一种靶向肿瘤干细胞标志物CD133的订书肽及其应用

本发明涉及一种靶向肿瘤干细胞标志物cd133的订书肽及其应用，特别涉及肿瘤干细胞标志物cd133特异性靶向多肽筛选与全碳链订书，及其作为药物载体的应用，属于生物医学检测和药物化学领域。

背景技术：

近年来，恶性肿瘤已成为危害人类健康的重要疾病，其发病率和死亡率逐年上升。现在对于多数恶性肿瘤，采用手术、放疗与化疗、靶向和免疫治疗等方法能够杀灭大部分肿瘤细胞，但绝大多数肿瘤仍无法获得根治，容易复发和转移。2001年，肿瘤干细胞(cancerstemcell，csc)这一概念被正式提出。肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的极少量(1％)具有自我更新、无限增殖能力及多向分化潜能的细胞，是肿瘤发生、发展、侵袭、转移的根源。因此，消除cscs是成功根除肿瘤所必需的。csc的无创成像方法可能对肿瘤诊断和治疗监测产生深远的影响。然而，由于缺乏检测，定位和非侵入性的量化检测技术，阻碍了csc在临床患者中的调查研究。具体来说，还没有报道用临床相关的成像探针(例如，结合csc特异性细胞表面蛋白的抗体或其他配体)对csc成功进行非侵入性的成像操作。因此，当前的工作应着重于发展多种测定方法对尽可能多的csc进行有效分析，并对其进行靶向治疗，这对目前肿瘤的诊断、预防和治疗可能会具有重要的意义。寻找特异性的表面标记物，通过其分选肿瘤干细胞，是进一步研究肿瘤发生、转移、复发和预后的关键。

cd133是人类干/祖细胞膜上发现的一种跨膜糖蛋白抗原，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志物。越来越多的证据表明cd133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异标记分子。研究表明，cd133高表达的肝癌患者生存期明显较cd133低表达组的短，细胞质表达cd133是影响肝癌患者总生存的非常显著的危险因素。检测肝癌患者外周血cd133表达，分析其与临床病理特征、肿瘤远端转移等的相互关系，具有重要的临床意义。因此，cd133肿瘤标志物在肿瘤靶向治疗中发挥巨大作用，以cd133作为肿瘤靶向治疗的靶点，将有可能为肿瘤治疗带来重大突破。目前，已经报道了各种各样的能够特异性识别cd133的生物分子，包括抗体，核酸以及多肽等。其中，相比于抗体和核酸分子，多肽分子具有多样性，穿透性，易于化学修饰，生物相容性好的优点，因此在肿瘤靶向诊疗中前景广阔。迄今为止，已有很多关于靶向多肽用于肿瘤诊疗的报道，包括小分子多肽和多肽纳米自组装材料等，但是仍然面临很多问题，例如小分子多肽的亲和力较低，稳定性不够；多肽自组装体大多是“积木”形式(识别单元、信号单元以及亲水或疏水单元拼接而成)，在体外严格控制各种条件(溶液纯度、浓度、酸度等)的情况下可形成有序的组装体，然而在活体内却很难发挥良好的协同作用；并且，线性多肽易于蛋白水解降解，很难保持其天然构象，带来低效的细胞穿透性。因此，综上所述，需要开发具有靶向性、特异性且活体稳定的cd133靶向诊疗多肽。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种靶向肿瘤干细胞标志物cd133的订书肽及其应用，即一种肿瘤干细胞标志物cd133的靶向多肽筛选、订书、该订书肽和近红外二区荧光分子连接实现体内无创分子成像以及该订书肽自组装包载化疗药物联合的载药纳米系统的应用。本发明针对现有技术存在的不足提供了一种活体环境稳定的靶向cd133的订书肽用于靶向肿瘤干细胞，该订书肽和近红外二区荧光分子连接，靶向cd133肿瘤标志物，实现了体内无创成像；此外，该订书肽能够自组装成纳米纤维，包载化疗药物，制备成cd133订书肽纳米纤维-化疗药物载药纳米系统，利用cd133订书肽提高药物对肿瘤组织的靶向渗透能力。本发明为实时监控患者外周血cd133表达和cd133阳性肿瘤干细胞在肿瘤复发、转移、药物耐受和预后的相关性提供了简便快捷、经济、准确的检测手段，以便及时调整治疗方案，改善患者预后。所述订书肽不仅特异性、亲和力高，且活体环境稳定，制备方法简单，成本低，具有很强的实用性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种靶向肿瘤干细胞标志物cd133的多肽，该多肽能与cd133蛋白相结合，所述多肽包括氨基酸序列：skdeex1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15；

其中，s为丝氨酸，k为赖氨酸，d为天冬氨酸，e为谷氨酸，x1是苯丙氨酸，色氨酸或酪氨酸；x2是赖氨酸，组氨酸，精氨酸或亮氨酸；x3是异亮氨酸或亮氨酸；x4是苯丙氨酸，色氨酸或酪氨酸；x5是异亮氨酸或亮氨酸；x6是赖氨酸，组氨酸或精氨酸；x7是赖氨酸，组氨酸或精氨酸；x8是赖氨酸，组氨酸或精氨酸；x9是谷氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺或苏氨酸；x10是酪氨酸，谷氨酸或天冬氨酸；x11是谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺或天冬酰胺；x12是亮氨酸或异亮氨酸；x13是谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺或天冬酰胺；x14是赖氨酸，组氨酸，精氨酸，甘氨酸或丙氨酸；x15是赖氨酸，组氨酸，精氨酸或甘氨酸。

本发明所述的氨基酸残基可以是l-型，也可以是d-型，或者是l-、d-型的混合。

作为优选技术方案，本发明所述多肽的氨基酸序列如下所示：nh2-skdeewhiwikrhsynlegr-ac(ccp)。

所述多肽所示的氨基酸序列对cd133高特异性亲和。

所述多肽的筛选方法：固相-液相相结合的三轮筛选

第一轮筛选为固相筛选：本发明中，根据yin等人(blood，1997，90(12)：5002)的报道基于人cd133的蛋白结构特点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的tentagel树脂作为固相载体，利用fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为10⁸的一珠一物肽库。利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经maldi-tof-ms鉴定，获得了一系列能特异性结合cd133的活性多肽。

第二轮筛选为固相筛选：将第一轮筛选出的能特异性结合cd133的活性多肽氮端连接一个新型的具有聚集诱导发光(aie)性质的分子dbt(4，7-双(5-溴-2-噻吩基)-2，1，3-苯并噻二唑)，这是一类生物相容性的环境响应分子。与传统aie分子不同，dbt不会因为单纯的聚集而荧光增强，仅会在形成特定的疏水空腔(如产生纤维、囊泡等)时才会触发较强的荧光。在游离状态下，dbt在肽链末端处于自由分散状态，不发光，而如果肽链在与靶标识别过程中间发生相互作用，实现有序的自聚集，则会荧光“打开”。将cd133阳性活性肿瘤组织悬浮液与肽珠相互作用，通过倒置荧光显微镜(olympusix71)观察荧光强度，将荧光阳性的珠子用maldi-tof-ms进行测序，在第一轮筛选的基础上获得了能够发生cd133原位诱导自组装的cd133活性多肽。

第三轮筛选为液相筛选：经过上两轮筛选后，得到了100条既能靶向cd133又能实现靶标诱导自组装的阳性多肽。第三轮筛选为液相筛选，使用fmocspps(固相肽合成)策略，以wang树脂作为固相载体，合成该100种多肽，并通过hplc(高效液相色谱)纯化。在合成过程中，100种多肽都与dbt-br偶联，然后将其转移到96孔板中。将新鲜离体cd133活性组织悬浮液添加到板的每个孔中。dbt反应出不同的荧光信号，表明cd133诱导的自组装能力的强弱。最后，我们根据不同的荧光强度筛选出了最终的肽序列。

所述靶向cd133多肽订书的方法：引入两个含有α-烯基的非天然氨基酸x，两个非天然氨基酸x之间发生烯烃复分解反应环化构成全碳大环支架；在所述多肽的氨基酸序列第i与i+n的位置订书(n＝3，4，5，6，7，8，9)。订书后得到订书肽(sccp)；所述订书肽cd133肿瘤干细胞原位诱导自组装能力增强，成为纳米材料，具有载药能力，靶向作用在cd133。

作为优选技术方案，本发明的订书肽订书位点为i与i+7。

所述订书肽α-螺旋构象增多，稳定性增强，自组装能力增强，对cd133靶向能力增强，膜穿透能力增强。

优选地，将所得订书肽与连接分子连接形成二价体或多价体，便有观察订书肽的靶向作用；

所述连接包括：共价连接或非共价连接而成；

当订书肽与连接分子共价连接形成二价体或多价体时，所述的连接分子为cy5荧光染料、二苯并噻吩(dbt)、7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑基(nbd)、6-叔丁氧羰肼基烟酸(hynic)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；所述连接分子是新型无毒、生物相容性良好的交联剂。

当订书肽与连接分子非共价连接形成二价体或多价体时，所述的连接分子为多聚体；所述多聚体包括：聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(pamam)、聚乳酸(pla)、聚乳酸-乙醇胺(plga)中的任意一种或至少两种的混合。

将所述订书肽以及二价体或多价体与治癌药物制剂组合，能够靶向cd133，更好的起到杀伤癌细胞的作用；

所述药物制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物。

进一步优选地，所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

将所述订书肽以及二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合，能够靶向cd133，实现活体造影，精确确定体内cd133的位置，即癌细胞的位置；

所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

有益效果

1、本发明的多肽序列筛选于一定库容量的肽库，该肽库是基于人cd133的蛋白结构特点和分子识别理论进行设计和构建的，因此该多肽具有能够特异性识别cd133标志物的特定结构。

2、本发明的多肽在筛选方法上具有一定的创新性，是通过固相-液相相结合的多轮次筛选方法得到的。在以前固相筛选的基础上，又添加了液相筛选的步骤。通过新鲜离体组织悬浮液模拟活体环境，将活体组织悬浮液与肽库相互作用，筛选出最终能够发生活体组织诱导自组装的多肽序列，进一步增加了靶向多肽分子在活体循环中的稳定性。

3、本发明得到线性多肽序列后，对线性多肽进行了订书，得到了订书肽，使得多肽的α-螺旋增多，在生物体内的抗水解、酶解能力增强，稳定性增强；同时，订书肽的穿膜能力相比于线性多肽增强，进而提高订书肽的靶向能力。

4、本发明的针对cd133的靶向订书肽是目前最为普适的一类肿瘤靶向订书肽，还没有相关的报道，可以与荧光分子等小分子或多聚体进行共价或非共价连接，形成二价体或多价体，也可以包载药物制剂制成药物组合物。因而在实际应用中，可以将本发明的订书肽作为分子探针或药物组合制剂对cd133阳性肿瘤实现靶向诊疗。同时，为实时监控患者外周血cd133表达和cd133肿瘤干细胞在肿瘤复发、转移、药物耐受和预后的相关性提供了简便快捷、经济、准确的检测手段，以便及时调整治疗方案，改善患者预后。

附图说明

图1cd133靶向多肽微芯片筛选图：图a为筛选cd133靶向多肽原理示意图；图b为阳性肽珠示意图(虚线框内的为阳性肽珠)。

图2表面等离子共振(spri)检测阳性多肽ccp和sccp与人cd133蛋白的亲合力：图a为ccp；图b为sccp。

图3ccp与细胞相互作用的实验：图a为ccp与cd133过表达u87细胞，cd133低表达293t细胞相互作用示意图；图b为ccp与cd133质粒转染293t细胞，cd133sirna转染u87细胞相互作用示意图。

图4ⁿsccp与cd133过表达u87细胞相互作用与体外摄取情况：图a为ⁿsccp与u87细胞相互作用5min示意图；图b为ⁿsccp与u87细胞相互作用20min示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验例1本发明cd133靶向多肽筛选系统的构建和筛选

1)实验仪器与材料

n-甲基吗啉(nmm)，哌啶，三氟乙酸(tfa)，二氯甲烷(dcm)，茚三酮，维生素c，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(tis)，乙二硫醇(edt)，n，n二甲基甲酰胺(dmf)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种fmoc保护氨基酸，4，7-双(5-溴-2-噻吩基)-2，1，3-苯并噻二唑(dbt)，二氯乙烷(edc)，链霉亲和素磁珠(mb-streptavidin)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(olympusfv1000-ix81)，上述试剂和材料均从商业途径获得。

2)cd133“一珠一物”多肽文库的合成

采用fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，具体方法如下：称取200mg的tentagel-nh2树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入lys、his、arg、gly依次进行反应，脱保护后进行混合均分合成；

(1)待反应完成后，把树脂均分5份，向每管分别加入lys、his、arg、gly、ala与等量的hbtu进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合，再把树脂相应均分为若干份，依次循环合成；

(2)分别加入glu、asp、gln、asn偶联方法同(1)；

(3)分别加入ile、leu偶联方法同(1)；

(4)分别加入glu、asp、gln、asn偶联方法同(1)；

(5)分别加入tyr、glu、asp偶联方法同(1)；

(6)分别加入glu、asp、ser、gln、asn、thr偶联方法同(1)；

(7)分别加入lys、his、arg偶联方法同(1)；

(8)分别加入lys、his、arg偶联方法同(1)；

(9)分别加入lys、his、arg偶联方法同(1)；

(10)分别加入ile、leu偶联方法同(1)；

(11)分别加入phe、try、tyr偶联方法同(1)；

(12)分别加入ile、leu偶联方法同(1)；

(13)分别加入lys、his、arg、leu偶联方法同(1)；

(14)分别加入phe、try、tyr偶联方法同(1)；

(15)分别分五步在三个合成管中加入glu、glu、asp、lys、ser偶联方法同(1)，待偶联完毕后，树脂tfa脱保护后混合。经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。

3)cd133阳性多肽的筛选

(1)取干燥肽库用1×pbs洗3次，加入5％的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×pbs洗3次；

(2)根据生物素标记试剂盒标记pd-l1蛋白，取生物素(biotin)标记的pd-l1蛋白与多肽库混合，37℃孵育2h后用1×pbs洗3次；

(3)然后取100μlmb-streptavidin加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。把孵育后含多肽库ep管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于ep管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在ep管底。

图1a为筛选cd133靶向多肽原理示意图，当阳性多肽珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记链霉亲和素的磁球通过识别生物素而识别阳性肽珠。图1b虚线框内的为阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性从而被磁场捕获。进一步地，第二轮筛选是从阳性多肽中筛选能够cd133原位诱导自组装的多肽序列。挑选出其中包覆磁珠最多，作用力较强的阳性多肽。将cd133阳性肿瘤组织添加到组织裂解缓冲液中以产生组织悬浮液。将肽珠与cd133新鲜组织悬浮液在37℃下孵育2h。将所有珠子以单珠子每孔的方式装载到10×10微阵列中。然后通过倒置荧光显微镜(olympusix71)以40倍的放大率观察微阵列。将荧光阳性的珠子用maldi-tof-ms进行测序。第三步筛选是液相筛选，经过第一轮和第二轮筛选后，得到既能靶向cd133又能发生cd133原位诱导自组装的100条多肽序列，将100条多肽按照序列重新合成，并在100条多肽上逐一连接dbt荧光分子(dbt具有聚集诱导发光(aie)性质，并且只有分子组装形成疏水空腔时才会发光)。然后，将cd133活体组织悬浮液加入96孔板中，加入连接dbt的阳性多肽，根据每个孔中荧光强度，筛选出自组装性能良好的多肽序列，通过溴化氰裂解，进行二级质谱鉴定，继而运用mascot数据库解出相应序列信息。按序列重新合成阳性多肽部分标记荧光，maldi-tof-ms鉴定和hplc纯化用于后续试验。经化学合成制得本发明多肽氨基酸序列为：nh2-skdeewhiwikrhsynlegr-ac(ccp)。

实验例2通过引入两个含有α-烯基的非天然氨基酸使其成环的方法订书ccp的i与i+7位点生成并合成订书肽。

本发明在线性肽链中引入的两个非天然氨基酸是fmoc-2-(7′-辛烯基)丙氨酸和fmoc-2-(4′-戊烯基)丙氨酸。优选地，合成的订书肽序列表示为nh2-skdeewr8hiwikrs5hsynlegr-ac(sccp)。其中，r8和s5分别为fmoc-2-(7′-辛烯基)丙氨酸和fmoc-2-(4′-戊烯基)丙氨酸。线形肽的合成与实验例1的方法步骤一致。线性肽的合成完成后，进行格鲁布斯(grubbs)催化的闭环烯烃复分解反应(rcm)以连接r8和s5的侧链进行环化。之后，用裂解试剂(87.5％tfa+5％硫代苯甲醚+2.5％苯酚+2.5％edt+2.5％h2o)从wang树脂中裂解肽，切割时间为2h。得到订书肽后，通过maldi-tof鉴定和hplc纯化用于后续试验。

实验例3通过表面等离子共振(spri)方法检测cd133阳性多肽ccp和sccp与cd133蛋白的亲和作用。

分别将1mg/ml的ccp与sccp及1×pbs点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×pbs清洗10min，再用1×pbs清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×pbs中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×pbs清洗10min，1×pbs清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(plexeraht表面等离子共振成像系统)。

流动相依次通过1×pbs、2×pbs、0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的人cd133纯化蛋白，记录分析spri信号。

由图2可以看出，ccp(图2a)与sccp(图2b)的spri信号随着蛋白浓度的增加逐渐增强，说明本发明的cd133阳性多肽对cd133都有强结合的，而且亲和解离常数ccp与sccp分别达到7.10×10^-8m，1.10×10^-9m，经过订书后订书肽sccp亲和力增强，接近抗体的亲和力。可以作为探针靶向cd133的肿瘤干细胞，用于相关的检测研究和靶向治疗应用。

实验例4ccp分别与高表达cd133细胞u87和低表达cd133细胞293t相互作用。

人神经胶质瘤细胞系u87(cd133阳性)和人肾上皮细胞系293t细胞(cd133阴性)用含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基在37℃恒温培养箱(5％co2)中培养。

以1×10⁵/ml的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，两种细胞中分别加入含1μmol/lhoechst33342，4℃避光孵育15min后，用预冷1×pbs洗涤2次，分别加入50μmol/l的fitc标记多肽ccp，4℃避光孵育20min后，用预冷1×pbs洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(olympusfv1000-ix81)检测细胞中的荧光分布。

结果如图3a所示，加入ccp的u87的细胞膜上观测到很强的绿色荧光，而293t细胞没有荧光。结果表明ccp多肽结合在阳性细胞的细胞膜上，与人cd133阳性细胞系的识别具有专一性，而且特异性与靶标蛋白的表达量呈正相关，可以作为靶向分子用于相关的诊断和检测。相反，ccp多肽对低cd133表达的阴性细胞293t没有观测到绿色荧光信号和抗体信号，由此进一步说明它们是特异性的靶向cd133，也进一步验证了图3中的spri数据的可靠性。

实验例5基因敲除实验与质粒过表达实验。

在含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基中培养u87细胞，使其生长过夜。然后将培养基换成含10％胎牛血清的dmem/highglucose培养基(不含抗生素)。用50μl的opti-mem培养液稀释0.0025nmol/l的cd133sirna，然后在室温下静置5min。用50μlopti-mem稀释2.0μllipofectamine^tm2000(转染脂质体)，并将混合物在室温下静置5min。混合转染试剂和sirna稀释液，并在室温下静置20min。随后，立即将转染复合物添加到含有u87细胞的培养皿中，在37℃含5％co2的细胞培养箱中转染6h。之后，丢弃含有转染试剂的培养基，并添加胰蛋白酶消化细胞。然后用含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基培养经sirna转染的u87细胞。

在含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基中培养293t细胞，使其生长过夜。然后将培养基换成含10％胎牛血清的dmem/highglucose培养基(不含抗生素)。用50μl的opti-mem培养液稀释0.8μg的cd133质粒dna，然后在室温下静置5min。用50μlopti-mem稀释2.0μllipofectamine^tm2000(转染脂质体)，然后添加2μlp3000^tm，并将混合物在室温下静置5min。混合转染试剂和质粒dna，并在室温下静置20min。随后，立即将转染复合物添加到含有293t细胞的培养皿中，在37℃含5％co2的细胞培养箱中转染6h。之后，丢弃含有转染试剂的培养基，并添加胰蛋白酶消化细胞。然后用含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基培养经cd133质粒转染的293t细胞。

实验例6ccp分别与经过cd133质粒转染的高表达cd133细胞293t和经过cd133sirna转染的低表达cd133细胞u87相互作用。

cd133sirna转染的u87细胞和cd133质粒转染的293t细胞用含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基在37℃恒温培养箱(5％co2)中培养。

以1×10⁵/ml的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，两种细胞中分别加入含1μmol/lhoechst33342，4℃避光孵育15min后，用预冷1×pbs洗涤2次，分别加入50μmol/l的fitc标记多肽ccp，4℃避光孵育20min后，用预冷1×pbs洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(olympusfv1000-ix81)检测细胞中的荧光分布。

结果如图3b所示，cd133质粒转染的293t细胞膜上观测到很强的绿色荧光，而cd133sirna转染的u87细胞没有荧光。由此进一步说明ccp是特异性的靶向cd133。

实验例7sccp与荧光分子偶联物的制备。

近红外二区染料nz用于与sccp缀合。将sccp，nz和二氯乙烷(edc)(摩尔比为1∶4∶40)溶于ph5.8的磷酸缓冲液(pbs)中过夜。通过hplc监测肽与nz之间的结合几乎完全实现了偶联反应。反应混合物通过截留分子量为3,500da的透析进行纯化，然后冻干。通过maldi-tof-ms分析产物。然后将纯化的nz共轭的sccp(ⁿsccp)溶解在水溶液中并静置48h，以备后续反应使用。

实验例8ⁿsccp与cd133过表达u87细胞相互作用以及体外摄入情况。

人神经胶质瘤细胞系u87(cd133阳性)用含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基在37℃恒温培养箱(5％co2)中培养。

以1×10⁵/ml的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，在细胞中加入含1μmol/lhoechst33342，4℃避光孵育15min后，用预冷1×pbs洗涤2次，加入200μl15μg/ml的ⁿsccp，4℃避光孵育20min后，用预冷1×pbs洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(olympusfv1000-ix81)检测细胞中的荧光分布。共焦图像分别在5min和20min的时间点获取。

结果如图4所示，图4a表示孵育5min后，ⁿsccp可以明显结合细胞膜。图4b表示20min后，ⁿsccp已渗透到膜中并分布在整个细胞质中，甚至到达了核区域，表明ⁿsccp对cd133的亲和力增强，并且多肽经过订书后细胞渗透性增强。

综上所述，从实验例1-8可以得出，本发明的订书肽具有靶向表达cd133阳性肿瘤细胞和肿瘤干细胞的特性，订书肽与线性多肽相比，靶向能力增强，细胞渗透性增强，在临床上对相关肿瘤具有诊断和治疗的应用价值。因而在实际应用中，可以将本发明的订书肽作为靶向多肽，与信号单元或者能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的成像、靶向治疗和免疫治疗反应标志物的检测。

本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。