抗p40蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗p40蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
p40蛋白位于细胞核内，其基因cdna全长约2.2kb，分子量约40kd，故命名为p40，是由p63基因编码翻译而形成的一种蛋白，无反转录活性，又称
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np63。人体p63基因，位于染色体3q27-29，包含15个外显子，2个独立启动子，其编码的蛋白质分为两大类：(1)从外显子1开始转录生成具有反式激活域(ta)全长蛋白tap63，通过凋亡和细胞分化促进细胞周期循环；(2)从外显子3开始转录生成不具有反式激活域(ta)的蛋白质亚型p40(
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np63)，无反转录活性。其中
△
np63(p40)在鳞状细胞癌中是有选择性地表达，p40对鳞癌的敏感性同p63，特异性却优于p63(灵敏度为100％，特异性：p40为98％，p63为60％)。有研究表明，
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np63选择性地表达在肺鳞癌，在所有肺腺癌呈阴性；tap63不仅限于肺鳞癌，在肺腺癌中的表达率约15％。p63在除外黏液型腺癌的所有亚型腺癌中均表达。p63阳性的低分化肺腺癌可能被错误地诊断为肺鳞癌。
[0003]
p40被广泛地应用于头颈部肿瘤、食管癌等疾病的诊断。近年将p40应用于肺的研究发现，p40表达于正常支气管粘膜的基底细胞、气管腺体的肌上皮细胞，抗p40抗体在标记鳞状上皮时具有高度特异性。并且p40在肺鳞癌中的特异性表达要胜于p63蛋白。在日常病理诊断中p63被广泛应用于肺癌的分型，在肺鳞癌中有很高的敏感性，但也部分表达肺腺癌，同p36相比而言，p40在肺鳞癌中有着同p36抗体类似的高敏感性，但在肺腺癌中罕见表达。故p40被推荐用于肺鳞癌和肺腺癌的鉴别诊断。


技术实现要素：

[0004]
发明人提供了一种抗p40蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是seq id no.2和seq id no.3所示的氨基酸序列。
[0005]
进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是seq id no.4和seq id no.5所示的核苷酸序列所编码。
[0006]
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别p40蛋白。
[0007]
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中seq id no.1所示的氨基酸序列。
[0008]
进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为cgmcc no.16208的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系14d5e8f12，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2020年04月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009]
进一步地，所述抗p40蛋白为小鼠igg1亚型单克隆抗体。
[0010]
进一步地，发明人还提供了一种抗p40蛋白单克隆抗体的制备方法，选取p40蛋白氨基酸序列第4位至第19位氨基酸并与载体蛋白klh偶联作为免疫原。
[0011]
发明人还提供了一株分泌抗p40蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系14d5e8f12，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年7月30日，保藏号为：cgmcc no.16208。
[0012]
发明人还提供上述任一所述的抗p40蛋白单克隆抗体，在p40蛋白免疫检测中的用途。
[0013]
进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
[0014]
区别于现有技术，上述技术方案依据p40蛋白与dna结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列第4-19位蛋白(seq id no.1)，区域作为抗原肽，并偶联载体klh，作为免疫原。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗p40蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系14d5e8f12,以及由该细胞系所分泌的抗p40蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达p40蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
[0015]
图1：纯化后p40单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0016]
图2：肺鳞癌免疫组化染色结果图，其中左为(14d5e8f12)的p40，右为市售p40((zr8)兔单抗)。
[0017]
图3：肺腺癌免疫组化染色结果图，其中左为(14d5e8f12)的p40，右为市售p40((zr8)兔单抗)。
具体实施方式
[0018]
实施例1重组p40蛋白片段的制备
[0019]
一、基因克隆
[0020]
从uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号q9h3d4的p40蛋白序列作为标准序列。依据其与dna结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定p40氨基酸序列第4位至第19位序列，其对应的核苷酸序列为seq id no.1。合成以上p40蛋白片段，在其n端添加巯基修饰并与载体蛋白klh偶联，提高其免疫原性，作为免疫原备用。
[0021]
实施例2 14d5e8f12杂交瘤细胞系的建立
[0022]
一、免疫
[0023]
将实施例1中获得的p40蛋白-klh偶联物稀释至1mg/ml，然后与等体积的完全弗氏佐剂(cfa,sigma公司)混合乳化，对18-20g的balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(ifa,sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。第2次加强免疫后14天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用pbs溶液混匀，剂量为50μg/只。
[0024]
二、细胞融合
[0025]
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)以5:1比例
混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1ml预热至37℃的peg(sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与peg充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4ml预热至37℃的无血清dmem(hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10ml预热无血清dmem培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清dmem培养基，定容至50ml，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mlhat(sigma公司)培养基重悬细胞，并用hat培养基稀释至终浓度为0.5
×
106cells/ml，所有溶液转移至96孔板中，200μl/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％co2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加hat培养基，50μl/孔。
[0026]
三、elisa筛选阳性杂交瘤细胞
[0027]
当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μl培养液上清进行首次细胞筛选(elisa、ihc-p及其他方法检测)，同时往培养孔中补加hat培养基至200μl。elisa检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加ht培养基，2ml/孔，培养3天。
[0028]
重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至co2培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株14d5e8f12。将此细胞株转入t-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。
[0029]
实施例3体外培养法制备单克隆抗体
[0030]
一、体外培养
[0031]
获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。
[0032]
以含10％胎牛血清的dmem完全培养基培养杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。
[0033]
二、单克隆抗体的纯化
[0034]
用rprotein a sepharose fast flow(ge公司)亲和层析柱纯化抗体：
①
装柱，将购买的proteina填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1m tris溶液，ph7.0)冲洗至平衡；
②
上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；
③
平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；
④
洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸溶液，ph3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；
⑤
再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用sds-page法鉴定抗体纯度。结果见图1，纯化后p40,纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/ml以上。
[0035]
实施例4单克隆抗体特性鉴定
[0036]
一、亚型鉴定
[0037]
将细胞上清稀释成1μg/ml包被酶标板,每孔加100μl，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbs-t)洗板3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa的pbs-t溶液)，37
℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1ml杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。用封闭液1：400稀释hrp标记的羊抗鼠(κ,λ，igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体(southern biotech公司)，每孔分别加入0.1ml，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)底物(a、b等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μl 1n hcl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的od值。结果显示，本发明单克隆抗体为igg1型鼠源单克隆抗体。
[0038]
二、亲和常数测定
[0039]
包被p40蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，pbs-t洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/ml)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl tmb(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl 1.0n盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台od值”对应的抗体浓度a。利用下列公式计算出亲和常数为5.99
×
109l
×
mol-1
。
[0040][0041]
实施例6组织芯片染色和鉴定
[0042]
一、组织蜡块制备过程
[0043]
对样本组织进行he切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％apes丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。
[0044]
二、ihc染色及分析
[0045]
常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，pbs冲洗3
×
3分钟。滴加3％h2o2孵育10分钟，pbs冲洗3
×
3分钟。甩去pbs，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，pbs冲洗3
×
3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，pbs冲洗3
×
3分钟，甩去pbs，用新鲜配置的dab显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，pbs返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。
[0046]
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：
[0047]
1、样本为弱阳性；标记为“+”；
[0048]
2、样本为中度阳性；标记为“++”；
[0049]
3、样本为高度阳性；标记为“+++”；
[0050]
4、样本为阴性，标记为
“-”
。
[0051]
三、样本检测结果：
[0052]
用抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)和对照抗体-市售抗p40抗体((zr8)兔单抗)在18例肺鳞癌和20例肺腺癌上进行同步检测，结果如下表所示。
[0053][0054]
结果显示:本发明所提供的抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在18例肺鳞癌中，使用抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)的阳性细胞数和阳性强度均高于使用对照试剂，1例对比抗体结果为阴性的样本，抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)结果为弱阳性，2例对比抗体结果为中度阳性的样本，抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)结果为强阳性；说明抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)对肺鳞癌的鉴别诊断相对市售抗体更具敏感度，可有效提高肺鳞癌的检出率。
[0055]
而在对20例肺腺癌的检测中，本发明所提供的抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)未检出阳性，也证明本抗体对应的可识别抗原在肺鳞癌中特异性表达(检出率和该抗原含量有关)，而在肺腺癌中不表达。本抗体可用于肺鳞癌和肺腺癌的鉴别诊断，使用本抗体检出阳性的组织，可确认为肺鳞癌。
[0056]
而用抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)和对照抗体-市售抗体，在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。
[0057]
图2为肺鳞癌免疫组化染色结果图，其中左为(14d5e8f12)的p40，右为市售p40((zr8)兔单抗)。结果显示，14d5e8f12的p40的染色的阳性细胞数和阳性强度明显高于市售p40((zr8)兔单抗)的染色强度，说明其敏感度更高。
[0058]
图3为肺腺癌免疫组化染色结果图，其中左为(14d5e8f12)的p40，右为市售p40((zr8)兔单抗)。结果显示，抗p40蛋白单克隆抗体(14d5e8f12)和对照抗体-市售抗体的免疫组化结果一致，皆为阴性。