青蒿MYB类转录因子AaMYB15及其应用

青蒿myb类转录因子aamyb15及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿myb类转录因子aamyb15及其应用。


背景技术：

2.青蒿(artemisia annua l.),别名黄花蒿、香蒿,是菊科蒿属黄花蒿种的一年生草本植物。青蒿素是存在于青蒿中的具有抗疟作用的倍半萜内酯类化合物，除了目前难以替代的抗疟作用之外，在治疗红斑狼疮相关肾炎、癌症、糖尿病等多种疾病方面也显示出了潜力，因此青蒿素目前还有广阔的研究前景和非常大的市场需求。在其他合成手段目前还没有大量投入应用的情况下，青蒿是青蒿素的唯一植物来源，然而青蒿素在野生型青蒿植株中的含量很低，故提高青蒿中青蒿素的含量是青蒿遗传改良、新品种培育的关键。
3.目前有多种策略可以提高青蒿中青蒿素的含量，包括过表达青蒿素合成关键酶基因、阻断青蒿素合成竞争支路、青蒿素转运蛋白的调控和青蒿素生物合成基因的转录调控等。转录因子(transcription factors，tfs)通常是核基因编码的一类蛋白质，它们主要以同源或异源二聚体的形式同顺式作用因子发生特异性的结合，通过和某些辅助调控子发生作用而影响转录复合体的形成，从而调节植物基因的特异性表达最近研究表明，转录因子能激活植物次生代谢产物合成途径中多个合成酶基因的协同表达而有效促进次生代谢产物的合成，因此对青蒿素生物合成基因的转录调控研究，成为了国内外关注的焦点。
4.myb转录因子广泛地在植物的各种生理活动中发挥作用，包括参与细胞形态与模式建成的调控、参与植物体对环境因子和植物激素的应答、参与植物体各类次生代谢的调控途径的调节等。其调控方式包括蛋白质互作的调控、转录酶的调控、转录因子磷酸化调控、氧化还原反应的调控以及蛋白质泛素化作用等。在前人的研究中，有许多myb转录因子在植物次生代谢方面具有调控作用的报道。
5.aamyb15是青蒿中分离得到的一个myb类转录因子，在青蒿植株中反义干扰aamyb15的表达可以显著提高青蒿素的含量，表明该转录因子能够调控青蒿素的生物合成，故克隆该基因对于青蒿的基因工程育种和青蒿素的规模化生产具有重要意义。经过对现有技术文献的检索，尚未发现有与本发明的aamyb15基因序列相关的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种青蒿aamyb15基因及其用途，该基因编码青蒿myb转录因子aamyb15,该转录因子能够抑制青蒿素生物合成途径中四个关键限速酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1启动子的活性，负向调控对应基因的表达，从而抑制青蒿素的生物合成；利用基因工程技术将青蒿aamyb15转录因子在青蒿中反义干扰表达，可以显著提高转基因植株的青蒿素含量，且不会影响植物的正常生长发育，对于青蒿的种质创新和高含量青蒿素品种的选育以及青蒿素的规模化生产具有重要意义。
7.本发明是通过以下的技术方案实现的：
8.第一方面，本发明提供了一种青蒿myb类转录因子aamyb15，所述转录因子aamyb15的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.进一步地，所述核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。
10.第二方面，本发明公开了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如seq id no：1所示的青蒿myb类转录因子aamyb15的核苷酸序列。
11.进一步地，所述重组表达载体编码如seq id no:2所示的aamyb15的氨基酸序列。
12.第三方面，本发明公开了一种前述的aamyb15转录因子在调控青蒿素含量中的应用。所述转录因子抑制青蒿素生物合成途径中四个关键限速酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1启动子的活性，负向调控对应基因的表达。过表达该基因会降低转基因植株青蒿素含量，而反义干扰沉默表达aamyb15基因可以提高青蒿素含量。
13.进一步地，调控青蒿素含量的方法包括如下步骤：
14.步骤一，将青蒿myb类转录因子aamyb15的核苷酸序列连于植物表达调控序列上，构建含有aamyb15核苷酸序列的过量表达载体phb
‑
aamyb15
‑
yfp和反义干扰表达载体phb
‑
aamyb15
‑
antisense，转入农杆菌菌株gv3101中。
15.步骤二，将青蒿中青蒿素生物合成关键酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1的启动子proads、procyp71av1、prodbr2和proaldh1连入pgreenii0800
‑
luc载体，构建植物双荧光素检测报告载体pgreenii0800
‑
proads、pgreenii0800
‑
procyp71av1、pgreenii0800
‑
prodbr2和pgreenii0800
‑
proaldh1；
16.步骤三，将所述phb
‑
aamyb15
‑
yfp植物表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体pgreenii0800
‑
proads、pgreenii0800
‑
procyp71av1、pgreenii0800
‑
prodbr2和pgreenii0800
‑
proaldh1分别转入带有psoup19辅助质粒的农杆菌菌株gv3101中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株；
17.步骤四，将包含所述phb
‑
aamyb15
‑
yfp植物表达载体的农杆菌工程菌株分别与包含所述pgreenii0800
‑
proads、pgreenii0800
‑
procyp71av1、pgreenii0800
‑
prodbr2和pgreenii0800
‑
proaldh1植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株按1:1比例混合后，通过注射侵染的方式注射到生长4
‑
5周的烟草叶片中，弱光下培养；
18.步骤五，用打孔器取烟草叶片注射部位的样品，液氮速冻后研磨成粉末；
19.步骤六，采用promega
‑
dual
‑
luciferase检测试剂盒和glomax 20/20luminometer荧光检测仪检测荧光强度，确定转录因子aamyb15对青蒿素合成关键酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1的启动子的抑制作用；
20.步骤七，将步骤一所述过量表达载体phb
‑
aamyb15
‑
yfp和反义干扰表达载体phb
‑
aamyb15
‑
antisense转入农杆菌菌株eha105中，分别得到包含过量表达载体phb
‑
aamyb15
‑
yfp和反义干扰表达载体phb
‑
aamyb15
‑
antisense的根癌农杆菌菌株eha105用于青蒿转化。
21.步骤八，将步骤七所述两种农杆菌转入青蒿，经过抗生素卡那霉素筛选，获得抗性苗，再提取植株dna经过pcr进行阳性检测获得转基因青蒿植株。经过青蒿素含量检测，所述过量表达aamyb15的转基因植株中青蒿素含量显著降低，反义干扰表达aamyb15转基因青蒿植株中青蒿素含量显著提高，确认aamyb15对青蒿素含量的负向调控作用。
22.优选地，步骤一、三、七中，所述转入具体方法为：采用冻融法进行转入；所述的经pcr进行阳性检测的具体方法为：依据转录因子aamyb15的核苷酸序列设计测序引物，进行
dna扩增，pcr产物电泳后紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。
23.第四方面，本发明提供一种利用反义干扰aamyb15表达来提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：
24.步骤一，对青蒿转录组数据库myb类转录因子进行分析，从青蒿cdna文库中克隆青蒿myb类转录因子aamyb15；
25.步骤二，把aamyb15核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成反义干扰载体phb
‑
aamyb15
‑
antisense。
26.步骤三，将步骤二所述反义干扰载体phb
‑
aamyb15
‑
antisense转入农杆菌eha105菌株中，得到包含反义干扰表达载体的根癌农杆菌菌株eha105.
27.步骤四，将步骤三中所述农杆菌转入青蒿，经卡那霉素筛选得到抗性苗，再经过pcr进行阳性检测后得到转基因青蒿植株。
28.步骤五，取步骤四所述转基因青蒿植株提取青蒿素，采用hplc
‑
elsd法测定青蒿素含量，获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。
29.本发明通过对青蒿转录组数据库中myb类转录因子进行分析，从青蒿中克隆aamyb15基因，构建含aamyb15基因的反义干扰表达载体，用根癌农杆菌eha105介导，采用叶盘法将aamyb15基因反义干扰表达载体转化青蒿；pcr检测外源目的基因aamyb15的整合情况，通过高效液相色谱
‑
蒸发光散射检测器(hplc
‑
elsd)测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的转基因青蒿的青蒿素含量显著提高。
30.在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿aamyb15蛋白多肽时，可以将青蒿aamyb15蛋白编码序列可操作地连于植物表达调控序列，从而形成青蒿aamyb15蛋白表达载体。
31.如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性dna序列的某些部分能够影响同一线性dna序列其他部分的活性。例如，如果信号肽dna作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)dna就是可操作地连于多肽dna；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
32.本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)，菌株分别有gv3101、gv3101(psoup19)、eha105，上述菌株均可以从市场上公开购买。
33.本发明的优点是：发现了负向调控青蒿素生物合成的转录因子aamyb15,对青蒿素生物合成途径中的四个关键酶具有显著抑制作用。本发明还通过截取上述转录因子基因的编码区，扩增出与原有基因序列反向互补的序列，构建phb
‑
aamyb15
‑
antisense反义干扰载体，抑制该基因在青蒿中的表达，从而显著地提高转基因植株中青蒿素的含量。本发明通过修改基因序列，运用基因工程手段改变青蒿植株中相应基因的表达情况，提高了青蒿素的产量，为代谢调控提高青蒿素产量提供了新的策略。
附图说明
34.图1是烟草瞬时转化aamyb15显著抑制ads、cyp71av1、dbr2和aldh1基因启动子的活性；其中a为ads，b为cyp71av1，c为dbr2，d为aldh1。
35.图2是aamyb15转录因子在青蒿中调控青蒿素表达量；其中过量表达株系(oe
‑
aamyb15)示出了显著降低的青蒿素含量，反义干扰表达株系(an
‑
aamyb15)示出了显著提高的青蒿素含量。
36.上述附图中，*表示与对照有显著差异，**表示与对照有极显著差异。
具体实施方式
37.下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
38.实施例1、青蒿aamyb15基因的克隆
39.1.青蒿基因组总rna的提取
40.取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5ml eppendorf(ep)离心管中，充分振荡后，按照tiangen试剂盒的说明书抽提总rna。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna浓度。
41.2.青蒿aamyb15基因的克隆
42.以所提取的青蒿总rna为模板，根据rna浓度计算用量，在powerscript反转录酶的作用下得到cdna；根据aamyb15基因的核苷酸序列(seq id no:1)设计基因特异性引物，通过pcr从总cdna中扩增aamyb15基因，pcr产物经过回收纯化后，连接平末端plb载体(天根生化有限公司产品)并测序，获得plb
‑
aamyb15质粒载体，提取质粒后测序。
43.通过上述步骤，获得了青蒿中aamyb15转录因子的编码序列(seq id no:1)并推导出其蛋白编码序列(seq id no：2)，其中，起始密码子为atg，终止密码子为taa。
44.实施例2、含aamyb15基因的植物表达载体的构建
45.1.过量表达载体phb
‑
aamyb15
‑
yfp的构建
46.从测序正确的平末端载体plb中扩增aamyb15基因，将其构建在植物表达载体phb
‑
yfp上，为了方便表达载体的构建，正向引物引入了bamhi的酶切位点，反向引物引入了spei的酶切位点，引物序列如下：
47.正向引物myb15
‑
yfp
‑
f:seq id no.3
48.反向引物myb15
‑
yfp
‑
r:seq id no.4
49.2.反义干扰表达载体phb
‑
aamyb15
‑
antisense的构建
50.将测序正确的aamyb15核苷酸序列反向互补后，再设计引物，从平末端载体plb中扩增aamyb15基因的反向互补序列，并将其构建在植物表达载体phb
‑
yfp上，为了方便表达载体的构建，正向引物引入了spei的酶切位点，反向引物引入了bamhi的酶切位点，引物序列如下：
51.正向引物anti
‑
myb15
‑
f:seq id no.5
52.反向引物anti
‑
myb15
‑
r:seq id no.6
53.实施例3、青蒿素生物合成关键酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1启动子双荧光素报告载体的构建
54.1.pcr扩增青蒿素生物合成关键酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1的启动子
55.根据ncbi数据库中青蒿素生物合成四个关键酶基因的序列信息，分别设计ads、cyp71av1、dbr2和aldh1的启动子扩增特异性引物，在引物上下游分别加入hindiii和psti酶切位点。
56.2.将启动子片段连入双荧光素报告载体
57.利用同源重组的方法，通过clonexpress ii one step cloning kit(诺唯赞，南京)试剂盒构建到pgreenii0800
‑
luc载体上，获得植物双荧光素检测报告载体pgreenii0800
‑
proads、pgreenii0800
‑
procyp71av1、pgreenii0800
‑
prodbr2和pgreenii0800
‑
proaldh1。
58.实施例4、烟草瞬时转化检测转录因子aamyb15对关键酶基因ads、cyp71av1、dbr2和aldh1启动子的抑制作用
59.1.农杆菌工程菌株的获得
60.将phb
‑
yfp空载体和实施例2中含aamyb15核苷酸序列的植物表达载体phb
‑
aamyb15
‑
yfp采用冻融法转入根癌农杆菌gv3101，并将实施例3中植物双荧光素检测报告载体pgreenii0800
‑
proads、pgreenii0800
‑
procyp71av1、pgreenii0800
‑
prodbr2和pgreenii0800
‑
proaldh1。采用冻融法转入带有psoup辅助质粒的根癌农杆菌gv3101，分别获得含有空载体、aamyb15基因和ads、cyp71av1、dbr2和aldh1基因启动子的农杆菌工程菌株。
61.2.瞬时转化烟草
62.将上述农杆菌工程菌株的阳性菌株按1:100的比例接种在10ml液体培养基中扩大培养，28℃培养过夜；4500rpm离心10min收集菌体；使用ms液体培养基重悬菌体，并且用ms液体培养基将各个菌液浓度稀释到od
600
为0.6；加入终浓度为200μmol/l的乙酰丁香酮(as)和10mmol/l的mes(ph 5.7)，室温静置3h备用。
63.将包含phb
‑
aamyb15
‑
yfp和空载体的农杆菌工程菌株分别与包含pgreenii0800
‑
proads、pgreenii0800
‑
procyp71av1、pgreenii0800
‑
prodbr2和pgreenii0800
‑
proaldh1植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株按1:1比例混合后，通过1ml无针头注射器注射侵染的方式注射到生长4
‑
5周的烟草叶片中,弱光培养48h。
64.3.dual
‑
luciferase检测
65.取培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末。使用promega公司的reporter assay system试剂盒和glomax 20/20luminometer荧光检测仪检测荧光强度，按照试剂盒说明书进行操作。
66.实施例5、根癌农杆菌介导的aamyb15过量表达和反义干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株
67.1.含aamyb15过量表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
68.将实施例2中含aamyb15的植物过量表达和反义干扰表达载体通过冻融法转入根癌农杆菌(eha105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚cambia公司购得，菌株编号为gambar 1)，并用实施例2中的引物进行pcr检测验证。阳性结果表明，含aamyb15的植物过量表达和反义干扰载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
69.2.根癌农杆菌介导aamyb15基因转化青蒿
70.2.1.外植体的预培养
71.青蒿种子用75％乙醇浸泡1min后离心，无菌水洗2
‑
3次，再用20％naclo浸泡20min，无菌水冲洗4
‑
5次，接种于无激素的ms(murashige and skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，发芽后即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
72.2.2.农杆菌与外植体的共培养
73.将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2ms+as 100μmol/l)中，滴加含活化好的所述含aamyb15植物过表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2ms悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2ms液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
74.2.3.抗性再生植株的筛选
75.将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(ms+6
‑
ba 0.5mg/l+naa 0.05mg/l+kan 50mg/l+cb 500mg/l)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2
‑
3次继代后即可获得kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2ms+cb 125mg/l)上培养至生根，从而获得kan抗性再生青蒿植株。
76.3.转基因青蒿植株的pcr检测
77.根据aamyb15的基因序列和植物phb
‑
yfp载体序列分别设计正向检测引物和反向检测引物对过表达植株和反义干扰植株进行阳性检测。结果表明，利用所设计的pcr特异检测引物，能扩增出特异dna片段。而以非转化青蒿基因组dna为模板时，没有扩增出任何片段。
78.本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌eha105，获得用于转化青蒿的含aamyb15核苷酸序列的植物过量表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经pcr检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。
79.实施例6、利用hplc
‑
elsd测定转基因青蒿中青蒿素含量
80.1.hplc
‑
elsd条件及系统适用性以及标准溶液的配制
81.hplc：采用water alliance 2695系统，色谱柱为c
‑
18反相硅胶柱(symmetryshieldtm c18，5μm，250
×
4.6mm，waters)，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl，灵敏度(aufs＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
82.elsd：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
83.精密称取青蒿素标准品(sigma公司)2.0mg用1ml甲醇完全溶解，得到2mg/ml青蒿素标准品溶液，保存于
‑
20℃备用。
84.本发明中流动相为甲醇(methanol):水，比例为70％:30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
85.2.标准曲线的制作
86.将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(y)对标准品含量(x,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青
蒿素在4
‑
20μg范围内呈现良好的log
‑
log线性关系。青蒿素对照品的log
‑
log线性回归方程为：y＝1.28e+000x+4.71e+000，r＝0.979546。
87.3.样品的制备和青蒿素含量的测定
88.在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2ml eppendorf管中，加入2ml甲醇(1ml甲醇萃取2次)，用40w超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即得到青蒿素甲醇溶液，用于hplc
‑
elsd测定。
89.采用hplc
‑
elsd测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
90.本实施例采用hplc
‑
elsd法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化aamyb15过量表达载体的代谢工程策略，发现aamyb15基因的反义干扰表达可显著提高转基因青蒿植株中青蒿素的含量，为利用该基因进行转录调控研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。
91.本发明涉及的青蒿myb类转录因子aamyb15能够提高植物中青蒿素含量，将所述转录因子的编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，在非转化的野生型青蒿中青蒿素含量为12.9mg/g dw时，同时期转aamyb15过量表达载体青蒿中青蒿素的含量平均8.5mg/g dw，aamyb15反义干扰表达青蒿中青蒿素含量则平均为18.7mg/g dw。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列规模化生产青蒿素打下了坚实的基础。
92.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。