一株库德里阿兹威毕赤酵母菌及其在发酵白酒糟中的应用的制作方法

本发明涉及发酵
技术领域：
，具体涉及一株库德里阿兹威毕赤酵母菌及其在发酵白酒糟中的应用。
背景技术：
：白酒糟是白酒行业的副产品，直接饲用对动物产生极大的不利作用，比如会导致动物因酸中毒而死亡。因此需要对白酒糟进行处理后才能饲喂动物。通过简单的物理方法，如晾晒，很容易卫生条件达不到指标，而出现更多新的问题，如大肠菌群超标；化学方法添加一定的碱中和后利用，也会导致酒糟的利用率低，不能充分发挥白酒糟的价值；通过生物发酵的方法，不仅改变了白酒糟的物理性质，提高其ph值，还能增加许多附加值。经过发酵后的白酒糟，首先气味有了很大的改善，其次白酒糟基质中会增加许多酶类、活性小肽、甘露聚糖、寡糖等等。由于白酒糟经过酿酒酵母发酵蒸馏出酒精的副产物，含有大量的有机酸，主要有乙酸、乳酸、丁酸和己酸四大有机酸，经测定，乙酸含量为0.4％，乳酸含量1.2％，己酸0.05％，丁酸0.02％。白酒糟ph值较低，刚蒸馏出来的白酒糟ph值在3.6左右。这些有机酸尤其是乙酸和己酸会抑制一般酵母的生长，导致发酵很难进行。技术实现要素：本发明的目的是针对上述问题，提供一株库德里阿兹威毕赤酵母菌，阐明其特征及其在发酵白酒糟中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的：一株库德里阿兹威毕赤酵母菌，所述菌株为库德里阿兹威毕赤酵母xxsw-108(pichiakudriavzeviixxsw-108)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2020768。进一步地，所述菌株于ph4.0-5.5、温度为32-42℃的条件下，能直接利用有机酸，可以发酵白酒糟。更进一步地，所述有机酸为乙酸和/或乳酸。本发明还保护上述库德里阿兹威毕赤酵母菌在发酵白酒糟中的应用。优选地，所述应用包括以下步骤：s1、液体菌种制备：制取酒糟水摇瓶，接种库德里阿兹威毕赤酵母菌制得液体酵母菌种；s2、液固发酵：(1)将辅料与鲜白酒糟混合，接种液体酵母菌种；(2)当ph值上升至4.5～6.0时发酵完成，制得固体发酵产物。进一步地，s1所述液体菌种制备包括以下步骤：取白酒糟与自来水1：10(w/v)混合均匀后，滤掉杂质，滤液中加入碳酸钙调节ph值为5.0-5.5，另添加2-4％的蔗糖，纱布、牛皮纸封口后，置121℃高压灭菌锅灭菌15min，冷却到室温，接种库德里阿兹威毕赤酵母菌平板琼脂块约1cm2，在摇床培养，温度为32-42℃，转速180-200r/min，时间为12-16h。更进一步地，s2所述液固发酵中辅料为：载体、无机氮和中和剂，按照质量比为(0-70):(2-5):(6-20)混合。优选地，所述的辅料与所述鲜白酒糟的质量比为(0.8-8):100。优选地，所述的液体酵母菌种的接种比例为1wt％-30wt％。优选地，所述载体为喷浆玉米皮、麸皮、米糠粕和酒糟粉中的一种或两种以上；所述无机氮为硝酸盐、尿素、硫酸铵、磷酸铵和氨水中的一种或两种以上；所述中和剂为碳酸钙、氢氧化钙、碳酸氢钙和氨水中的一种或两种以上。本发明的有益效果在于：本发明所述库德里阿兹威毕赤酵母菌是一株在白酒糟发酵过程中分离出来的优势菌，经上海生工生物股份有限公司鉴定而得。它是一株耐10％乙醇、15％乳酸和3％乙酸的菌株，最高耐受温度为45℃。本发明通过试验知，毕赤酵母耐有机酸，能利用乙酸和乳酸等有机酸，能在温度为32-42℃，ph值4.0-5.5条件下快速增长。将库德里阿兹威毕赤酵母菌接种到白酒糟中发酵1到3天，可以得到大量库德里阿兹威毕赤酵母菌营养体，自溶后得到甘露聚糖，有效提高白酒糟的ph值，减少发酵时间，降低投入成本。附图说明图1为库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)的菌落形态；图2为库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)26srdna基因d1/d2区电泳图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似的改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。实施例1库德里阿兹威毕赤酵母的获得在白酒糟发酵过程中发现一株生长速度快，耐有机酸的菌株，通过计数平板上挑取单菌落，不断划线分离纯化而得。经上海生工生物股份有限公司通过基因比对而得，该菌的名字为库德里阿兹威毕赤酵母(pichiakudriavzevii)。所述的计数平板为孟加拉红平板，配方为：蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖10.0g，氯霉素0.1g，孟家拉红0.033g，琼脂粉20.0g，加水1000ml，121℃高压灭菌15min。所述的分离纯化的培养基配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，琼脂粉20.0g，加水1000ml，121℃高压灭菌15min。利用26srdna基因d1/d2区序列分析法对酵母样本dna提取、pcr扩增、测序并与ncbi中基因序列同源性比较，得出该酵母与库德里阿兹威毕赤酵母同源性最近，相似度达100％，因此鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母。其序列如seqidno.1所示。将该菌株送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息如下：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年11月23日；保藏编号：cctccno:m2020768；分类命名：库德里阿兹威毕赤酵母xxsw-108(pichiakudriavzeviixxsw-108)。实施例2库德里阿兹威毕赤酵母对四大有机酸的耐受度酒糟中主要有乳酸、乙酸、丁酸和己酸四大有机酸，经过检测新陈酒糟及新酒糟渗出液中的四大有机酸含量及库德里阿兹威毕赤酵母对四大有机酸的耐受度如表格1所示。表格1.酒糟中有机酸含量及毕赤酵母对有机酸的耐受所述的新陈酒糟和新酒糟渗出液中四大有机酸含量，是安徽润安信科检测科技有限公司检测而得。所述的库德里阿兹威毕赤酵母对四大有机酸的耐受是在酵母生长培养基中分别添加不同梯度的有机酸制得固体平板，涂板计数而得，见表格2。所述的酵母生长培养基配方为：蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，琼脂粉20.0g，加水1000ml，121℃高压灭菌15min。丁酸灭菌酵母生长培养基上分别添加0.05％、0.10％、0.20％和0.40％的丁酸制成固体平板，接种毕赤酵母种子液，32℃培养后涂板计数。己酸灭菌酵母固体蛋白胨培养基上分别添加0.05％、0.08％、0.11％和0.14％的己酸制成固体平板，接种毕赤酵母种子液，32℃培养后涂板计数。乙酸灭菌酵母固体蛋白胨培养基上分别添加0.40％、0.80％、1.20％和1.60％的乙酸制成固体平板，接种毕赤酵母种子液，32℃培养后涂板计数。乳酸灭菌酵母固体蛋白胨培养基上分别添加2.0％、4.0％、6.0％和8.0％的乳酸酸制成固体平板，接种毕赤酵母种子液，32℃培养后涂板计数。表格2.库德里阿兹威毕赤酵母对四大有机酸的耐受度计数结果实施例3库德里阿兹威毕赤酵母对乙酸和乳酸的利用在培养基1和2中唯一碳源是乙酸和乳酸时，设置唯一乙酸碳源的培养基1和唯一乳酸碳源的培养基2，酒糟渗出液培养基3，三种培养基中分别接种2％的库德里阿兹威毕赤酵母种子液，其中培养基1和培养基2培养48小时培养基变浑浊，而酒糟渗出液培养时间为96小时开始生长，涂板计数结果如表格3。培养基1配方为：硫酸铵7.8g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.53g，乙酸4.0g，加蒸馏水1000ml配成液体培养基，121℃灭菌，15min，冷却至室温添加乙酸4ml。培养基2配方为：硫酸铵7.8g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.53g，乳酸30g，加蒸馏水1000ml配成液体培养基，121℃灭菌，15min后，冷却至室温添加乳酸40ml。培养基3制法为：新蒸馏酒糟渗出液，经纱布过滤后所得的液体。表格3.毕赤酵母对乙酸和乳酸的利用及在酒糟渗出液中发酵效果培养基培养前培养基1培养基2培养基3计数(cfu/g)2×1068.7×1061.4×1072.4×107实施例4库德里阿兹威毕赤酵母在白酒糟发酵中的应用液体菌种制备：制取酒糟水摇瓶，接种库德里阿兹威毕赤酵母菌制得液体菌种。液固发酵：(1)将辅料与鲜白酒糟混合，接种液体酵母菌种；(2)当ph值上升至4.5～6.0时发酵完成，制得固体发酵产物。所述的液体制种：取白酒糟与自来水1：10(w/v)混合均匀后，滤掉稻壳等物质，滤液中加入碳酸钙调节ph值为5.0-5.5，另添加4％的蔗糖，纱布、牛皮纸封口后，置121℃高压灭菌锅灭菌15min，冷却到室温，接种库德里阿兹威毕赤酵母菌平板1cm2，在摇床培养，温度为32℃，转速180r/min，时间为12-16h。所述的辅料与所述鲜白酒糟的质量比为0.8-8:100。所述的液固发酵中辅料为：载体、无机氮和中和剂，按照质量比为0-70:2-5：6-20混合。所述载体为喷浆玉米皮、麸皮、米糠粕和酒糟粉中的一种或多种；所述无机氮为硝酸盐、尿素、硫酸铵、磷酸铵和氨水中的一种或多种；所述缓冲剂为碳酸钙、氢氧化钙、碳酸氢钙和氨水中的一种或多种。所述的液体菌种的接种比例为1wt％-30wt％。实施例5与产朊假丝酵母、酿酒酵母发酵效果对比取白酒糟与自来水100g：1000ml(w/v)混合均匀后，滤掉稻壳等物质，滤液中加入碳酸钙调节ph值为5.0，另添加4％的蔗糖，分装到三角瓶中，每瓶200ml，封口后，置121℃高压灭菌锅灭菌15min，冷却至室温后分别接种活化的库德里阿兹威毕赤酵母菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母平板1cm2，置摇床32℃，180r/min，培养15h，即得三个菌的液体菌种。分别取白酒糟600g，加辅料30g，添加库德里阿兹威毕赤酵母液体菌种60ml混合均匀后分两个大平板铺平后，置32℃培养箱中培养。另两个菌种同样的方法培养。定时监测ph和镜检，当ph值升至6.0左右，停止发酵。取样计数，结果如表格4，根据计数结果可知，毕赤酵母生长效果最好。表格4不同菌种在白酒糟上的发酵计数毕赤酵母酿酒酵母产朊假丝酵母计数(cfu/g)1.9×1083.6×1064.5×106实施例6不同发酵温度对库德里阿兹威毕赤酵母生长的影响取白酒糟与自来水100g：1000ml(w/v)混合均匀后，滤掉稻壳等物质，滤液中加入碳酸钙调节ph值为5.0，另添加8g的蔗糖，分装到三角瓶中，每瓶200ml，封口后，置121℃高压灭菌锅灭菌15min，冷却后接种活化的库德里阿兹威毕赤酵母菌固体培养基1cm2，置摇床32℃，180r/min，培养15h，即得液体菌种。将麸皮：尿素：硫酸铵：碳酸钙按20：1：2：6的比例混合为辅料，将辅料与鲜白酒糟按2.9:100的比例混合为白酒糟混合物。白酒糟300g，辅料8.7g，接种液体菌种30ml，分别在32℃、37℃、42℃和47℃培养，定时监测ph值和镜检，当ph值升至6.0左右，停止发酵。发酵结果如表格5，毕赤酵母在白酒糟中的适合的生长温度为32-42℃。表格5.不同温度下毕赤酵母的生长情况温度32℃37℃42℃47℃计数(cfu/g)1.8×1082.0×1088.6×1074.4×105实施例7不同发酵初始ph值对库德里阿兹威毕赤酵母发酵效果和时间的影响液体菌种制备同实施例4。将麸皮：尿素：硫酸铵按20：1：2的比例混合为辅料，将辅料与鲜白酒糟按2.3:100的比例混合为白酒糟混合物。添加不同比例的碳酸钙调节发酵初始ph值为：3.6、4.0、4.5、5.0和5.5。白酒糟300g，辅料6.9g，接种液体菌种30ml，置32℃培养箱中培养，定时监测ph值和镜检，当ph值升至6.0，停止发酵。发酵计数结果如表格6，结果表明库德里阿兹威毕赤酵母在白酒糟上适宜生长的ph值为4.0-5.5以上。表格6.不同发酵初始ph对毕赤酵母的影响初始ph值3.64.04.55.05.5计数(cfu/g)4.5×1062.1×1081.9×1082.3×1081.8×108发酵时间(h)4444323224以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。sequencelisting<110>安徽东方新新生物技术有限公司<120>一株库德里阿兹威毕赤酵母菌及其在发酵白酒糟中的应用<130>20202956<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>570<212>dna<213>库德里阿兹威毕赤酵母<400>1cggtgttgcgccgttctgccagcatccgtgacctacacggccgcagtcctcggtccccgc60acgcagcatctggccctggctataacactccgaagagccacgttccagaaccccttctcc120tgcagcaagaaccgatgctggcccagggaaagcccagagcgccgcccacgagaggcagcg180gtgcgcaatccccatgtcgggcgcaatacccttccctttcaacaatttcacgtgctgttt240cactctcttttcaaagtgcttttcatctttccttcacagtacttgttcgctatcggtctc300tcgccagtatttagccttagatggaatttaccacccgcttggagctgcattcccaaacaa360ctcgactcgtcagaagggcctcactgcttccgccggcatcccacggggctctcaccctcc420tgggcgccctgttccaagggacttggacaccgccttccacacagactccaacctgcaatc480tacaactcgtgccgcaaagcacgatttcaaatctgagctcttgccgcttcactcgccgct540actgaggcaatccctgttggtttcttttcc570当前第1页12