技术领域：
本发明属于食品微生物检测领域，特别涉及在食品样品中单增李斯特菌和细菌总数两项指标的快速同步多重检测及试剂盒。
背景技术：
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单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，能引起人畜的李氏菌病。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。菌落总数通常指细菌总数，用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，其在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
传统的培养法对单增李斯特菌的测量方法费时费力，如国标gb4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验》，该方法需要预增菌、增菌，培养，生化鉴定等一系列步骤，花费时间在72小时以上。
细菌总数的平板计数法也有很多缺点，如国标gb4789.2-2016《菌落总数测定》，该方法需要采样，稀释，倾注平板，培养等一系列步骤，花费时间48小时。
这两个方法都需要大量人工操作，费时费力，且单增李斯特菌和细菌总数两项指标的检测还必须分别进行。
尽管目前有许多新的技术被用于单增李斯特菌或细菌总数的快速检测，但是这些技术难以用于同单增李斯特菌和细菌总数的多重检测。比如现有生物芯片法无法识别全部种类的细菌；pcr方法仅能实现不同种类细菌的多重检测，无法实现细菌总数的检测。
流式分析技术有实现单增李斯特菌和细菌总数指标的多重检测的潜力，但是由于单增李斯特菌特异性荧光探针的开发存在许多技术困难，目前尚未有相关报道。
综上所述，快速检测，同步多重检测，且能同时检测单增李斯特菌和细菌总数，是食品微生物检验领域的实际需要，也是技术难点。
技术实现要素：
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本发明的第一目的是提供一种单增李斯特菌和细菌总数的快速同步多重检测方法，尤其是要满足以下要求：1、必须能够区分细菌和杂质；2、能够定量测量细菌总数；3、可以从总细菌中特异性识别并定量单增李斯特菌；4、快速同步得到检测结果。
本发明的第二目的是提供能达到上述目的的检测试剂盒。
本方法具有两个技术关键点：一是如何准确区分细菌和非细菌的颗粒；二是如何特异地识别单增李斯特菌。
针对上述问题，本发明人进行了如下工作：
1、开发能识别总细菌的荧光探针
由于细菌种类繁多，选用大肠杆菌作为革兰氏阴性菌的代表菌株，用金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌作为革兰氏阳性菌的代表菌株，用枯草芽孢杆菌作为芽孢形态细菌的代表菌株。拟通过对四个代表性菌株的研究，并对能够识别总细菌的荧光探针进行了开发和优化。
2、制备出适合的单增李斯特菌的特异性抗体
采用了偶联有绿色荧光探针的单增李斯特菌的抗体，对单增李斯特菌进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对单增李斯特菌的荧光进行分析。
适用于流式分析仪的单增李斯特菌抗体的筛选十分困难：
第一，单增李斯特菌血清型包括是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”13个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b。其中，分离自食物，动物和人类样品中的单增李斯特菌超过95％的菌株属于血清型1/2a、1/2b、1/2c和4b。因此，适用的单增李斯特菌抗体需能够特异性识别上述4个血清型的所有菌株。
第二，市面上常见的抗体主要用于elisa，ihc-fr，wb等实验。这些实验中，抗原抗体主要在固定相上进行反应，比如反应板。而流式分析技术中，抗原抗体的反应都在流动相中进行。因此流式分析技术需要亲和性好的抗体。
本发明制备了多个批次的、针对单增李斯特菌的抗体(实施例1)，才最终筛选出亲和性高，特异性好，适用于流式分析仪的单增李斯特菌抗体，命名为ab-1(实施例3、4)，现保存于中国计量科学研究院。
所述抗体的筛选经过三个步骤：
一、初步判断抗体能否在流动相内与单增李斯特菌反应，并初步评估抗体的特异性(实施例2)。
二、对单增李斯特菌抗体和抗原的亲和力进行分析，筛选亲和性高的单增李斯特菌抗体(实施例3)。
三、选择了12株单增李斯特菌(包含1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型)，和24株其它菌株，使用流式分析仪验证抗体能否特异性识别单增李斯特菌，能否区分单增李斯特菌和其它杂菌(实施例4)。
本发明确定适用于本发明目的单增李斯特菌抗体的技术指标是：
1、制备所述抗体所用免疫原为4个血清型单增李斯特菌菌株的特异性膜蛋白的混合物，所述4个血清型分别为1/2a、1/2b、1/2c和4b；
2、所述抗体可以在流动相内与单增李斯特菌发生反应；
3、所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对单增李斯特菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；
4、所述抗体与单增李斯特菌特异性菌体蛋白的亲和力kd应小于1×10-9；
5、所述抗体能够识别血清型为1/2a、1/2b、1/2c和4b的单增李斯特菌菌株。
达到上述要求的抗体均可用于本发明方法。
据此，本发明首次建立了一种采用流式分析技术快速同步多重检测单增李斯特菌和细菌总数的方法，其特征是：1)区分样品中的细菌和其它背景颗粒：使用可以标记全部细菌的红色荧光探针对细菌总数进行标记；2)区分样品中的单增李斯特菌和非单增李斯特菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的单增李斯特菌抗体，特异性标记样品中的单增李斯特菌；3)通过流式分析仪同时计数1)和2)产生的红色和绿色荧光信号，实现单增李斯特菌和细菌总数的同步定量检测。
所述单增李斯特菌抗体的技术指标如下：a)制备所述抗体所用免疫原为4个血清型单增李斯特菌菌株的特异性膜蛋白的混合物，所述4个血清型分别为1/2a、1/2b、1/2c和4b；b)所述抗体可以在流动相内与单增李斯特菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对单增李斯特菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与单增李斯特菌特异性菌体蛋白的亲和力kd应小于1×10-9；e)所述抗体能够识别血清型为1/2a、1/2b、1/2c和4b的单增李斯特菌菌株。
所述方法的单增李斯特菌和细菌总数的判定方法如下：对于一个颗粒产生的事件，如果仅检测到红色荧光，则判定为细菌，但不是单增李斯特菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定为单增李斯特菌；如果未检测到荧光，则判定为非细菌的杂质颗粒。
所述通过流式分析仪计数，是通过流式分析仪的散射光通道进行圈门，并通过双荧光通道检测所述红色和绿色荧光信号，从而计数单增李斯特菌和细菌总数；其中，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。所述圈门，其方法为：使用流式分析仪测量500nm标准微球和2500nm标准微球，在前向角散射光通道的直方图上，根据微球的信号位置进行圈门，下限在500nm，上限在2500nm。
所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。
所述流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度<10mesf，散射光灵敏度<50nm，荧光分辨率rsd<3％，散射光分辨率<3％；分析速度为1～30μl/min，检测时间为15～300s。
所述的检测方法，待检样品进行检测之前需要进行纯化处理；所述纯化，方法是将待测样品加入水中悬液，然后过滤收集滤液，将滤液离心并弃去上层液体，保留底部的沉淀，然后加入pbs重悬，得到纯化的样品菌悬液。
本发明用大量实验清楚公开了本发明的方法，详见实施例。其中：
实施例1为单增李斯特菌抗体的制备。
实施例2为单增李斯特菌抗体的初步筛选。
实施例3为抗原抗体的亲和力分析
实施例4为抗体的特异性评价。
实施例5-8为本专利建立的检测方法的评价。
实施例9为单增李斯特菌和细菌总数快速检测试剂盒成分。
以下是本发明一次实际检测的具体操作：
1、待测样品的纯化：
将25ml或25g待测样品加入225ml的去离子水，采用2.5μm～15μm孔径的滤膜对待测样品进行过滤，保留滤液。将滤液5000×g离心5min。弃去上层液体，保留底部的沉淀。加入2.5ml的pbs重悬沉淀，转移至新的离心管中，得到纯化的样品菌悬液。
2、纯化的菌悬液加入终浓度为1μg/ml的绿色荧光探针交联的单增李斯特菌抗体(gr-ab)和浓度为1μg/ml的红色荧光探针(rd)，混匀后避光孵育5～15min。
3、流式分析仪检测：激发光设置为450～500nm，分析速度为1～30μl/min，检测时间为15～300s，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。通过对圈门内的事件在双荧光通道进行分析，计算单增李斯特菌浓度和细菌总数。
本发明人验证了本检测方法的效果：
制备了单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的混合菌液，并得到10倍系列稀释的混合菌液。采用单增李斯特菌平板计数法和细菌总数倾注平板法对10倍系列稀释的混合菌液进行检测，并同时使用本方法对混合菌液中的单增李斯特菌和细菌总数进行检测。比较平板计数法和流式分析法的检测结果：对于单增李斯特菌检测，本方法与平板计数方法所得结果有良好的线性关系，说明本方法具有良好的准确性，且方法的检测下限为76cfu/ml；对于细菌总数检测，本方法与平板计数方法所得结果有良好的线性关系，说明本方法具有良好的准确性，且方法的检测下限为225cfu/ml。
根据上述本发明建立的检测方法，本发明还提供了一种快速同步多重检测样品中单增李斯特菌和细菌总数的试剂盒，其特征是具有：1、可以标记样品中全部细菌的红色荧光探针；2、使用绿色荧光探针通过化学基团交联的特异性单增李斯特菌抗体，可以区分样品中的单增李斯特菌和非单增李斯特菌；3、校准微球(500nm和2500nm)。
所述单增李斯特菌抗体的技术指标如下：a)制备所述抗体所用免疫原为4个血清型单增李斯特菌菌株的特异性膜蛋白的混合物，所述4个血清型分别为1/2a、1/2b、1/2c和4b；b)所述抗体可以在流动相内与单增李斯特菌发生反应；c)所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对单增李斯特菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；d)所述抗体与单增李斯特菌特异性菌体蛋白的亲和力kd应小于1×10-9；e)所述抗体能够识别血清型为1/2a、1/2b、1/2c和4b的单增李斯特菌菌株。
所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。
所述的试剂盒，还含有孔径2.5μm～15μm的滤膜。
在本发明的一个实例中，所述试剂盒包括以下成分：
1、可以标记样品中全部细菌的红色荧光探针，其荧光发射光谱在601nm～640nm；
2、使用绿色荧光探针通过化学基团交联的特异性单增李斯特菌抗体，可以区分样品中的单增李斯特菌和非单增李斯特菌；其中，绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm；
3、校准微球(500nm和2500nm)。
4、滤膜(2.7μm～15μm孔径)。
用本发明的试剂盒进行单增李斯特菌检测的操作方法，其特征为：
1、待测样品的纯化：
将25ml或25g待测样品加入225ml的去离子水，采用2.5μm～15μm孔径的滤膜对待测样品进行过滤，保留滤液。将滤液5000×g离心5min。弃去上层液体，保留底部的沉淀。加入2.5ml的pbs重悬沉淀，转移至新的离心管中，得到纯化的样品菌悬液。
2、纯化的菌悬液加入终浓度为1μg/ml的gr-ab和浓度为1μg/ml的rd，混匀后避光孵育5～15min。
3、流式分析仪检测：激发光设置为450～500nm，分析速度为1～30μl/min，检测时间为15～300s，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。通过对圈门内的事件在双荧光通道进行分析，计算单增李斯特菌浓度和细菌总数。
本发明具有以下创新和优点：
1、同时检测单增李斯特菌和细菌总数
通过采用绿色荧光探针交联的单增李斯特菌抗体和红色荧光探针进行双荧光标记，可以同时精确定量检测单增李斯特菌和细菌总数。
红色荧光探针针对所有细菌进行染色，并通过带有绿色荧光的免疫荧光抗体特异性标记单增李斯特菌。若一个细菌同时被绿色和红色标记，则为单增李斯特菌；若一个细菌仅被红色标记，则为细菌，但不是单增李斯特菌。
2、操作简单便捷，耗时短，大多数样品均可在0.5h内完成检测。
3、试剂盒中附带有流式分析仪校准微球，可以最大程度上保证检测结果的精确性和准确性。
附图说明
图1是实施例1中单增李斯特菌抗体的电泳结果；
图2是实施例2中荧光显微镜观察fitc标记的单增李斯特菌；
图3是实施例6中流式分析仪检测双荧光标记的单增李斯特菌结果；
图4是实施例6中流式分析仪检测不同浓度比例的单增李斯特菌和杂菌的结果；
图5是实施例7中本方法与平板计数法测量单增李斯特菌结果的线性关系。
图6是实施例8中本方法与平板计数法测量细菌总数结果的线性关系。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的实验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中的条件，或者按照制造厂商的建议条件。实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易从公开商业渠道获得。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量标书，表明在不改动基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
实施例1单增李斯特菌抗体的制备
一、材料与方法
1.共2只实验兔,初始体重2.2-2.5kg。免疫方式：背部皮内多点注射。免疫原:单增李斯特菌特异性膜蛋白。流程：共进行三次免疫，间隔半个月。然后进行效价检测。随后进行第四次免疫，效价检测合适后采集血清，并进行抗体纯化。得到2个单增李斯特菌抗体。
2.使用elisa终点法对得到的2个单增李斯特菌菌抗体进行效价检测。使用sds-page法对抗体浓度进行检测。
二、实验结果
初步制备了2个单增李斯特菌，抗体1效价1:1×106，抗体2效价1:2×106。其电泳结果如图1所示。
表1抗体效价检测
三、实验结论
抗体2为本次单增李斯特菌抗体制备所得抗体，编号ab-1。
按照相同的流程，共制备得到6个抗体(ab-1到ab-6)。
实施例2单增李斯特菌抗体的初步筛选
一、材料与方法
1.使用fitc标记试剂盒将制备的6个单增李斯特菌抗体(ab-1到ab-6)标记荧光素fitc。
2.四株单增李斯特菌标准菌株，编号分别为：atcc15313(1/2a血清型)、atccbaa-751(1/2b血清型))、atcc19112(1/2c血清型)、atcc19115(4b血清型)。分别制备浓度约为1×107cells/ml的上述单增李斯特菌的菌液。
3.分别将浓度为1μg/ml的fitc标记的抗体(ab-1到ab-6)分别加入上述四株单增李斯特菌的菌液，避光孵育15min。分别用荧光显微镜和流式分析仪进行检测。
二、实验结果
使用ab-1、ab-3、ab-4标记时，4株单增李斯特菌均检测到绿色荧光(图2)。使用ab-2标记时，4株单增李斯特菌均没有检测到绿色荧光，说明抗体ab-2不能在流动相中与抗原反应。使用ab-5、ab-6标记时，仅有部分单增李斯特菌检测到绿色荧光，说明抗体ab-5、ab-6无法特异性识别4个血清型的单增李斯特菌菌株。
三、实验结论
成功筛选出三个单增李斯特菌抗体(ab-1、ab-3、ab-4)，可以在流动相中与单增李斯特菌发生反应，经初步验证可以识别4个血清型的单增李斯特菌菌株。
表2单增李斯特菌抗体的评价
实施例3单增李斯特菌抗体和单增李斯特菌膜蛋白的亲和性分析
一、材料与方法
1.四株单增李斯特菌标准菌株，编号分别为：atcc15313(1/2a血清型)、atccbaa-751(1/2b血清型))、atcc19112(1/2c血清型)、atcc19115(4b血清型)。
2.将初步筛选得到的3个单增李斯特菌抗体(ab-1、ab-3、ab-4)和市面上购买的4个单增李斯特菌抗体(编号ab-7到ab-10)稀释至相同初始浓度，并分别进行2倍系列稀释。
3.分别制备浓度约为1×107cells/ml的上述单增李斯特菌的菌液，加热处死后裂解其细胞膜，然后使用单增李斯特菌的抗体进行垂钓反应，捕获单增李斯特菌特异性膜蛋白。
4.使用edc/nhs反应，将单增李斯特菌特异性膜蛋白链接到羧基芯片上。并将该羧基芯片装入分析相互作用分析仪中。
5.对于一个单增李斯特菌抗体，将2被系列稀释的抗体，分别上样分子互作仪，收集数据，并用tracedrawer对一系列反应曲线进行拟合，并对计算该抗体和膜蛋白的亲和力kd。
二、实验结果
使用分析相互作用分析仪，对7个单增李斯特菌抗体和膜蛋白的亲和力进行分析，所得结果如表1所示。结果表明，抗体ab-1和单增李斯特菌膜蛋白的亲和力最好，为2.15×10-10。
三、实验结论
本发明的筛选出了亲和力最好的单增李斯特菌抗体ab-1。
表3不同单增李斯特菌抗体和抗原的亲和力
实施例4单增李斯特菌抗体ab-1特异性评价
一、材料与方法
1.单增李斯特菌菌株12株(表4)，非单增李斯特菌菌株24株(表5)。对上述所有菌株进行复壮与扩增，并稀释至适宜浓度(大约106cfu/ml)。
2.将浓度为1μg/ml的绿色荧光标记的单增李斯特菌抗体ab-1分别加入上述菌悬液，避光孵育5～15min。然后用流式分析仪进行检测。
二、实验结果
将单增李斯特菌抗体ab-1与36个不同菌株的菌悬液进行反应，然后用流式分析仪进行检测其特异性，结果如表4、表5所示：12个单增李斯特菌均检测到了绿色荧光，而24个非单增李斯特菌均未检测到绿色荧光。
表4本方法特异性实验结果(12个单增李斯特菌株)
表5本方法特异性实验结果(24个非单增李斯特菌株)
三、实验结论
单增李斯特菌抗体ab-1可以用于流式分析技术，具有良好的特异性，并且可以准确识别区分单增李斯特菌。
实施例5方法测量细菌总数的普适性
一、材料与方法
1.不同属的标准菌株，总计16株(表6)。
2.膜通透性核酸荧光材料syto62。
3.分别制备上述16个菌株的菌悬液，调整其麦氏浊度值至0.5mcf。使用syto62(最终浓度为1μg/ml)分别对菌液进行染色，反应时间为15min。
5.使用流式分析仪，对上述染色的样品进行检测。
二、实验结果
结果显示，于16个经过荧光标记菌液，流式分析仪检测到红色荧光。对于16个未经过荧光标记菌液，流式分析仪未检测到红色荧光。表明syto62可以对实验的16种菌株进行染色。
表6不同菌株的荧光标记
三、实验结论
此方法可以识别所有种类细菌，具有普适性。
实施例6不同浓度比例单增李斯特菌和杂菌样品的检测
一、材料与方法
1.分别制备浓度约为1×107cells/ml的单增李斯特菌菌液和1×107cells/ml的杂菌菌液(含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)。
2.将单增李斯特菌菌悬液和杂菌菌悬液以不同的体积比混合(0/10，1/9，5/5，9/1，10/0)。然后用流式分析仪检测样品。
二、实验结果
未经荧光标记的单增李斯特菌如图3a所示，无任何荧光；用绿色荧光抗体标记的单增李斯特菌如图3b所示，发绿色荧光；用绿色荧光抗体和核酸荧光素标记的单增李斯特菌如图3c所示，发绿色和红色两种荧光。
将不同浓度比的单增李斯特菌和杂菌混合，并且用流式分析仪进行检测，所得结果如图4所示。结果表明，流式检测的单增李斯特菌和杂菌的比例与实际值接近。
三、实验结论
本发明的检测方法可以准确定量检测液体中的单增李斯特菌和细菌总数。
实施例7本发明方法与平板计数法检测单增李斯特菌的比较
一、材料与方法
1.将培养好的单增李斯特菌菌悬液12000×g离心5min，弃上清，菌泥使用pbs重悬。
2.用灭菌纯净水对单增李斯特菌菌悬液进行10倍系列稀释，并分别采用本发明的检测方法和平板计数法对样品进行定量检测，分析本方法的线性与灵敏度。
二、实验结果
当单增李斯特菌浓度在102～108cfu/ml时，平板计数法与流式分析法的检测结果接近，之间线性良好(r2＝0.9994)(图5)。
三、实验结论
本发明的检测方法可以准确和灵敏定量检测单增李斯特菌，且与平板计数法之间线性良好。
实施例8本发明方法与平板计数法检测细菌总数的比较
一、材料与方法
1.大肠杆菌标准菌株，编号cmcc44102；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号atcc6538p；枯草芽胞杆菌标准菌株，编号atcc6633。
2.将培养好的三种代表性菌株的菌液分别10倍系列稀释。采用流式检测法和国标gb4789.2《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板计数法进行定量检测，每个浓度分别用流式检测法和平板计数法做3次重复。
二、实验结果
图6为三种菌株的流式检测结果与平板计数结果之间的线性关系。结果显示细菌的浓度在103～108cfu/ml时，流式结果与平板计数法基本一致，线性良好。
三、实验结论
此方法中的流式分析技术检测细菌总数的方法准确性良好，检测下限225cfu/ml。
实施例9单增李斯特菌和细菌总数快速检测试剂盒
试剂盒内装有：
可以标记样品中全部细菌的红色荧光探针；
绿色荧光探针交联的单增李斯特菌抗体；
滤膜(2.5μm～15μm孔径)；
校准微球(500nm和2500nm)。