

一种抗人egfr的纳米抗体及应用
1.本申请是申请号为“201811129703.9”、发明名称为“抗人egfr的纳米抗体及其应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明属于生物技术领域，涉及一种抗人egfr的纳米抗体及应用。


背景技术：

3.癌症这一名词在公元前400多年就被提出，经过2000多年依然没有被攻克，如今对人类健康的威胁愈加明显。近年来，研究发现表皮生长因子(egfr)在多种实体瘤细胞中过表达，并且在癌症的发生、发展过程中发挥重要的作用，与预后差和耐药性正相关。egfr在癌细胞中过表达可导致egfr/egf信号通路的持续性激活，促进癌细胞的增殖、迁移及侵袭活动，并且还可以促进vegf因子的分泌，导致癌组织微环境血管形成。目前，靶向egfr的抗体在非小细胞肺癌的临床治疗取得了较好的效果，但由于是嵌合型抗体，所以存在一定的免疫源性，并且由于其分子量大渗透能力差，不能有效清除微小病灶。
4.纳米抗体(nanobody，nb)是一种只含有单个结构域的基因工程抗体，能够以高亲和力和特异性与抗原结合。纳米抗体由于抗体分子量小，便于在大肠杆菌中表达，大大降低了抗体生产的成本。同时，抗体结构简单，利于对其进一步改造。纳米抗体分子体积较小的特点也提高了抗体在疗中过程中的组织渗透能力。因此，抗egfr纳米抗体在egfr靶向的癌症治疗中，具有很高的医学应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人egfr的纳米抗体。
6.本发明的另一目的在于提供上述抗人egfr的纳米抗体的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗人egfr的纳米抗体，为名称为aeg2c7纳米抗体；或是名称为aeg2c7纳米抗体与名称为aeg1b4纳米抗体、aeg2e12纳米抗体、aeg4d9纳米抗体和aeg6b2纳米抗体中的至少一种组合形成的抗体；
8.所述的aeg1b4纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:1所示；
9.所述的aeg2c7纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:2所示；
10.所述的aeg2e12纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:3所示；
11.所述的aeg4d9纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:4所示；
12.所述的aeg6b2纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:5所示。
13.编码上述抗人egfr的纳米抗体的核苷酸序列，是编码所述的aeg2c7纳米抗体的核苷酸序列；或是编码所述的aeg2c7纳米抗体的核苷酸序列与编码所述的aeg1b4纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aeg2e12纳米抗体的核苷酸序列、编码所述的aeg4d9纳米抗体的核苷酸序列和编码所述的aeg6b2纳米抗体的核苷酸序列中的至少一种组合形成的核苷酸序
列。
14.编码所述的aeg1b4纳米抗体的核苷酸序列优选如seq id no:8所示。
15.编码所述的aeg2c7纳米抗体的核苷酸序列优选如seq id no:9所示。
16.编码所述的aeg2e12纳米抗体的核苷酸序列优选如seq id no:10所示。
17.编码所述的aeg4d9纳米抗体的核苷酸序列优选如seq id no:11所示。
18.编码所述的aeg6b2纳米抗体的核苷酸序列优选如seq id no:12所示。
19.编码所述的aeg1b4纳米抗体、aeg2c7纳米抗体、aeg2e12纳米抗体、aeg4d9纳米抗体和aeg6b2纳米抗体的核苷酸序列分别由375、393、375、381和372个碱基组成，对应编码的氨基酸分别为125、131、125、127和124个。aeg1b4抗体含有3个互补决定簇(cdr)，其中，编码cdr1的氨基酸为vnvsnevms，编码cdr2的氨基酸为tianhs，编码cdr3的氨基酸为tlysgatkqley。aeg2c7抗体含有3个互补决定簇，其中，编码cdr1的氨基酸为ftfnneima，编码cdr2的氨基酸为siaann，编码cdr3的氨基酸为ryaaephtysmgnkslry。aeg2e12抗体含有3个互补决定簇，其中，编码cdr1的氨基酸为yssnnefma，编码cdr2的氨基酸为aistrn，编码cdr3的氨基酸为gvsyrrpqqlky。aeg4d9抗体含有3个互补决定簇，其中，编码cdr1的氨基酸为dmlspdnmt，编码cdr2的氨基酸为tihktd，编码cdr3的氨基酸为glrsrglsskyley。aeg6b2抗体含有3个cdr，其中，编码cdr1的氨基酸为fnvnpkymt，编码cdr2的氨基酸为sirspg，编码cdr3的氨基酸为svsrdekymrf。
20.所述的抗人egfr纳米抗体含有相同的骨架区：编码fr1的氨基酸为maqvqllesggglvqpggslrlscaasg，编码fr2的氨基酸为wvrqapgkglewvs，编码fr3的氨基酸为gstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyyca，编码fr4的氨基酸为wgqgtlvtvssaaa。
21.所述的抗人egfr纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：通过基因(dna)合成的方法合成编码所述抗人egfr纳米抗体的核苷酸，然后将其克隆到表达质粒载体上，转化至宿主细胞中进行表达、纯化，得到抗人egfr纳米抗体；也可以通过多肽合成的方法，直接合成得到抗人egfr纳米抗体。
22.所述的抗人egfr纳米抗体在制备治疗egfr过表达为特征疾病的抗体药物中的应用。
23.所述的egfr过表达为特征的疾病为自身免疫病和癌症。
24.所述的癌症为egfr高表达肿瘤。
25.所述的egfr高表达肿瘤具体可为肺癌、头颈癌、结肠癌及脑肿瘤。
26.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
27.1.本发明通过噬菌体展示的方法在人源纳米抗体文库中筛选出的与egfr胞外部分结构域(domain)iii相互作用的纳米抗体可在无需使用抗原免疫人体的情况下获得全人源单克隆纳米抗体，其分子量约为13kda，只含有单个结构域，具有高度亲和力、特异性和低度致人免疫性，并且，结合蛋白高表达的原核宿主进行抗体表达，能显著降低抗体的生产成本，促进抗体的应用。
28.2.本发明提供的纳米抗体，具有稳定性好、易于改造，具有较好的组织渗透能力等优点。
29.3.本发明提供的纳米抗体是人源的，因而在人体无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤抗体药物的开发。
30.4.本发明提供的纳米抗体结合蛋白高表达的原核宿主进行抗体表达，能显著降低抗体的生产成本，促进抗体的应用。
附图说明
31.图1为多克隆elisa分析纳米抗体库的筛选富集结果图；其中，pbs孔为空白对照，egfr孔包被了合成的egfr多肽；一抗为各轮库筛选后扩增纯化获得的多克隆噬菌体抗体，二抗为hrp标记的抗噬菌体m13的抗体。
32.图2为单克隆噬菌体elisa筛选与egfr多肽结合的阳性克隆结果图；其中，每个单克隆包括：pbs(空白对照孔)，cxcr4多肽(无关抗原对照孔)，egfr多肽(目的抗原孔)。
33.图3为抗体蛋白表达纯化后sds-page蛋白电泳图；其中，图a是aeg1b4的电泳图，图b是aeg2c7的电泳图，图c是aeg2e12的电泳图，图d是aeg4d9的电泳图，图e是aeg6b2，图a-e中：泳道1是marker，泳道2是未诱导的全蛋白，泳道3是诱导的全蛋白，泳道4是诱导的破碎沉淀，泳道5是诱导的破碎上清，泳道6是过柱液蛋白，泳道7是洗杂液蛋白，泳道8-12均为洗脱蛋白管。
34.图4为采用elisa方法检测纯化的抗egfr纳米抗体与egfr多肽的结合情况图；其中，每个抗体包括空白对照孔pbs，7个无关抗原对照孔：vegf、camph、bmp2、endof1、fgf21、her2和cxcr4肽段，目的抗原孔：egfr多肽。
35.图5为采用western blotting方法检测纯化的抗egfr纳米抗体与egfr完整胞外段的结合情况图；其中，图a为aeg1b4，图b为aeg2c7，图c为aeg2e12，图d为aeg4d9，图e为aeg6b2，图a-e中：泳道1为蛋白marker，泳道2为egfr完整胞外段蛋白；一抗为纯化的抗egfr抗体，二抗为proteina-hrp。
36.图6为mtt法检测抗egfr纳米抗体对癌细胞增殖的影响结果图；其中，图a是纳米抗体对a549细胞增殖的影响结果图，图b是纳米抗体对mcf-7细胞增殖的影响结果图，图c是纳米抗体对du145细胞增殖的影响结果图；ave201和aher2-13c1作为阴性对照抗体；*：p<0.05vs 0μg/ml，**：p<0.01vs 0μg/ml(n＝3)。
37.图7为流式细胞仪及annexin v/pi双染色法检测纳米抗体对癌细胞凋亡的影响结果图；其中，图a、c、e分别是凋亡的a549、mcf-7和du145细胞的二维散点图，图b、d、f分别是从图a、c、e得到的凋亡比例；每种细胞包括无抗体对照组(control)，实验抗体组(50μg/ml)：aeg1b4、aeg2c7、aeg2e12、aeg4d9和aeg6b2，阴性对照抗体组(50μg/ml)：ave201和aher2-13c1；*：p<0.05vs control，**：p<0.01vs control(n＝3)。
38.图8为划痕愈合法检测纳米抗体对癌细胞迁移的结果照片图；其中，图a～c分别是a549、mcf-7和du145细胞0h和24h的迁移结果照片图。
39.图9是依据图8的划痕长度计算得出的迁移率结果图；其中，图a～c分别是a549、mcf-7和du145细胞；*：p<0.05vs 0μg/ml、**：p<0.01vs 0μg/ml(n＝3)。
40.图10为transwell法检测纳米抗体对癌细胞迁移的结果照片图；其中，图a～c分别是各浓度纳米抗体处理后的a549、mcf-7和du145细胞迁移结果照片图。
41.图11是依据图10得到的抗体吸光值变化趋势图；其中，图a～c分别是a549、mcf-7和du145细胞；*：p<0.05vs 0μg/ml、**：p<0.01vs 0μg/ml(n＝3)。
42.图12为transwell法检测纳米抗体对癌细胞侵袭的影响结果照片图；其中，图a～c
分别是各浓度纳米抗体处理后的a549、mcf-7和du145细胞的结果照片图。
43.图13是依据图12得到的抗体吸光值变化趋势图；其中，图a～c分别是a549、mcf-7和du145细胞；*：p<0.05vs 0μg/ml、**：p<0.01vs 0μg/ml(n＝3)。
44.图14为采用肺癌小鼠模型验证纳米抗体对肿瘤大小的抑制作用结果图；其中，图a是给药后肿瘤的体积变化曲线图，图b是给药周期结束时各组的肿瘤大小，图c是给药周期结束后各组的肿瘤重量；*：p<0.05vs 0μg/ml、**：p<0.01vs 0μg/ml(n＝4/n＝5)。
具体实施例
45.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
46.实施例1制备辅助噬菌体
47.(1)从-80℃冰箱中取出甘油保存的tg1大肠杆菌克隆菌株，采用四区划线的方法涂到tye无抗性的平板上，37℃倒置培养13h。
48.(2)从平板上挑取一个tg1单克隆菌株接种到5ml2
×
ty无抗性液体培养基中，37℃、230rpm培养13h。
49.(3)将tg1菌液以体积比1:100转接到5ml2
×
ty无抗性液体培养基中，37℃、230rpm培养2h(菌液od
600
＝0.5左右)。
50.(4)取200μl tg1菌液(od
600
＝0.5左右)到1.5ml离心管中，加入10μl的km13辅助噬菌体(1
×
10
13
pfu/ml)，放入预热的37℃水中温浴30min。
51.(5)配制软琼脂，使其冷却到40℃左右后，将步骤(4)处理的tg1菌液倒入，混合，再倒入预先配好的含50μg/ml卡那霉素抗性的tye固体培养平板上，室温静置使其凝固，37℃倒置培养13h。
52.(6)挑取一个空斑，放入5mltg1菌液(od
600
＝0.5)中，37℃、230rpm摇床培养2h。
53.(7)将步骤(6)得到的菌液全部转接到500ml2
×
ty培养基中，37℃、230rpm摇床培养2h，再加卡那霉素500μl(在培养基中的浓度为50μg/ml)，30℃、230rpm培养20h。
54.(8)将菌液于3300g离心20min，收集上清到一个无菌管中，用20％的peg/nacl溶液按体积比1:4的比例和上清混匀，冰上放置4h。
55.(9)然后于3300g离心30min，收集沉淀，用1ml无菌pbs(ph＝7.4、0.01m)溶液重悬沉淀，4000g离心5min，收集上清，即为辅助噬菌体。
56.实施例2噬菌体纳米抗体文库的扩增
57.(1)在冰上解冻含有抗体质粒的tg1菌(即人源纳米抗体噬菌体库，sourcebioscience,london,uk)，转接到500ml 2
×
ty液体培养基中(含质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比1％的葡萄糖)，37℃、230rpm摇床培养2.5h(od
600
＝0.5)，然后向其中加入数量为2
×
10
12
的辅助噬菌体，37℃水浴30min。
58.(2)将菌液分装成250ml/瓶，3200g离心10min，去上清，用500ml 2
×
ty培养基(含质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比0.05％的卡那霉素)重悬沉淀，25℃、220rpm震荡培养20h。
59.(3)将菌液3200g离心20min，收集上清液，采用实施例1中步骤(8)-(9)相同的方法纯化噬菌体，制备好的库噬菌体保存在-80℃。
60.(4)测抗体库滴度。第一种：采用分光光度计测量260nm处的光吸收值来估计制备库中的噬菌体滴度，库噬菌体滴度公式：噬菌体个数/ml＝od
260
×
稀释倍数
×
22.14
×
10
10
。第二种：使用克隆技术法估计，将噬菌体稀释到一定浓度后，将侵染对数生长期的tg1菌涂布到含氨苄青霉素的固体平板上，37℃过夜培养，通过克隆的数目推算。扩增出的抗体库滴度为4.8
×
10
13
pfu/ml。
61.实施例3从噬菌体纳米抗体文库中筛选抗egfr片段的纳米抗体
62.(1)抗egfr纳米抗体噬菌体的筛选
63.1)将egfr多肽(购自上海波泰生物公司，具有如seq id no.15所示氨基酸序列)包被在免疫管(nunc)中(第一轮：0.1mg/ml；第二、三轮：0.05mg/ml；第四、五轮：0.025mg/ml；)，设置pbs(对照)管。4℃过夜。
64.2)将包被液倒出，每管用4.5ml pbs洗涤三次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)，每管再加入4.5ml浓度为质量体积比2％的bsa封闭液，室温放置2h。
65.3)倒掉bsa封闭液，每管用4.5ml pbs洗涤三次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
66.4)每管加入4ml含有5
×
10
12
pfu噬菌体的2％bsa溶液，室温静置1h。
67.5)使用pbst洗涤10次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
68.6)每管加入500μl 1mg/ml胰蛋白酶溶液(trypsin solution)，翻转消化洗脱10min。
69.7)将噬菌体洗脱液收集到无菌的1.5mlep管中，从中取125μl噬菌体洗脱液，加入到875μl tg1菌中(od
600
＝0.5)，混匀，放入预热的37℃水中温浴30min。
70.8)根据实验需要稀释混合菌液，然后取2μl侵染菌液涂布在含1％葡萄糖、0.1％氨苄青霉素的tye固体板上，用于鉴定筛选结果。
71.9)将剩余的实验组侵染菌液全部涂布在相同另一块的tye固体板上，37℃过夜培养。
72.10)2ml 2
×
ty(含15％甘油)加到步骤(9)的平板中，将全部细菌刮下并收集到无菌的1.5ml离心管中。从中吸50μl菌液接种到50ml新的2
×
ty液体培养基(含1％葡萄糖、0.1％氨苄青霉素)，37℃、230rpm摇床培养约2h使菌浓度到od
600
＝0.5。2h后，从50ml中取10ml菌液到50ml离心管中，再向离心管中加辅助噬菌体，然后将离心管放入37℃静置水浴30min。
73.11)3000g离心15min，弃去上清，用2
×
ty液体培养基(含有0.1％葡萄糖、0.1％氨苄青霉素、0.05％卡那霉素)，重悬菌体沉淀，25℃、230rpm震荡培养20h。
74.12)3000g离心20min，取上清40ml倒入无菌的50ml离心管中，再向离心管中加10ml20％peg/nacl，上下颠倒混匀，冰浴4h。
75.13)4h后，4℃4000g离心30min，倒掉上清。加入1ml pbs重悬沉淀，转到1.5ml离心管，再次4℃10000g离心10min，收集上清，4℃保存。
76.14)重复步骤1)至13)的步骤，共进行5轮富集筛选，依次从上一轮得到的噬菌体中进行筛选。富集结果如表1所示。富集率＝包被egfr抗原的孔的克隆数目/阴性对照孔的克隆数
77.(2)多克隆噬菌体elisa
78.1)取0.2μg egfr多肽包被96孔免疫板，包被液为100μl/孔，同时设置空白对照孔(pbs)，4℃过夜。
79.2)将包被液倒掉。用pbs洗3次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
80.3)然后加280μl浓度为质量体积比2％的bsa封闭液，室温2h。
81.4)将2％(w/v)bsa封闭液全部倒掉。用pbs洗3次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
82.5)取步骤13)制备的每轮噬菌体溶液作为一抗，与2％(w/v)bsa封闭液以体积比1:3比例混匀，每个孔包被100μl混合液。室温1h。
83.6)1h后，用pbst洗4次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
84.7)每孔加hrp标记的噬菌体m13(m13 bacteriophage-hrp)(用2％(w/v)bsa封闭液以体积比1:10000稀释)的抗体100μl，作为二抗，室温1h。
85.8)1h后，用pbst洗4次、pbs洗1次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
86.9)每孔加100μl tmb显色液(碧云天)，室温避光反应4min。
87.10)4min，每孔加入50μl 1m h2so4溶液。
88.11)使用酶标仪测量od450nm的吸光值。
89.以上结果表明，通过5轮筛选，与抗egfr特异性的噬菌体抗体得到累积。
90.表1噬菌体纳米抗体文库各轮筛选的富集结果
[0091][0092]
实施例4从第5轮富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行elisa验证
[0093]
(1)将第5轮富集筛选得到的噬菌体稀释到10
8-10
10
倍，取100μl稀释液感染对数生长期的tg1菌液涂板，从板中随机挑选448个单克隆菌株置于96孔培养板中培养，每孔200μl2
×
ty培养基/一个克隆，37℃、230rpm摇床培养13h。
[0094]
(2)从每孔中吸取5μl过夜菌液转接到新的96孔的细胞养板中进行培养，每孔200μl2
×
ty培养基/一个克隆，37℃、250rpm培养2h，将旧板每孔吸去95μl的菌液后，再向每个孔中加入100μl浓度为体积百分比30％的甘油水溶液，-80℃储存。
[0095]
(3)2h后转至1.5ml无菌离心管中，再加50μl含辅助噬菌体的2
×
ty，混匀，置于37℃水浴30min。
[0096]
(4)3000g离心10min，弃掉上清，用200μl2
×
ty(含0.1％葡萄糖、0.1％氨苄青霉素、0.05％卡那霉素)重悬菌体沉淀，将每管的菌液加入到一个新的96孔板，25℃，250rpm震荡培养20h。
[0097]
(5)3000g离心10min，将每一孔上清分别收集到一个1.5ml离心管中，4℃暂存备用。
[0098]
(6)取0.2μg egfr多肽包被96孔免疫板，包被液为100μl/孔，同时设置空白对照孔(pbs)和cxcr4多肽(购自上海波泰生物公司)无关抗原对照孔，4℃过夜。
[0099]
(7)将包被液倒掉。用pbs洗3次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
[0100]
(8)然后加280μl浓度为质量体积比2％的bsa封闭液，室温2h。
[0101]
(9)将2％(w/v)bsa封闭液全部倒掉。用pbs洗3次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
[0102]
(10)取步骤(5)制备的单克隆噬菌体溶液作为一抗，与2％(w/v)bsa封闭液以体积比1:3比例混匀，每个包被孔100μl混合液。室温1h。
[0103]
(11)1h后，用pbst洗4次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
[0104]
(12)每孔加hrp标记的噬菌体m13(m13 bacteriophage-hrp)(用2％(w/v)bsa封闭液以体积比1:10000稀释)的抗体100μl，作为二抗，室温1h。
[0105]
(13)1h后，用pbst洗4次、pbs洗1次(每次加入液体后，不用停留直接弃去)。
[0106]
(14)每孔加100μl tmb显色液(碧云天)，室温避光反应4min。
[0107]
(15)4min，每孔加入50μl 1m h2so4溶液。
[0108]
(16)使用酶标仪测量od450nm的吸光值。结果证明得到了25个阳性克隆。图2为其中64个单克隆噬菌体的elisa结果。
[0109]
(17)将阳性克隆送华大基因公司进行dna测序。在ncbi ofr中对测序的dna结果进行分析，排除相同的核苷酸序列，得到5条序列，命名为aeg1b4、aeg2c7、aeg2e12、aeg4d9及aeg6b2，5个纳米抗体的序列如下：
[0110]
aeg1b4：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctccggagttaacgttagcaatgaggttatgagctgggtccgccaggctccagggaagggtctagagtgggtatcaaccattgctaaccatagcggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctcccgtgacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatattattgcgcgacactttatagtggtgctacgaagcagttggagtattggggtcagggaaccctggtcaccgtctcgagcgcggccgca；
[0111]
aeg2c7：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctccggatttacctttaacaatgagattatggcctgggtccgccaggctccagggaagggtctagagtgggtatcaagcattgcggccaataacggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctcccgtgacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatattattgcgcgagatatgcggcggagccgcatacgtattcgatggggaacaagtcgctgaggtattggggtcagggaaccctggtcaccgtctcgagcgcggccgca；
[0112]
aeg2e12：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctccggatatagctctaacaatgagtttatggcctgggtccgccaggctccagggaagggtctagagtgggtatcagccatttctacgagaaacggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctcccgtgacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatattattgcgcgggtgtgtcttataggaggccccagcagttgaagtattggggtcagggaaccctggtcaccgtctcgagcgcggccgca；
[0113]
aeg4d9：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctccggagatatgcttagccctgacaatatgacctgggtccgccaggctccagggaagggtctagagtgggtatcaaccattcataagactgacggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctcccgtgacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatatt
attgcgcgggattgcgtagtagggggcttagttcgaagtacctggagtattggggtcagggaaccccggtcaccgtctcgagcgcggccgca；
[0114]
aeg6b2：atggcccaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgcgtctctcctgtgcagcctccggatttaacgttaaccctaagtatatgacctgggtccgccaggctccagggaagggtctagagtgggtatcaagcattcgtagccctggcggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctcccgtgacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgccgaggacaccgcggtatattattgcgcgagtgttagtcgggatgagaagtacatgcgcttttggggtcagggaaccctggtcaccgtctcgagcgcggccgca。
[0115]
实施例5获得阴性对照纳米抗体
[0116]
采用实施例1-4的方法获得阴性对照纳米抗体，仅将实施例3中(1)和实施例4中(6)的egfr多肽替换为人表皮生长因子受体-2(her2)的合成多肽(上海波泰生物公司)或血管内皮生长因子(vegf)的合成多肽(上海波泰生物公司)，通过elisa挑选2个不与抗原结合的克隆获得阴性对照抗体。
[0117]
实验例中作为阴性对照的纳米抗体aher2-13c1(以her2为抗原)和ave201(以vegf为抗原)分别具有如seq id no:6和seq id no:7所示氨基酸序列。编码所述的aher2-13c12和ave201的核苷酸序列分别如seq id no:13和seq id no:14所示。
[0118]
实施例6表达抗egfr的纳米抗体的原核表达及纯化
[0119]
(1)bl21感受态细胞制备
[0120]
1)分别从lb平板上挑取一个新活化的大肠杆菌dh5α和bl21(de3)菌落(bl21(de3)购自天津天有利科技有限公司)，接种于5ml lb液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜(约12h左右)。
[0121]
2)将菌种悬液以体积比1:100的比例接种，取500μl菌液转接到50ml lb液体培养基中(此步可根据所需量，按比例放大或缩小)，37℃振荡培养2～3h，至od
600
＝0.5左右。
[0122]
3)将菌液转入50ml离心管中，冰上放置10min，4℃下3000g离心5min，弃上清，用冰上预冷的10ml0.1mol/l的cacl2溶液轻轻悬浮细菌细胞，冰上放置30min。
[0123]
4)4℃、3000g离心5min，弃上清，加入3ml预冷的0.1mol/lcacl2溶液，轻轻地悬浮细菌细胞，冰上静置5min，完成感受态细胞的制备。
[0124]
5)3ml制备好的感受态细胞中加入3ml已灭菌并预冷的体积百分比30％的甘油水溶液(即1:1体积，使甘油终浓度为15％)，轻轻混匀，分装成每管100μl，迅速转移至-80℃冰箱保存。
[0125]
(2)纳米抗体重组载体构建
[0126]
配制pcr反应体系：5
×
primerstar缓冲液10μl、dntp混合物(每种2.5mm)4μl、aeg-f引物(10μm，5
’-
gatccatggcccaggtgcagctgt-3’)1μl、aeg-r引物(10μm，5
’-
tctgcggccgcgctcgagac-3’)1μl、模板10ng、primerstardna聚合酶0.5μl、无菌去离子水补足至50μl。
[0127]
pcr反应：96℃10min；95℃10sec、60℃10sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min。
[0128]
通过pcr产物纯化试剂盒对pcr产物进行纯化。
[0129]
按照如下方案将pet-22b载体(购自emd biosciences(novagen))和pcr产物进行双酶切反应，酶切体系如下：
[0130]
pet-22b载体质粒2μg、酶切缓冲液5μl、noti2μl、ncoi2μl、无菌水补足至50μl。
[0131]
pcr产物1.4μg、酶切缓冲液6μl、noti2μl、ncoi2μl、无菌水补足至60μl。
[0132]
将上述反应体系置于37℃保温15分钟。即得pet-22b双酶切产物和目的片段双酶切产物。通过酶切产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化。
[0133]
接着进行连接反应，体系如下：pet-22b双酶切产物0.03pmol、目的片段双酶切产物0.3pmol、酶连缓冲液2.5μl、t4 dna连接酶1μl，无菌水补足至25μl。
[0134]
4℃连接过夜，得到连接产物。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，然后通过引物aeg-f和aeg-r对菌落进行初筛，得到的阳性克隆扩大培养，抽提质粒，通过酶切反应复筛，复筛得到的阳性克隆进行测序，获得pet-22b载体和纳米抗体重组得到的重组表达质粒。
[0135]
(3)纳米抗体重组载体转化感受态细胞
[0136]
1)从-80℃冰箱中取出冻存的bl21感受态细胞，置于冰上解冻。
[0137]
2)短暂离心重组表达质粒，取10μl重组表达质粒于1.5ml ep管中，并放于冰上，ep管内加入100μl感受态细胞，手指轻弹管底混匀，冰上放置30min。
[0138]
3)将混合物在42℃恒温水浴锅中保温100s，迅速转移到冰上冷却至少2min。ep管内加入900μl不含抗生素的lb培养基，37℃、220rpm摇菌1.5h。
[0139]
4)菌液8000g离心1min，使菌体沉淀到管底，去除900μl上清，用剩下的100μl培养液重悬细菌沉淀，将菌液均匀涂布于含0.1％氨苄青霉素和1％葡萄糖的lb固体培养基上，37℃培养12-16h。
[0140]
(4)纳米抗体的原核表达及纯化
[0141]
1)挑取含有重组表达质粒载体的bl21(de3)单克隆接种至5ml含1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、230rpm摇床培养13h。
[0142]
2)按体积比1:100的比例接种，取4ml过夜菌液转接到400ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养2-3h，使od
600
＝0.6-0.8。
[0143]
3)加入0.25mm iptg诱导表达，25℃、230rpm震荡培养6h，5000g离心5min，弃上清，40ml破菌缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎，超声功率650w的40％，超声破碎4s，停歇8s，保护温度10℃，工作40min。
[0144]
4)将破碎液收集至离心管，4℃、15000g离心30min，收集上清至新离心管，0.22μm滤膜过滤，可4℃保存，以备纯化(储存的时间不超过4天)。
[0145]
5)采用镍柱对破碎上清中的抗体蛋白进行纯化。取出4℃保存的镍柱，滴掉保存液(20％酒精)，加入10ml超纯水清洗，开始进行后续纯化。
[0146]
第一步：用10ml破菌缓冲液平衡柱子。
[0147]
第二步：将收集的蛋白上清过柱，使目的蛋白结合到柱子上。
[0148]
第三步：使用20ml洗杂缓冲液(含0.02m咪唑)洗去杂蛋白。
[0149]
第四步：使用5ml洗脱缓冲液(含0.2m咪唑)对目的蛋白进行洗脱，并收集5管洗脱液，1ml/管。同时收集每一步的过柱液用于后续检测。
[0150]
6)制备每一步不同组分蛋白的sds-page电泳上样缓冲液，然后分别进行sds-page电泳检测。抗体蛋白表达纯化后的sds-page蛋白电泳图如图3所示。
[0151]
7)将所有纯化所得抗体溶液均透析到细胞用pbs(ph＝7.4、0.01m)中，使用0.22μm
针头滤器过滤除菌，所有蛋白-80℃储存。
[0152]
8)采用bca方法确定抗egfr抗体蛋白的浓度。将蛋白溶液用pbs调整为1mg/ml用以后续实验。
[0153]
(5)采用elisa方法检测纯化的抗egfr纳米抗体与egfr多肽的结合
[0154]
1)分别取0.2μg vegf、camph、bmp2、endof1、fgf21、her2、cxcr4、egfr片段(以上片段均由上海波泰生物公司提供)包被96孔免疫板，包被液为100μl/孔，同时设置空白对照孔(pbs)，4℃过夜。
[0155]
2)其余步骤按照实施例3中多克隆噬菌体elisa过程中的步骤2)-11)，仅将步骤7)中hrp标记的噬菌体m13替换为proteina-hrp蛋白(按体积比1:5000稀释)。结果如图4所示。
[0156]
(6)采用westernblotting方法检测纯化的抗egfr纳米抗体与egfr完整胞外段的结合
[0157]
1)取0.5μg egfr完整胞外段(购自北京义翘神州生物公司)进行sds-page电泳，并转到pvdf膜上，用5％的脱脂奶粉封闭。
[0158]
2)加入纯化的aeg抗体，4℃过夜。
[0159]
3)第二天，pbst洗涤3次，6min/次。
[0160]
4)加入二抗protein a-hrp(1:5000)，室温1h。
[0161]
5)pbst洗涤3次，每次8min。
[0162]
6)使用ecl发光液(a液:b液体积比＝1:1)均匀涂抹到pvdf膜上，置于凝胶成像系统中进行成像。结果如图5所示。
[0163]
实验例7
[0164]
mtt法检测纳米抗体对人肺癌细胞a549、人乳腺癌细胞mcf-7及人前列腺癌细胞du145增殖的抑制作用(a549、mcf-7和du145购自上海信裕生物科技有限公司)。
[0165]
(1)接种5000个细胞到96孔板中(重复数n＝3)，37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中过夜培养。
[0166]
(2)去除旧的培养基，每孔加入无血清的培养基100μl(a549、du145使用1640，mcf-7使用dmem)，培养4h。
[0167]
(3)以含有抗体的1％fbs的培养基替换无血清的培养基，加入到相应的细胞中，37℃、5％co2培养72h。每个抗体设置4个浓度：0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml及100μg/ml。采用ave201和aher2-13c1作为阴性对照抗体。
[0168]
(4)加纳米抗体72h后，弃去旧的培养基，每孔加入mtt-dmem混合溶液120μl(1mg/ml mtt:dmem＝体积比1:5)，37℃保温4h。
[0169]
(5)将mtt-dmem混合液吸去，并将板晾干。每孔加入150μl dmso溶解沉淀。置于脱色摇床，10min。
[0170]
(6)用酶标仪测量波长570nm处各孔的光吸收值od。
[0171]
结果如图6所示，与未加抗体组(0μg/ml)相比，5个抗egfr抗体均能显著抑制癌细胞增殖。其中aeg2e12在25μg/ml浓度下已存在对a549和du145的显著抑制作用，而在50μg/ml浓度下显著抑制mcf-7的增殖，抗体浓度和抑制增殖效果正相关。以上结果证明纯化后的5个抗egfr纳米抗体能够抑制a549、mcf-7和du145细胞的增殖。
[0172]
实验例8纳米抗体对a549、mcf-7和du145细胞凋亡的作用
[0173]
(1)接种细胞25万个/孔(六孔板)，37℃、5％co2过夜培养，使其贴壁。
[0174]
(2)去除旧的培养基，每孔加入无血清的培养基，培养4h，加入1％(v/v)fbs培养基，使培养基中含终浓度为50μg/ml的抗egfr抗体，采用ave201和aher2-13c1作为阴性对照抗体，37℃、5％co2培养48h。
[0175]
(3)从培养箱中取出细胞，去除旧的培基，使用无菌pbs洗一次，加700μl浓度为0.25％(w/v)的胰酶溶液消化，再加含有10％fbs的培养基终止消化。轻轻吹打，收集细胞悬液到无菌1.5ml ep管中，1050g离心5min。
[0176]
(4)加1ml无菌pbs到含有细胞沉淀的ep管中，用枪头轻轻重悬细胞，3000g离心5min。重复操作一次
[0177]
(5)用195μl结合缓冲液(binding buffer，1
×
)重悬细胞，然后加5μl annexin v-fitc，室温避光孵育15min。
[0178]
(6)4℃、1000rpm离心5min，弃上清。加200μl结合缓冲液重悬细胞，4℃1000g离心5min，弃上清。
[0179]
(7)190μl结合缓冲液重悬细胞，然后加10μl碘化丙锭(propidium iodide)，4h内上机检测。
[0180]
结果如图7所示，其中，图a、c、e分别是凋亡的a549、mcf-7和du145细胞二维散点图，可以看出图中凋亡细胞比无抗体对照均有增多(右半边)。图b、d、f分别是从图a、c、e得到的凋亡比例。结果证明，纯化后的5个抗egfr纳米抗体能够促进a549、mcf-7和du145细胞的凋亡。
[0181]
实验例9纳米抗体对a549、mcf-7和du145细胞迁移的作用
[0182]
(1)取一个12孔板，平行于长边在孔的背面画两条距离为5mm的平行线。接种细胞50万个/孔，37℃、5％co2培养过夜，使其贴壁。
[0183]
(2)去除旧的培养基(a549、du145使用1640，mcf-7使用dmem)，每孔加入无血清的培养基，培养4h。用200μl的枪口垂直于板背面的线将细胞划开，每孔划三条空隙，用pbs洗掉脱落细胞。
[0184]
(3)将含有抗体的1％fbs的培养基同时加入到相应的细胞中，37℃、5％co2培养24h。每个抗体设置4个浓度：0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml。采用ave201和aher2-13c1作为阴性对照抗体。
[0185]
(4)倒置显微镜下拍照，测量空隙的距离并记录。
[0186]
结果如图8和9所示，随着5个纳米抗体浓度升高，a549、mcf-7和du145细胞的迁移率均有降低，a549和du145细胞迁移率的降低尤其明显，纳米抗体浓度与细胞迁移率负相关，结果证明纯化后的5个抗egfr纳米抗体能够抑制a549、mcf-7和du145细胞的迁移。
[0187]
实验例10纳米抗体对a549、mcf-7和du145细胞迁移的作用
[0188]
(1)将无菌的细胞培养transwell小室取出放置到24孔板中，上小室接种相应抗体和细胞5000万个/孔(24孔板)的混合悬液200μl(2％fbs)，下小室中加入500μl培养基(含体积百分比10％的fbs)，37℃、5％co2培养24h。每个抗体设置4个浓度：0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml。采用ave201和aher2-13c1作为阴性对照抗体。
[0189]
(2)取出培养板，镊子夹着小室，用pbs洗两次，洗掉培养基。
[0190]
(3)4％多聚甲醛固定15min，然后pbs洗两次。
[0191]
(4)2％结晶紫避光染色30min，然后pbs洗两次。
[0192]
(5)用棉签擦掉小室内侧的细胞，将小室放置在置于倒置显微镜下拍照。
[0193]
(6)100μl的20％乙酸溶液洗掉每个上小室外侧的细胞染液。
[0194]
(7)将洗脱液吸到96孔板相应的孔中，酶标仪测量od570 nm，重复测量3次。
[0195]
结果如图10和11所示，随着5个纳米抗体浓度升高，癌细胞的迁移率显著降低，以上结果证明纯化后的5个抗egfr纳米抗体能够抑制a549、mcf-7和du145细胞的迁移。
[0196]
实验例11纳米抗体对mcf-7、a549和du-145细胞侵袭的作用
[0197]
(1)将无菌transwell小室放置到24孔板中，每孔加入50μl基质胶(1:9稀释)，轻轻晃动培养板使胶均匀铺满，37℃培养箱中过夜，使胶凝固。
[0198]
(2)取出铺好胶的培养板，上小室接种相应抗体处理过的细胞5万个/孔的细胞混合悬液200μl(2％fbs培养基)，每个抗体设置4个浓度：0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml，下小室中加入500μl培养基(10％fbs)，37℃、5％co2培养24h。采用ave201和aher2-13c1作为阴性对照抗体。
[0199]
(3)取出培养板，用镊子夹着小室，pbs洗两次，使培养基洗掉。
[0200]
(4)4％多聚甲醛固定15min，每孔500μl，固定后pbs洗两次上小室。
[0201]
(5)2％的结晶紫染色，避光30min，pbs洗两次。
[0202]
(6)用棉签擦轻轻擦掉上小室内侧的细胞，将小室放置在置于倒置显微镜下拍照。
[0203]
(7)100μl20％乙酸溶液洗掉每个上小室外侧的细胞染液。
[0204]
(8)将洗脱液吸到96孔板相应的孔中，用酶标仪测量od570 nm。
[0205]
结果如图12～13所示，与未加抗体组(0μg/ml)相比，5个抗egfr抗体均能显著抑制癌细胞侵袭。其中，aeg2e12在25μg/ml浓度下能显著抑制三种癌细胞迁移，aeg4d9在25μg/ml浓度下能显著抑制a549和du145迁移，在50μg/ml浓度下能显著抑制mcf-7迁移。以上结果证明纯化后的5个抗egfr纳米抗体能够抑制a549、mcf-7和du145细胞的侵袭。
[0206]
实验例12纳米抗体对小鼠肺癌模型的作用
[0207]
(1)胰酶消化a549细胞，1050g离心5min。
[0208]
(2)弃上清，将收集到的细胞用pbs重悬，置于离心机1050g离心5min。
[0209]
(3)重复步骤(2)。弃上清，加入适量pbs重悬细胞沉淀并将细胞密度调整为5
×
107/ml。
[0210]
(4)选取4周龄雄性balb/c裸鼠(购自广东省医学实验动物中心)，使用1ml无菌注射器吸取100μl细胞悬液(含有5
×
106个a549细胞)，以皮下注射方式将细胞悬液注射于小鼠右腋下进行造瘤，将小鼠置于spf级动物实验室按常规饲养，每三天使用游标卡尺测量一次小鼠肿瘤体积。
[0211]
(5)选取体外功能实验结果最好的抗体aeg2e12和aeg4d9进行动物实验，aher2-13c1和ave201作为阴性对照。待瘤体积达到100mm3后，将小鼠随机分为6组，每组5只。其中1组为空白对照组(pbs)，1组为阳性对照组(顺铂，ddp)，2组为实验抗体组(aeg2e12，aeg4d9)，2组为阴性对照抗体组(aher2-13c1，ave201)。使用胰岛素注射器通过尾静脉给药。其中实验抗体组和阴性对照纳米抗体组的每只小鼠给药量10mg/kg，阳性对照组每只给药2mg/kg，空白对照组每只注射100μl细胞用pbs缓冲液。给药周期为24天，给药频率为3天/次，同时记录各组小鼠肿瘤体积。给药后处死小鼠，剥取肿瘤，拍照并称量重量。
[0212]
结果如图14所示，给药后实验抗体组肿瘤体积的增大较空白对照组和阴性对照抗体组明显放缓，最终体积也明显更小，证明纯化后的aeg2e12和aeg4d9纳米抗体能够抑制a549细胞诱导的小鼠肺癌模型的肿瘤大小。
[0213]
实施例中所用到的试剂的配制方法如下：
[0214]
(1)pbs/pbst(ph7.4)：kh2po
4 0.24g、nacl 8g、kcl 0.2g、na2hpo4·
12h2o 9.07g。
[0215]
称取试剂，加入900ml去离子水溶解，定容至1l。
[0216]
pbst：配制好的pbs缓冲液中加入终浓度为0.1％的吐温-20，充分混匀，121℃灭菌，4℃保存。
[0217]
(2)tbs/tbst：tris碱6.05g、nacl 21.93g。
[0218]
将试剂用400ml去离子水溶解，用稀盐酸调ph至7.4，定容至500ml。
[0219]
tbst：在500ml tbs缓冲液中加入500μl吐温-20，充分混匀。
[0220]
(3)lb液体培养基：nacl 2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、超纯水200ml。
[0221]
lb固体培养基：lb液体培养基配方中加入4g琼脂粉。
[0222]
(4)20％葡萄糖：称取200g葡萄糖粉末，溶解于1l去离子水，使用0.22μm滤器过滤除菌。
[0223]
(5)100μg/ml氨苄青霉素溶液：称取1g粉末，溶解于10ml去离子水中配制成100mg/ml的溶液，使用0.22μm的滤器过滤除菌，分装成1ml每管，-20℃存储。
[0224]
(6)sds-page电泳液：甘氨酸94g、tris碱30.2g、sds 5g。
[0225]
将试剂用900ml去离子水溶解，定容至1l。此试剂为5
×
电泳液配方，4℃保存。
[0226]
(7)sds-page转膜液：tris碱15.14g、甘氨酸72g。
[0227]
将试剂用900ml去离子水溶解，定容至1l，4℃保存。此试剂为5
×
电泳液配方。
[0228]
(8)500m iptg：称取iptg粉末11.915g，溶解于100ml去离子水，使用0.2μm滤器过滤除菌。
[0229]
(9)1m h2so4：在187ml去离子水中缓慢加入10ml浓硫酸。
[0230]
(10)100
×
pmfs：称取1.74g pmsf，溶解于100ml异丙醇，-20℃保存。
[0231]
(11)蛋白表达纯化缓冲液
[0232]
破菌缓冲液：tris碱2.42g、nacl 14.6g、100
×
pmsf 10ml
[0233]
将试剂溶解于900ml超纯水，使用稀盐酸调节ph值到7.45，定容至1l，4℃保存。
[0234]
上样缓冲液：同破菌缓冲液。
[0235]
洗杂缓冲液：取上样缓冲液20ml，添加200μl咪唑母液(2m)。
[0236]
洗脱缓冲液：取上样缓冲液9ml，添加1ml咪唑母液(2m)。
[0237]
(12)2％bsa：在pbs缓冲液中加入2％的牛血清白蛋白粉末(w/v)。
[0238]
(13)30％甘油溶液(甘油-pbs)：量取15ml丙三醇，加入35mlpbs缓冲液(ph＝7.4)，使用0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。
[0239]
(14)10％过硫酸铵(aps)：硫酸铵0.5g、ddh2o 5ml。分装成500μl每管，-20℃保存。
[0240]
(15)1m tris-hcl(ph＝8.8/ph＝6.8)：称取0.2g tris-base粉末，溶解于900ml去离子水中，使用稀盐酸调节ph值到6.8或8.8.定容至1l，121℃灭菌，4℃保存。
[0241]
(16)考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝r-250 1g、异丙醇250ml、冰醋酸100ml、ddh2o 650ml。
[0242]
(17)考马斯亮蓝染色脱色液：冰醋酸100ml、乙醇50ml、ddh2o 850ml。
[0243]
(18)5
×
蛋白上样缓冲液：ph 6.8、1m tris-hcl 12.5ml、sds 5g、溴酚蓝0.25g、甘油25ml。试剂中加入ddh2o，定容至50ml，室温保存。使用前取500μl，选择性加入25μlβ-巯基乙醇。
[0244]
(19)tye固体培养基(400ml)：蛋白胨5g、酵母粉2.5g、琼脂粉4g、ddh2o 400ml。121℃灭菌，待冷却至50℃时加入1％葡萄糖溶液和100μg/ml氨苄青霉素，混匀后倒平板，4℃冰箱保存。
[0245]
(20)2
×
ty培养基(100ml)：蛋白胨1.6g、酵母粉1g、nacl 0.5g、ddh2o 100ml。121℃灭菌。
[0246]
(21)20％peg/nacl溶液(500ml)：peg600 100g、nacl 73g、ddh2o 400ml。
[0247]
去离子水溶解后，定容到500ml，121℃高温高压灭菌20min，常温保存。
[0248]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。