一种制备蝎子毒素多肽的方法与流程

1.本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及制备蝎子毒素多肽的方法。


背景技术：

2.在古巴，有一种蝎子名为cuban blue scorpion rhopalurus junceus，该蝎子的毒液经常被当地人用作抗癌的天然产物。此毒液也具有较好的抗菌活性。因此该毒素蛋白具有药物开发的潜能。经分析，此毒素中的主要成分为一种名为rjaa12f的化合物，它是含有64个氨基酸残基和四对二硫键的多肽。
3.目前获得蝎子毒素主要是直接从蝎子来源的粗毒中提取，经过反相高效液相色谱c18柱分离纯化。这种方法可以获得天然蝎子毒素多肽，但是缺点在于得到的蝎毒素量非常微小，同时不便于大规模生产操作。
4.因此，提供一种制备高产量、高纯度和收率的蝎子毒素多肽的方法显得很有必要。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了制备蝎子毒素多肽的方法，该方法制备的蝎子毒素多肽产量大，纯度高，收率高，且该方法操作简便、快捷、成本低，适于规模化生产。
6.本发明提出了一种制备蝎子毒素多肽的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：提供第一多肽和第二多肽；将所述第一多肽和第二多肽进行连接，得到第三多肽；将所述第三多肽进行复性，得到蝎子毒素多肽；其中，所述复性步骤中采用的复性试剂选自二甲基亚砜、乙酸和水的混合液。
7.发明人对复性步骤进行大量的研究，发现二甲基亚砜具有一定的氧化性，可以促进二硫键的形成，且酸性环境能加速多肽在二甲基亚砜中的复性反应。另外，二甲基亚砜还有助于多肽的溶解和防止多肽在溶液中发生聚集。由此，所筛选的复性试剂可以促进第三多肽中的巯基配对以形成二硫键，复性效率高，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高、产量大。
8.根据本发明的实施例，所述二甲基亚砜、乙酸和水的体积比为(8～12)：(1～3)：(18～22)。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可以进一步提高复性效率，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
9.根据本发明的实施例，基于1mg所述第三多肽，所述复性试剂的添加量为0.4～0.8ml。由此，可以进一步提高复性效率，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
10.根据本发明的实施例，所述复性的时间为8～16小时。由此，可以进一步提高复性效率，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
11.根据本发明的实施例，所述蝎子毒素多肽具有seq id no：1所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含如下四对二硫键：cys11-cys63、cys15-cys37、cys22-cys44、cys26-cys46。即，在seq id no：1所示氨基酸序列的第11位cys与63位cys之间形成二硫键、第15位cys与37位cys之间形成二硫键、第22位cys与44位cys之间形成二硫键、第26位cys与46位
cys之间形成二硫键。
12.seq id no：1：kegypmgrdgckiscvinnnfckvecqakwrqsdgycyfwglscyctnlpedaqvwdsstnkcg
13.根据本发明的实施例，所述第一多肽具有seq id no：2所示的氨基酸序列；所述第二多肽具有seq id no：3所示的氨基酸序列。蝎子毒素多肽序列分成上述序列的第一多肽和第二多肽，将第一多肽和第二多肽连接后，第一多肽和第二多肽中含有的巯基在复性步骤中可以较好地进行配对以形成二硫键，复性效率高，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
14.seq id no：2：kegypmgrdgckiscvinnnfckvecqakwrqsdgy
15.seq id no：3：cyfwglscyctnlpedaqvwdsstnkcg
16.根据本发明的实施例，采用如下方式将所述第一多肽和第二多肽进行连接，得到第三多肽：将所述第一多肽与nano2在盐酸胍缓冲液中于-12～-18℃下反应15～25分钟，得到第一反应液；将所述第一反应液与4-巯基苯基乙酸(简称mpaa)混合，然后调节ph值至5～6，得到第二反应液；将所述第二反应液与所述第二多肽进行混合，并调节ph值至6.5～7，搅拌8～16小时，得到所述第三多肽。发明人采用自然化学连接方法将第一多肽和第二多肽连接成全长多肽，即第三多肽，并对上述工艺条件进行大量的筛选，由此，所得第三多肽的合成效率高，操作简便、快捷，成本低。
17.根据本发明的实施例，所述第一多肽、第二多肽、nano2和4-巯基苯基乙酸的当量比为1：(1～2)：(3～7)：(30～70)。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可以进一步提高第三多肽的合成效率。
18.根据本发明的实施例，所述盐酸胍缓冲液的浓度为4～8mol/l，所述第一多肽在所述盐酸胍缓冲液中的终浓度为6～10mm。由此，可以进一步提高第三多肽的合成效率。
19.根据本发明的实施例，将所述第一多肽和第二多肽进行连接之前，采用高效液相色谱分别对所述第一多肽和第二多肽进行纯化。由此，可以有效提高第一多肽和第二多肽的纯度，在后续的反应步骤中，避免其他杂质干扰，所得第三多肽及蝎子毒素多肽的收率高、纯度高。
20.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
21.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
22.图1显示了根据本发明一个实施例的实施例1的色谱图；
23.图2显示了根据本发明一个实施例的实施例1的质谱图；
24.图3显示了根据本发明一个实施例的实施例2的色谱图；
25.图4显示了根据本发明一个实施例的实施例2的质谱图；
26.图5显示了根据本发明一个实施例的实施例3的色谱图；
27.图6显示了根据本发明一个实施例的实施例3的质谱图；
28.图7显示了根据本发明一个实施例的实施例4的色谱图；
29.图8显示了根据本发明一个实施例的实施例4的质谱图；
30.图9显示了根据本发明一个实施例的对照例1的色谱图；
31.图10显示了根据本发明一个实施例的对照例2的色谱图；
32.图11显示了根据本发明一个实施例的对照例3的色谱图。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
34.实施例1第一多肽的制备
35.第一多肽的序列如下：kegypmgrdgckiscvinnnfckvecqakwrqsdgy(seq id no：2)，其合成过程为：
36.(1)树脂溶胀
37.a)称取0.8mmol(1333mg)的氯树脂，称好后放入多肽合成管中；
38.b)向多肽合成管中加入5ml的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)和5ml的dcm(二氯甲烷)，室温放置30min；
39.c)用空气泵抽干溶剂；
40.d)用10ml dmf冲洗后抽干溶剂。
41.(2)肼树脂的制备
42.a)水合肼和dmf按照1:11的体积混合得到水合肼混合液；
43.b)向多肽合成管中加入12ml水合肼混合液，然后转移至33℃恒温摇床振荡30min；
44.c)抽干溶剂，用dmf冲洗树脂三次，重复步骤a)、b)一次；
45.d)完成上述步骤后抽干溶剂，用dmf冲洗树脂三次；
46.e)甲醇和dmf按照1:20的体积混合得到甲醇混合液，向多肽合成管中加入21ml甲醇混合液，然后转移至33℃恒温摇床振荡10min；
47.f)完成上述步骤后抽干溶剂，用dmf冲洗树脂三次。
48.(3)由肽段序列右侧(c端)第一个氨基酸开始向左侧(n端)合成
49.a)称取3.2mmol的fmoc-tyr(boc)-oh(酪氨酸)和3.04mmol的缩合剂(hctu)放入50ml的ep管中，向ep管中加入10ml dmf溶解，充分摇匀，再向ep管中加入6.4mmol的diea；
50.b)将上述混合溶液转移至多肽合成管中，再将多肽合成管转移至33℃恒温摇床中振荡45min后取出多肽合成管；
51.c)清洗：先用dmf冲洗树脂4次(每次20ml)，后抽干溶剂。
52.(4)脱保护
53.a)向多肽合成管中加入10ml的20％哌啶溶液(哌啶溶液的配制方法：用量筒量取100ml吡啶，加dmf至量筒刻度500ml)淹没树脂，转移至33℃恒温摇床振荡5min；
54.b)将多肽合成管从摇床中取出；
55.c)清洗：先用dmf冲洗树脂四次(每次20ml)，抽干溶剂；
56.d)向多肽合成管中加入10ml的20％哌啶溶液，在33℃恒温摇床内振荡10min取出多肽合成管；
57.e)重复上述脱保护中的清洗步骤c)。
58.(5)接第二个氨基酸
59.a)称取3.2mmol的fmoc-gly-oh和3.04mmol的hctu到10mlep管中，再向ep管中加入10ml dmf溶解，充分摇匀，再向ep管中加入6.4mmol的diea；
60.b)将上述混合液混合均匀后转移至多肽合成管中，将此多肽合成管转移至33℃恒温摇床振荡45min后取出多肽合成管；
61.c)清洗：重复上述脱保护中的清洗步骤c)；
62.(6)肽链延长：根据多肽序列，接下来所有天然氨基酸的偶联重复直至最后一个氨基酸
63.注意事项：最后一个氨基酸需要进行脱保护。
64.(7)片段大切：取出多肽合成管，用dmf冲洗树脂三次(每次10ml)，每次冲洗后都抽干溶剂，再用dcm冲洗树脂三次(每次10ml)，每次冲洗后都抽干溶剂(抽干至树脂为干粉状)。抽干后，在10ml的ep管中配制tfa/h2o/苯酚/tips(9ml/500μl/500mg/250μl)体积比例的切割试剂。将切割试剂转移至上述多肽合成管中，放入26℃恒温摇床中振荡反应2.5h，取出多肽合成管，管中溶液即为肽链裂解液。
65.(8)吹干冲洗
66.a)将10ml肽链裂解液用洗耳球转移到50mlep管中，室温下用氮气尽量吹干裂解液至5ml以下；
67.b)向50mlep管中加入40ml冰乙醚，适当震荡ep管后，将ep管放入离心机，转速为3500转，离心3min；离心完成后倒掉上清液；
68.c)重复；
69.d)室温下晾干，晾干后捣碎。
70.(9)粗肽色谱分析及分离：利用岛津的hplc和质谱对粗肽进行正确性分析，色谱图参见图1，质谱图参见图2。基于色谱和质谱结果，确定合成的物质为目标物。验证正确后，将正确产物分离并冻干。
71.实施例2第二多肽的制备
72.第二多肽的序列如下：cyfwglscyctnlpedaqvwdsstnkcg(seq id no：3)，其合成过程为：
73.(1)树脂溶胀
74.a)称取0.8mmol(2000mg)的王树脂，称好后放入多肽合成管中；
75.b)向多肽合成管中加入5ml的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)和5ml的dcm(二氯甲烷)，室温放置30min；
76.c)用空气泵抽干溶剂；
77.d)用10ml dmf冲洗后抽干溶剂。
78.(2)由肽段序列右侧(c端)第一个氨基酸开始向左侧(n端)合成
79.a)称取3.2mmol的fmoc-gly-oh(酪氨酸)和3.04mmol的缩合剂(hbtu、hobt)放入50ml的ep管中，向ep管中加入10ml dmf溶解，充分摇匀，再向ep管中加入6.4mmol的diea；
80.b)将上述混合溶液转移至多肽合成管中，再将多肽合成管转移至33℃恒温摇床中振荡过夜后取出多肽合成管；
81.c)清洗：先用dmf冲洗树脂4次(每次20ml)，后抽干溶剂；
82.d)配置10ml混合溶液，其中乙酸酐、diea、dmf的体积比为1:1:8；
83.e)向多肽合成管中加入配置好的混合溶液，然后转移至33℃恒温摇床振荡10min；
84.f)完成上述步骤后抽干溶剂，用dmf冲洗树脂三次。
85.(3)脱保护
86.a)向多肽合成管中加入10ml的20％哌啶溶液淹没树脂，转移至33℃恒温摇床振荡5min；
87.b)将多肽合成管从摇床中取出；
88.c)清洗：先用dmf冲洗树脂四次(每次20ml)，抽干溶剂；
89.d)向多肽合成管中加入10ml的20％哌啶溶液，在33℃恒温摇床内振荡10min取出多肽合成管；
90.e)重复上述脱保护中的清洗步骤c)。
91.(4)接第二个氨基酸
92.a)称取3.2mmol的fmoc-cys(trt)-oh和3.04mmol的hctu置于10mlep管中，再向ep管中加入10ml dmf溶解，充分摇匀，再向ep管中加入6.4mmol的diea；
93.b)将上述混合液混合均匀后转移至多肽合成管中，将此多肽合成管转移至33℃恒温摇床振荡45min后取出多肽合成管；
94.c)清洗：上述脱保护中的清洗步骤c)。
95.(5)肽链延长：根据多肽序列，接下来所有天然氨基酸的偶联重复直至最后一个氨基酸
96.注意事项：最后一个氨基酸需要进行脱保护。
97.(6)片段大切：取出多肽合成管，用dmf冲洗树脂三次(每次10ml)，每次冲洗后都抽干溶剂，再用dcm冲洗树脂三次(每次10ml)，每次冲洗后都抽干溶剂(抽干至树脂为干粉状)。抽干后，在10ml的ep管中配制tfa/h2o/苯酚/tips(9ml/500μl/500mg/250μl)体积比例的切割试剂。将切割试剂转移至上述多肽合成管中，放入26℃恒温摇床中振荡反应2.5h，取出多肽合成管，管中溶液即为肽链裂解液。
98.(7)吹干冲洗
99.a)将10ml肽链裂解液用洗耳球转移到50mlep管中，室温下用氮气尽量吹干裂解液至5ml以下；
100.b)向50mlep管中加入40ml冰乙醚，适当震荡ep管后，将ep管放入离心机，转速为3500转，离心3min；离心完成后倒掉上清液；
101.c)重复；
102.d)室温下晾干，晾干后捣碎。
103.(8)粗肽色谱分析及分离：利用岛津的hplc和质谱对粗肽进行正确性分析，色谱图参见图3，质谱图参见图4。基于色谱和质谱结果，确定合成的物质为目标物。验证正确后，将正确产物分离并冻干。
104.实施例3第三多肽的制备
105.采用自然化学连接方法将实施例1制备的第一多肽和实施例2制备的第二多肽进行连接，得到第三多肽kegypmgrdgckiscvinnnfckvecqakwrqsdgycyfwglscyctnlpedaqvwd
sstnkcg(seq id no：1)。过程如下：
106.取第一多肽(1eq)溶于6mol/l盐酸胍缓冲液(ph＝3)，使第一多肽的终浓度为8mm，置于冰盐浴(-15℃)，加入nano2(5eq)，搅拌20min。结束后加mpaa(50eq)搅拌1min，调ph值为5.5，然后加入第二多肽(1.1eq)，充分溶解后调ph值为6.7，缓慢搅拌过夜，第二天加tcep淬灭，ncl纯化，色谱图参见图5，质谱图参见图6。基于色谱和质谱结果，确定合成的物质为目标物。
107.实施例4蝎子毒素多肽的制备
108.将实施例3制备的第三多肽进行复性，过程如下：
109.在50ml离心管中加入9.42ml dmso/1.57ml乙酸/20.41ml水的复性试剂，摇匀后加入46mg第三多肽。室温过夜(12小时)反应，经hplc纯化(产率为52％)，色谱图参见图7，质谱图参见图8。基于色谱和质谱结果，确定合成的物质为目标物，即在第三多肽的cys11-cys63之间形成二硫键、cys15-cys37之间形成二硫键、cys22-cys44之间形成二硫键、cys26-cys46之间形成二硫键。
110.对照例1
111.本对照例采用以下方法对实施例3制备的第三多肽进行复性，过程如下：
112.在50ml离心管中加入12mg还原型gsh，2.4mg的氧化性gssh和40ml水，并调ph值为8.0，摇匀后加入第三多肽至终浓度为1mg/10ml。室温检测反应至反应平衡。经质谱鉴定，无产物(色谱图参见图9)。
113.对照例2
114.本对照例采用以下方法对实施例3制备的第三多肽进行复性，过程如下：
115.在10ml离心管中加入7mg醋酸铵，13mg的盐酸胍，4.2mg还原型gsh，0.84mg氧化性gssh，加入水0.274ml，调ph至7.8，摇匀后加入第三多肽至终浓度为0.3mmol/l，室温检测反应至反应平衡。经质谱鉴定，无产物(色谱图参见图10)。
116.对照例3
117.本对照例采用以下方法对实施例3制备的第三多肽进行复性，过程如下：
118.在50ml离心管中加入315.2mgtris，5.84mgedta，6ml甘油，6.15mg还原型gsh，12.25mg氧化性gssh加水定容至20ml，调ph至8，摇匀后加入第三多肽至终浓度为0.3mmol/l，4℃检测反应至反应平衡。经质谱鉴定，无产物(色谱图参见图11)。
119.由对照例1、2和3可以看出，采用其他复性方法，无法得到目标产物蝎子毒素多肽。
120.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
121.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。