1.本发明属于生物医学
技术领域：
：，涉及肿瘤标志物的开发和应用，具体涉及yy1的酸响应序列作为肿瘤标志物的检测方法和评价标准以及yy1蛋白存在酸响应序列及其在抗肿瘤靶向药物开发中的潜在干预应用。
背景技术：
：：2.yy1(yinyang1，nf-e1,ucrbp或cf1)是1991年由施阳教授发现[1,2]，是一个高度保守的锌指转录因子[3-5]，属于人类gli-kruppel蛋白家族[2]，参与转录激活、转录抑制、转录启始和染色质修饰。yy1在哺乳动物细胞和组织中广泛表达，在约10％的人类基因和重复序列中发现其结合位点[6]。人类yy1cdna的开放阅读框编码414个氨基酸的蛋白质，其分子量为44kda。然而，可能是由于yy1蛋白质结构的原因，其在sds凝胶上分子量大小是65-68kda。yy1的c端是非常保守的锌指结构域，与序列特异性的dna结合，发挥激活或抑制功能。靠近n端的氨基酸43-53区域是由连续11个酸性氨基酸组成的，氨基酸70-80区域由连续11个组氨酸组成，均位于yy1的激活结构域；yy1中间氨基酸154-201区域有很高比例的甘氨酸和丙氨酸残基，位于yy1的抑制域。因此，在yy1中有两个抑制域，一个与锌指结构域，另一个是富含甘氨酸的氨基酸154-226区域[7]。yy1参与调控细胞分化、胚胎发育和肿瘤发生等多种生物学过程[8-13]，可调控多种致瘤性病毒的生活周期，调控肿瘤发生发展，yy1抑制hpv基因组e6和e7基因的转录，抑制ebv和kshv裂解复制开关基因的激活，因而在致癌性人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)[14-16]、eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)[17-20]、卡波氏肉瘤病毒(kshv)[21-23]相肿瘤中yy1可能发挥抑制肿瘤进展的作用。很多研究结果表明yy1可通过多种机制促进hbv相关肝癌[24-27]，肝细胞癌[28-32]、结直肠癌[33-40]、胶质瘤[41-43]、肺癌[44-46]、神经母细胞瘤[47]、和wilms肿瘤[48]的发展，与患者的不良预后呈正相关；可抑制食管鳞状细胞癌的发展[49]；但在鼻咽癌[50,51]和乳腺癌[52-54]中的促癌或抑癌作用存在争议，有待进一步研究。许多研究数据亦显示yy1表达水平与肿瘤分级和预后密切相关，已成为潜在的肿瘤预后评价指标和治疗靶点。[0003]肿瘤微环境(tumormicroenvironment,tme)是一个由肿瘤细胞及其周围的成纤维细胞、免疫细胞、周细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经元细胞及细胞外基质组成的复杂的动态系统[55]。正常细胞的胞外环境是ph为7.4的中性环境，而肿瘤细胞特别是实体瘤由于发生“warburg效应”导致酸的产生，特别是乳酸和二氧化碳的产生，导致肿瘤微环境的酸化。在物理ph值下，乳酸99％以上解离成乳酸根阴离子和氢离子(h+)。乳酸脱氢酶是一类依赖nad+的酶，活化状态的ldh是一种同(或异)四聚体分子，由两种不同的亚基组成：乳酸脱氢酶a(ldha)和乳酸脱氢酶b(ldhb)。ldha和ldhb在肿瘤细胞代谢中发挥调节丙酮酸和乳酸的双向转化的作用，ldha对丙酮酸有较高的亲和力，在厌氧条件下优先将丙酮酸转化为乳酸，将nadh转化为nad(+)，而ldhb对乳酸有较高的亲和力，在氧充足时优先将乳酸转化为丙酮酸，将nad(+)转化为nadh[56]。[0004]乳酸被大量免疫细胞募集到肿瘤部位，在破坏免疫监视中起关键作用。乳酸被认为是一个关键组分,导致免疫抑制肿瘤微环境的产生[57]。癌症细胞和免疫细胞(主要是t和自然杀伤细胞,nk细胞)之间的代谢竞争是肿瘤进展的重要因素,warburg代谢效应竞争性地为癌细胞提供优势，导致细胞外葡萄糖的消耗和大量乳酸的释放，从而引起肿瘤浸润的t细胞功能失调[58]。高表达mct4的胰腺癌细胞对周围的免疫环境也产生了不利影响[59]。在高表达ldha的黑素瘤中乳酸的积累，会抑制t细胞和nk细胞的生存，导致肿瘤免疫逃逸[60]。肿瘤微环境中的树突状细胞和dc细胞也受到乳酸积累的影响。内源性乳酸的积累使dc细胞向耐受表型分化，导致发生免疫耐受。大量的酸化会干扰炎性细胞因子的产生，而炎性细胞因子是th1细胞极化和炎性dc细胞分化所必需的[61]。乳酸促进抗原降解，抑制mhci类抗原递呈能力，从而导致dc细胞无法启动抗肿瘤反应[62]。[0005]乳酸在驱动癌症免疫逃避中还发挥信号作用。乳酸通过促进toll样受体(tlr)介导的单核/巨噬细胞中il-23的转录，发挥促炎介质的作用，维持il-23依赖的il-17的分泌，使免疫反应向th17型极化[63]。乳酸通过诱导血管内皮生长因子的表达和诱导m2型tams极化，在信息传递中起关键作用[64]。[0006]乳酸盐可以作为细胞外配体，其中g蛋白偶联受体81(gpr81，也被称为hcar1)是一种乳酸受体[65]。激活的gpr81可通过调节乳酸响应机制，从而维持肿瘤生长和转移[66]，乳酸/gpr81通路也在抑制免疫监视中起作用[67]。此外，gpr132是巨噬细胞中特异性表达的一种乳酸传感器/受体，通过促进m2表型极化，调控乳腺肿瘤和巨噬细胞的相互作用，从而促进肿瘤转移[68,69]。乳酸直接与氧传感器(如ndrg3)结合，防止其与phd2的结合及降解，增加ndrg3蛋白质的稳定性，促进血管生成和细胞生长[70]。[0007]乳酸在调节血管生成、缺氧、巨噬细胞极化、t细胞活化和肿瘤免疫监测等多种生物过程中发挥关键作用，与多种疾病密切相关，包括肿瘤增生、脓毒症和自身免疫性疾病[60,64,71]。乳酸微环境从代谢调控、免疫调控等诸多方面促进多种肿瘤的发生发展和侵袭转移，乳酸不止是一种代谢产物，亦是细胞代谢的重要参与者，乳酸可作为一种信号分子，直接与胞内受体mavs结合，进而抑制rlr介导的干扰素的产生，在提高宿主免疫水平、病毒清除和癌症免疫监测方面起着关键作用。同时乳酸作为桥梁将能量代谢和先天免疫联系起来[72]。乳酸使组蛋白发生乳酸化修饰，调控相关基因表达，使m2巨噬细胞发生极化[71,73]。smad5通过发生核质转移响应细胞内ph的变化，维持细胞的生物能稳态[74]。那么作为在哺乳动物细胞和组织中广泛表达的重要蛋白yy1，是否可响应乳酸酸性微环境进而影响多种肿瘤的恶性进展？[0008]酸性代谢物的大量产生和向细胞外酸输出的增强导致肿瘤微环境的持续酸化，乳酸浓度升高是肿瘤代谢适应的良好指标，乳酸脱氢酶a(ldha)表达升高与多种肿瘤预后不良有关[60]。由于乳酸可以促进肿瘤的发生发展，针对乳酸产生和运输的分子机制，产生了许多癌症治疗策略。靶向乳酸的代谢和转运是癌症治疗有前途的方法。mct1和mct4表达增加与前列腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤和胃肠道间质瘤预后不良有关。使用mct1抑制剂可有效抑制肿瘤生长。靶向mct1/2的抑制剂az3965对表达mct1的伯基特淋巴瘤、乳腺癌、胃癌和小细胞肺癌(sclc)模型的治疗有效[75,76]。有研究报道mct4可作为治疗结直肠癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌的潜在靶点[77-80]。靶向mct4的抑制剂az93具有高效性和选择性，目前正用于临床前研究[81]。化合物7-氨基-羧酸香豆素(7accs)通过干扰mct1/4，阻碍线粒体丙酮酸的转运，促进细胞内丙酮酸的积累，从而抑制细胞外乳酸的摄取[82]。靶向ldh酶介导丙酮酸与乳酸盐的双向转化的棉酚(at-101)衍生物fx-11、游离黄素和n-羟基吲哚类化合物等治疗方法[83]，但是由于代谢重编程在肿瘤发生和治疗适应中发挥作用，ldh表达亚型的转变可能在肿瘤进展过程中发生[84]，因而可能影响治疗效果。[0009]目前已经研发出多种基于肿瘤酸性微环境的恶性肿瘤诊断和治疗策略，如ph响应型氧化铁纳米颗粒[85]、依赖肿瘤微环境激活的nir-ii纳米渗透系统(fead1)[86]、ph响应的auncs@mof-dox纳米探针[87]、聚乙二醇化透明质酸纳米药物递送系统[88]等纳米颗粒技术。[0010]与本发明有关的参考文献[0011]1.seto,e.,y.shi,andt.shenk,yy1isaninitiatorsequence-bindingproteinthatdirectsandactivatestranscriptioninvitro.nature,1991.354(6350):p.241-5.[0012]2.shi,y.,etal.,transcriptionalrepressionbyyy1,ahumangli-kruppel-relatedprotein,andreliefofrepressionbyadenoviruse1aprotein.cell,1991.67(2):p.377-88.[0013]3.kim,j.d.,c.faulk,andj.kim,retropositionandevolutionofthedna-bindingmotifsofyy1,yy2andrex1.nucleicacidsres,2007.35(10):p.3442-52.[0014]4.brown,j.l.,etal.,thedrosophilapolycombgroupgenepleiohomeoticencodesadnabindingproteinwithhomologytothetranscriptionfactoryy1.molcell,1998.1(7):p.1057-64.[0015]5.brown,j.l.,etal.,thedrosophilapho-likegeneencodesayy1-relateddnabindingproteinthatisredundantwithpleiohomeoticinhomeoticgenesilencing.development,2003.130(2):p.285-94.[0016]6.schug,j.,etal.,promoterfeaturesrelatedtotissuespecificityasmeasuredbyshannonentropy.genomebiol,2005.6(4):p.r33.[0017]7.shi,y.,j.s.lee,andk.m.galvin,everythingyouhaveeverwantedtoknowaboutyinyang1.biochimbiophysacta,1997.1332(2):p.f49-66.[0018]8.kleiman,e.,etal.,yy1playsanessentialroleatallstagesofb-celldifferentiation.procnatlacadsciusa,2016.113(27):p.e3911-20.[0019]9.wang,j.,etal.,yy1positivelyregulatestranscriptionbytargetingpromotersandsuper-enhancersthroughthebafcomplexinembryonicstemcells.stemcellreports,2018.10(4):p.1324-1339.[0020]10.lu,z.,etal.,polycombgroupproteinyy1isanessentialregulatorofhematopoieticstemcellquiescence.cellrep,2018.22(6):p.1545-1559.[0021]11.he,y.,etal.,thetranscriptionfactoryinyang1isessentialforoligodendrocyteprogenitordifferentiation.neuron,2007.55(2):p.217-30.[0022]12.gregoire,s.,etal.,essentialandunexpectedroleofyinyang1topromotemesodermalcardiacdifferentiation.circres,2013.112(6):p.90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白表达水平，结果如图1a所示，la处理显著降低lcl和dg75细胞的yy1蛋白表达水平，降低b95.8细胞的yy1蛋白水平，同时，nala或h+处理均能降低lcl、b95.8和dg75细胞的yy1蛋白表达水平。在lcl和b95.8细胞中，la处理显著降低yy2蛋白表达水平，nala或h+处理均能降低yy2蛋白表达水平；在dg75细胞中，h+处理显著降低yy2蛋白表达水平，la或nala处理对yy2蛋白表达水平无影响。[0138]ebv与kshv均属于gamma疱疹病毒亚科，同为人类致瘤病毒，具有相似的生活周期：潜伏感染期和裂解复制期，为了验证la、nala或h+处理是否会降低kshv染毒细胞系bcbl1的yy1和yy2蛋白表达水平，选择kshv染毒细胞系bcbl1、ebv染毒细胞系akata-ebv和kshv、ebv双阴性细胞系akata，分别用la、nala或h+处理12h或24h，westernblot实验检测yy1和yy2的蛋白表达水平，如图1b所示，在kshv染毒细胞系bcbl1、ebv染毒细胞系akata-ebv和kshv、ebv双阴性细胞系akata中，la、nala或h+处理12h或24h均能不同程度地降低yy1和yy2的蛋白表达水平，并且la处理的效果较nala或h+处理效果更明显。为了进一步验证la处理是否影响kshv染毒内皮细胞系islk-bac16和kshv阴性的内皮细胞系islkyy1和yy2的表达水平，使用10mm和20mmla处理islk和islk-bac1624h，如图1c所示，20mmla显著降低yy1的蛋白表达水平，对yy2蛋白表达水平影响较小。综上，乳酸(lacticacid，la)降低ebv染毒细胞、kshv染毒细胞、ebv和kshv双阴性细胞yy1的蛋白表达水平。[0139]2.外源性乳酸酸性条件下调不同细胞来源的hpv阳性或阴性相关肿瘤细胞系中yy1蛋白表达水平。[0140]进一步分别选取了三株宫颈癌细胞系c33a、hela和caski，其中hela和caski是hpv染毒的细胞系；三株结直肠癌细胞系hct116、sw480和rko；三株肝癌细胞系7721、hle和hlf，不同浓度的la(0mm、10mm、20mm、30mm)处理24h，westernblot检测yy1蛋白表达水平，如图1d所示，la促进yy1蛋白水平的下调表达。yy1对la的响应程度在不同细胞系中表现不同，但随la浓度的升高，yy1降低表达越明显。[0141]3.通过yy1蛋白表达水平预测临床b细胞淋巴瘤样品恶性程度：[0142]乳酸脱氢酶a(ldha)表达升高与多种肿瘤患者预后不良有关[60]。在临床上，通过ldh检测试剂盒对患者血清中ldh的含量进行检测，将ldh《250u/l(4.12μkat/l)规定为正度。[0191]实施例2:细胞代谢产生的内源性乳酸下调yy1蛋白表达水平。[0192]以上实验证明外源添加乳酸降低肿瘤细胞yy1的蛋白表达水平，因此我们想要探究细胞代谢产生的内源性乳酸是否发挥降低yy1蛋白表达的作用。细胞内乳酸的主要来源是葡萄糖，我们用不同浓度的葡萄糖(glucose)分别处理bjab、hela和lcl细胞24h，使用胞内乳酸检测试剂盒检测细胞内乳酸的含量，如图2a所示，葡萄糖以剂量依赖性的方式促进胞内乳酸的产生。[0193]为了证明乳酸的产生确实是由添加的葡萄糖经过代谢产生的，于是我们使用不可代谢的葡萄糖类似物2-脱氧-d-葡萄糖(2-dg)作对照，分别处理bjab、hela和lcl细胞24h，使用胞内乳酸检测试剂盒检测细胞内乳酸的含量，如图2b所示，2-dg阻止乳酸的产生。乳酸的产生取决于糖酵解和线粒体代谢的平衡,我们想探究参与这两个途径的酶活性是否可以调控乳酸水平，进而调控yy1的蛋白表达水平。草氨酸盐(oxamate)可通过调控乳酸脱氢酶ldh的活性抑制乳酸的产生。相反地，鱼藤酮(rotenone)通过抑制线粒体呼吸链复合体i，导致细胞转向糖酵解代谢，从而促进胞内乳酸的产生，如图2c所示。为了检测oxamate和rotenone对细胞内乳酸产量的影响，我们选用10mm的oxamate和rotenone处理lcl细胞24h，检测细胞内乳酸产量，结果显示(图2d)，oxamate可抑制乳酸的产生，而rotenone促进细胞内乳酸产生。已经证实了葡萄糖可以促进胞内乳酸的产生，2-dg抑制胞内乳酸的产生，于是我们用不同浓度的葡萄糖(glucose)或2-dg分别处理bjab、hela和lcl细胞24h，westernblot检测yy1蛋白表达水平，如图2e所示，葡萄糖处理以剂量依赖性的方式降低yy1蛋白表达水平，2-dg处理对yy1蛋白表达水平基本无影响。这表明葡萄糖诱导产生的乳酸以剂量依赖性的方式降低yy1蛋白表达水平。为了检测oxamate和rotenone调控产生的胞内乳酸对yy1蛋白水平的影响，我们用不同浓度的oxamate和rotenone分别处理bjab、hela和lcl细胞24h，westernblot检测yy1蛋白表达水平，如图2e所示，rotenone诱导产生的乳酸以剂量依赖性的方式降低yy1蛋白表达水平。[0194]实施例3:敲除yy1促进hpv阳性细胞和ebv阳性细胞的体内体外成瘤能力。[0195]1.乳酸酸性微环境通过下调yy1的表达促进lcl细胞体外克隆形成能力[0196]为了研究乳酸酸性环境介导的yy1下调表达对肿瘤恶性增殖产生的影响，我们选择了ebv染毒b淋巴细胞lcl进行研究，我们构建了两株稳定敲低yy1的lcl细胞系及一株稳定敲低无关序列的对照细胞系，分别为lcl-shyy1-1、lcl-shyy1-2和lcl-shctrl，经过westernblot检测验证，如图3a所示，这三株稳定细胞构建成功，且lcl-shyy1-1的敲低效果更好。已经验证稳定敲低yy1的lcl细胞系构建成功，接下来，通过悬浮细胞软琼脂克隆形成实验，对la、nala介导的yy1下调表达对lcl细胞体外克隆形成能力的影响进行研究，初始接种lcl-shyy1-1、lcl-shyy1-2和lcl-shctrl的细胞数均为0.6ꢀ×103，每隔两天更换新鲜培养基，同时分别添加10mmla和10mmnala，连续培养两周，结果如图3b所示，相较于未敲低组(shctrl)，敲低yy1促进lcl细胞的体外克隆形成能力；相较于shyy1-2，shyy1-1促进lcl细胞体外克隆形成能力更强；相较于mock组，la和nala处理促进lcl-shctrl细胞体外克隆形成能力，显著促进lcl-shyy1-1、lcl-shyy1-2细胞体外克隆形成能力，且更加显著促进lcl-shyy1-1细胞体外克隆形成能力。这表明乳酸酸性环境介导的yy1下调表达促进lcl细胞体外克隆形成能力，且yy1表达水平越低，lcl细胞克隆形成的能力越强。[0197]2.乳酸酸性微环境通过下调yy1的表达促进ebv相关b淋巴细胞瘤恶性增殖[0198]由于lcl细胞来源于ebv感染野生株，于是我们选用lcl-luci-shyy1和lcl-luci-shctrl两株细胞以相同的细胞数(1x107)腹腔注射nod/scid小鼠，构建ebv相关b淋巴瘤nod/scid小鼠腹腔成瘤模型。为了在小鼠体内模拟肿瘤微环境的形成，每隔两天进行腹腔注射nala(0.5g/kg)，同时腹腔注射相同体积的pbs作对照。结果显示(图3c)，腹腔注射4周之后，相较于lcl-luci-shctrl，lcl-luci-shyy1在nod/scid小鼠腹腔的成瘤和生长能力增强(fc:25.1vs35.6)；相较于mock组，nala组小鼠腹腔的成瘤和生长能力增强明显高于pbs组(fc:25.1vs61.2；35.6vs165)。这一结果与lcl细胞体外克隆形成实验结果一致。综合lcl细胞体内体外成瘤实验，结果表明，乳酸酸性微环境通过下调yy1的表达进而促进ebv相关b淋巴细胞瘤恶性增殖。[0199]3.乳酸酸性微环境通过下调yy1的表达促进hela细胞体外克隆形成能力[0200]以上实验表明乳酸酸性环境通过下调yy1的表达促进lcl细胞体外克隆形成、侵袭和迁移能力，促进ebv相关b淋巴细胞体内成瘤和生长能力。为了探究乳酸酸性环境介导的yy1下调表达对实体瘤恶性增殖产生怎样的影响，我们选择hpv染毒宫颈癌细胞hela作为研究对象，构建了两株稳定敲低yy1的hela细胞系及一株稳定敲低无关序列的对照细胞系，分别为hela-shyy1-1、hela-shyy1-2和hela-shctrl，经过westernblot检测验证，如图4a所示，这三株稳定细胞构建成功，且hela-shyy1-1的敲低效果更好。进一步通过平板克隆形成实验，对la、nala介导的yy1下调表达对hela细胞体外克隆形成能力的影响进行研究，初始接种hela-shyy1-1、hela-shyy1-2和hela-shctrl的细胞数均为0.6×103，每隔两天更换新鲜培养基，同时分别添加20mmla和20mmnala，连续培养两周，结果如图4b所示，相较于shctrl，敲低yy1促进hela细胞的增殖能力；相较于hela-shyy1-2，hela-shyy1-1的克隆形成能力稍强；相较于mock组，la和nala处理促进hela-shyy1-1细胞体外克隆形成能力。这表明乳酸酸性环境介导的yy1下调表达促进hela细胞体外克隆形成能力。[0201]4.乳酸酸性微环境通过下调yy1的表达促进hpv相关宫颈癌恶性增殖[0202]由于hela细胞来源于hpv阳性人宫颈癌组织，于是我们选用hela-luci-shyy1-1和hela-luci-shctrl两株细胞以相同的细胞数(1×107)与martrigel混匀皮下注射balb/cnude小鼠，构建hpv相关宫颈癌balb/cnude小鼠皮下成瘤模型。为了在小鼠瘤体中模拟肿瘤微环境的形成，每隔两天进行瘤内注射nala(1g/kg)，同时瘤内注射相同体积的pbs作对照。结果显示(图4c)，相较于hela-luci-shctrl，hela-luci-shyy1在balb/cnude小鼠皮下成瘤和生长能力增强，且nala组小鼠皮下的成瘤和生长能力增强明显高于pbs组，这一结果与hela细胞体外克隆形成实验结果一致。综合hela细胞体内体外成瘤实验，结果表明，乳酸酸性微环境通过下调yy1的表达进而促进hpv相关宫颈癌恶性增殖。[0203]1)平板克隆形成实验步骤：[0204]选用hpv阳性的宫颈癌hela细胞，进行乳酸(la)和乳酸钠(nala)处理。[0205]a.将0.3×103个hela细胞接种于六孔板，加入2mldmem培养基，于培养箱培养。[0206]b.每隔2天更换一次新鲜培养基，每次更换培养基时分别加入20mmla或20mmnala。[0207]c.培养14天观察到明显克隆集落形成，终止培养，进行结晶紫染色。[0208]d.弃培养基，1×pbs轻柔洗一次。加入2ml4％多聚甲醛，室温避光固定15min。[0209]e.1×pbs轻柔洗一次，加入2ml0.1％结晶紫，室温避光染色15min。[0210]f.1×pbs轻柔洗三次，吸弃1×pbs，晾干后使用高质量扫描仪进行图片扫描。[0211]2)悬浮细胞成瘤-软琼脂克隆形成实验步骤：[0212]a.配置4％的低熔点琼脂琼脂溶液：称取0.8g低熔点琼脂粉溶解在20ml超纯水中，进行高压蒸汽灭菌。[0213]b.将4％的低熔点琼脂琼脂溶液置于预热的56℃水浴锅中。[0214]c.提前预热含10％fbs的rpmi1640培养基(含10mmla或10mmnala)。[0215]d.迅速用预热的培养基配置0.75％下层琼脂，取2ml配置均匀的0.75％下层琼脂琼脂加入六孔板，避免气泡产生，室温静置放置直至凝固。[0216]e.用含0.6x103个悬浮细胞的10％fbsrpmi1640培养基配置0.36％的琼脂2ml，加入到已凝固0.75％琼脂的上层。[0217]f.室温静置放置直至凝固。凝固后，转移至37℃细胞培养箱培养。[0218]g.期间根据情况可补充适宜新鲜1640培养基(含10mmla或10mmnala)继续培养。[0219]h.培养2-3周左右观察到明显克隆集落形成，可终止培养，吸出琼脂培养基内多余的培养基。[0220]i.配置含2％乙醇的0.1％结晶紫染液，室温避光染色2h[0221]j.1×pbs轻柔洗涤数次，直至克隆集落清晰可见。[0222]3)balb/cnude皮下荷瘤模型[0223]a.购买4-5周龄雌性bala/cnude小鼠，每笼5只小鼠，适应性饲养于清洁级鼠房一周。[0224]b.按照体重，随机分为4组，并使用打耳洞的方式给每只小鼠编号做标记。[0225]c.按每个荷瘤需要1×107个细胞的数量培养hela-shctrl和hela-shyy1细胞。[0226]d.1×pbs洗细胞两次，按每个荷瘤1×107细胞重悬于200l无血清无抗生素的dmem培养基，并与200l高浓度matrigel混匀，转移到无菌ep管，置于冰上，准备小鼠皮下注射。[0227]e.正确抓取小鼠，并对准备注射部位进行酒精棉擦拭消毒，将准备好的细胞与matrigel的混合液注射到小鼠背部皮下。[0228]f.继续饲养，每两天瘤内注射一次乳酸钠(1g/kg小鼠体重)，注射相同体积的1×pbs作对照。[0229]g.每周称量并记录体重等信息，注意观察小鼠生长状况。[0230]4)nod/scid鼠体内成瘤模型[0231]a.购买4-5周龄雌性nod/scid小鼠，每笼5只小鼠，适应性饲养于清洁级鼠房一周。[0232]b.按照体重，随机分为4组，并使用苦味酸给每只小鼠编号做标记。[0233]c.按每只小鼠需要注射1×107个细胞的数量培养lcl-shctrl和lcl-shyy1细胞。[0234]d.1×pbs洗细胞两次，按每只小鼠1×107细胞重悬于200l1×pbs，转移到无菌ep管，置于冰上，准备小鼠腹腔注射。[0235]e.正确抓取小鼠，并对准备注射部位进行酒精棉擦拭消毒，采用腹腔注射的方式将细胞从腹部注射入小鼠体内。[0236]f.每两天腹腔注射一次乳酸钠(1g/kg小鼠体重)，注射相同体积的1×pbs作对照。[0237]g.分别在细胞注射后第0周和第4周使用ivisspectrumimagingsystem(perkinelmer)，检测小鼠肿瘤信号。[0238]h.腹腔注射底物d-luciferin(150mg/kg),注射12min后进行成像,使用ivisspectrumimagingsystem(perkinelmer)进行肿瘤大小检测，采用曝光时间0.5s的荧光值进行分析。[0239]实施例4:乳酸(la)促进yy1由细胞核向细胞质转移[0240]为了说明乳酸(la)促进yy1由细胞核向细胞质转移，我们进行间接免疫荧光实验，如图5a直观的显示乳酸酸性环境下调yy1表达的现象，10mmla处理24h可使kshv染毒细胞bcbl1、kshv和ebv双阴性细胞dg75细胞核中的yy1表达降低，细胞质中的yy1增强。以yy2作为对照，10mmla处理24h并不影响yy2的核质定位。如图5b，10mmla处理24h可使ebv染毒细胞b95.8和lcl、kshv和ebv双阴性细胞bjab细胞核中的yy1表达降低，细胞质中的yy1增强。以yy2作为对照，10mmla处理24h并不影响yy2的核质定位。如图5c显示10mmla不影响hpv染毒宫颈癌hela细胞yy1的核质定位，20mm和30mmla处理24h可使yy1发生核质定位的变化，而yy2的核质定位不受la的影响。如图5d显示，20mmla处理使hela细胞核中的yy1表达降低，细胞质中的yy1表达增加。这表明，la促进yy1由细胞核向细胞质转移。[0241]悬浮细胞的免疫荧光[0242]将待用的玻片75％的乙醇洗一次，1×pbs洗2次，0.1％fsg浸润15min，小心吸弃上清，晾干。将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rpm离心3min，1×pbs重悬清洗细胞2-3次，小心吸弃上清。[0243]细胞用4％多聚甲醛室温避光固定25min，1200rpm离心3min，小心吸弃上清。用1ꢀ×pbs洗两遍，1200rpm离心3min，小心吸弃上清。10μl1×pbs重悬细胞，滴于处理好的玻片上，轻轻铺匀，37℃放置40min。[0244]加入1mlblockingbuffer封闭20min左右，同时准备配制一抗。将一抗按比例稀释到blockingbuffer中，14000rpm离心2min，除去杂质，吸取50μl点到封口膜上，将盖玻片上有细胞的一面朝下，与封口膜上的一抗结合，室温孵育1hr。[0245]将玻片放回到六孔板中，细胞面朝上，用blockingbuffer清洗三次。[0246]配制二抗:将二抗(1:500)稀释到blockingbuffer中，14000rpm离心2min，除去杂质，吸取50μl上清，点到封口膜上，细胞与二抗孵育，细胞面朝下，室温孵育1hr。[0247]将玻片放回到6孔板中，细胞面朝上，用blokingbuffer清洗2遍，用1×pbs洗一遍。[0248]1×pbs配dapi(1:1000)，14000rpm，离心2min，每孔加1ml，避光染5min，用1ꢀ×pbs洗2-3遍，将玻片按顺序避光晾干。[0249]封片：向载玻片上滴加20μlmountingmedium，将盖玻片含有细胞的一面朝下，盖到mountingmedium上，指甲油封片。荧光显微镜下观察实验结果。[0250]贴壁细胞的免疫荧光[0251]首先吸出贴壁细胞培养基，用1×pbs清洗细胞2-3次，小心吸弃上清。4％多聚甲醛室温避光固定20min，小心吸弃上清。1×pbs清洗细胞2-3次，小心吸弃上清。[0252]加入1mlblockingbuffer封闭15min左右。等待一抗的配制。其余步骤同悬浮细胞的免疫荧光。[0253]细胞核质分离[0254]收集25cm2flask的贴壁细胞，800rpm，离心3min。吸弃上清，加入预冷的1×pbs重悬，800rpm，离心3min，洗两次，吸弃上清。[0255]加入200μl含4种蛋白酶抑制剂的细胞质裂解液，轻柔重悬细胞，置于冰上5min，4℃12000rpm，离心5min。将上清转移至另一预冷的1.5mlep管中，此为细胞质蛋白质。[0256]向未转移的细胞沉淀中加入100μl细胞核裂解液，重悬细胞，置于冰上5min，4℃12000rpm，离心5min。吸取上清转移到1.5mlep管，此为细胞核裂解液。[0257]实施例5:yy1蛋白酸响应序列的预测及鉴定分析[0258]根据实施例4中证明yy1响应酸性环境向细胞质转移，通过对其氨基酸序列进行分析，同时对其蛋白质出核序列进行预测，发现了2个酸性氨基酸或碱性氨基酸序列聚集区域(分别为lar1，me和lar2，mh)以及3个潜在的蛋白质出核序列(分别为nes1,nes2和nes3)，如图6a所示。为进一步确认yy1蛋白酸响应序列的存在，我们构建了带rfp标签的不同yy1序列突变体，分别转染到293、mm、hela细胞中，结果显示yy1蛋白酸响应序列主要存在于lar2区域(图6b,6c,6e),并对在293、mm和hela3种细胞中的响应情况进行统计(图6e)。进一步检测了各yy1突变体的稳定性，发现在la的作用下，yy1-mh、yy1-nes2，yy1-nes3稳定性较yy1-me，yy1-wt，yy1-nes1高(图6f),并对其稳定性情况进行统计(图6g)。为了进一步确证yy1的lar2区域确实是yy1响应酸性环境的酸响应区域，选择稳定表达yy1-wt，yy1-mh,yfp的三株hela细胞系，分别使用不同浓度的la进行细胞培养，免疫荧光实验结果显示yy1的酸响应区域lar2突变后(yy1-mh)，la不能使yy1发生出核现象(图6h)，进一步证实yy1的酸响应序列为lar2。该序列对应的多肽称为yy1-mh。[0259]实施例6:yy1蛋白酸响应序列lar2突变抑制hela细胞体外克隆形成能力：[0260]为了进一步说明在酸性条件下yy1的酸响应序列介导yy1出核降解，进而促进肿瘤形成，我们进行了平板克隆形成实验，分别使用la和nala培养hela-yfp，hela-yy1-wt，hela-yy1-mh细胞，初始接种细胞数分别为0.3×103和0.6×103，每隔两天更换新鲜培养基，同时分别添加20mmla和20mmnala，连续培养两周，结果如图7所示，相较于hela-yfp，过表达yy1-wt或yy1-mh抑制hela细胞的克隆形成能力；相较于mock组，la和nala处理显著增强hela-yfp细胞体外克隆形成能力，略微增强hela-yy1-wt细胞体外克隆形成能力，对hela-yy1-mh的体外克隆形成能力没有影响。这表明乳酸酸性环境介导的yy1下调表达促进hela细胞体外克隆形成能力是通过yy1的酸响应序列lar2介导的。[0261]以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12当前第1页12