本发明属于药物制剂技术领域，尤其涉及一种壳寡糖的制备方法及减肥片。
背景技术：
肥胖是一种因为机体能量摄入和消耗失去平衡导致体内脂肪过度积聚出现代谢紊乱的慢性营养性疾病。随着经济水平的提高和生活环境的改善，肥胖的发生率在全球范围内持续上升，肥胖症已经成为危害社会公众健康的重大难题。根据2020年who统计数据显示，自2000年以来，全球成人的年龄标化肥胖患病率增加了1.5倍，在2016年的统计中，全世界有超过三分之一的成年(18岁及以上)超重，肥胖人群占全球人口13％。十九世纪末，西方国家就开始使用减肥药物，但是随着时间的推移，很多长期使用的减肥药因为存在严重毒副作用等问题被撤市。
奥利司他(orlistat)是目前全世界唯一的otc减肥药。orlistat是一种强效和长效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，通过直接阻断人体对食物中脂肪的吸收，从而达到减重的目的，但是也存在排便频繁、腹痛、恶心、呕吐及油性呃逆等等不良反应。因此，急需寻求新型疗效显著、安全无毒的减肥药，才能更好地进行健康减肥。
壳寡糖是壳聚糖的降解产物，现已广泛应用于食品、生物医药和化妆品中。
壳寡糖生产常用的有物理降解法、化学降解法和生物酶解法。其中，物理降解法常用的是超声波降解法，通过超声波降解壳聚糖制备壳寡糖，反应过程温和，但是终产物中低分子量的水溶性产物收率低；化学降解法常用的是酸法水解制备壳寡糖，壳聚糖在酸性条件下会发生长链的部分水解，形成许多相对分子质量不等的片段，但是终产物中单糖含量高，三聚以上寡糖收率低；生物酶解法常用的是壳聚糖酶水解法，壳聚糖酶以内切作用方式专一性水解壳聚糖分子中的β-1，4糖苷键，反应条件温和，易于控制，产物分子量分布均匀，单糖含量非常低，而且无其它副产物，保证了产品安全性。
但是目前市场上的壳寡糖产品数均分子在2kda～3kda，不适合减肥壳寡糖的制备，开展壳寡糖(脱乙酰度≥90％，数均分子量≤1kda)的研究，对于开发首个天然糖类减肥新原料意义重大。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种数均分子量≤1kda的壳寡糖的制备方法及减肥片。
本发明提供了一种壳寡糖的制备方法，包括：
s1)将壳聚糖在酸性水溶液中溶胀，然后加入壳聚糖酶，加热进行酶解，得到酶解液；
s2)将所述酶解液经灭酶处理、澄清处理后，得到数均分子量≤1kda的液体壳寡糖。
优选的，所述壳聚糖的脱乙酰度≥90％；所述酸性水溶液中壳聚糖的质量浓度优选为2％～8％；所述酸性水溶液的ph值为4.5～5.5。
优选的，所述溶胀的温度为50℃～60℃；溶胀的时间为3～5h；所述酶解的温度为50℃～60℃；酶解的时间为3～5h；所述灭酶处理的温度为75℃～85℃；灭酶处理的时间为10～20min。
优选的，所述壳聚糖酶与壳聚糖的比例为(30～40)u：1g。
优选的，所述澄清处理为加入澄清剂后，过滤；所述澄清剂的质量为酸性水溶液质量的0.3％～0.8％；所述澄清剂为硅藻土。
优选的，还包括：
s3)将所述数均分子量≤1kda的液体壳寡糖减压浓缩后，喷雾干燥，得到数均分子量≤1kda的固体壳寡糖。
优选的，所述减压浓缩的温度为75℃～85℃；所述减压浓缩至干物质含量为15％～30％。
优选的，所述喷雾干燥的进风温度为180℃～220℃，出风温度为75℃～85℃。
本发明还提供了一种减肥片，包括上述制备方法制备的壳寡糖。
优选的，包括：
本发明提供了一种壳寡糖的制备方法，包括：s1)将壳聚糖在酸性水溶液中溶胀，然后加入壳聚糖酶，加热进行酶解，得到酶解液；s2)将所述酶解液经灭酶处理、澄清处理后，得到数均分子量≤1kda的液体壳寡糖。与现有技术相比，本发明采用生物酶解法制备数均分子量≤1kda的壳寡糖，酶解结束后进行了灭酶处理，没有引入别的物质，保证了产品的安全性，为制备天然类物质减肥产品提供了可靠原料。
进一步采用天然糖类物质壳寡糖(脱乙酰度≥90％、数均分子量≤1kda)制备减肥片，在不影响食欲、无腹泻的情况，具有增加脂质的排泄量、改善血脂紊乱、减少脂肪组织增生，达到减肥降脂的效果，是首个天然糖类减肥新原料。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种壳寡糖的制备方法，包括：s1)将壳聚糖在酸性水溶液中溶胀，然后加入壳聚糖酶，加热进行酶解，得到酶解液；s2)将所述酶解液经灭酶处理、澄清处理后，得到数均分子量≤1kda的液体壳寡糖。
数均分子量≤1kda的壳寡糖，是由3～6个氨基葡萄糖和n-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的低聚合物，水溶性好，人体肠道吸收率接近100％，对人体无毒副作用，具有独特的生理活性和功能。
本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。其中，优选所述壳聚糖的脱乙酰度≥90％。
将壳聚糖在酸性水溶液中溶胀；所述酸性水溶液的ph值优选为4.5～5.5；所述酸性水溶液的ph值优选采用乳酸调节；所述乳酸优选为食品级乳酸；所述酸性水溶液中壳聚糖的质量浓度浓度优选为2％～8％；在本发明提供的一些实施例中，所述酸性水溶液中壳聚糖的质量浓度优选为2％；在本发明提供的一些实施例中，所述酸性水溶液中壳聚糖的质量浓度优选为6％；在本发明提供的另一些实施例中，所述酸性水溶液壳聚糖的质量浓度优选为8％；所述溶胀的温度优选为50℃～60℃；所述溶胀的时间优选为3～5h。在本发明中，优选先将壳聚糖与水混合，得到壳聚糖溶液，然后加酸调节溶液的ph值，进行溶胀；所述水优选为纯化水。
溶胀后，加入壳聚糖酶，加热进行酶解，得到酶解液；所述壳聚糖酶与壳聚糖的比例优选为(30～40)u：1g；所述酶解的温度优选为50℃～60℃；所述酶解的时间优选为3～5h。
将所述酶解液进行灭酶处理；所述灭酶处理的温度优选为75℃～85℃；所述灭酶处理的时间优选为10～20。
灭酶处理后，优选冷却，然后进行澄清处理，得到数均分子量≤1kda的液体壳寡糖；所述澄清处理优选加入澄清剂后，过滤；所述澄清剂的质量优选为酸性水溶液(即壳聚糖与水)质量的0.3％～0.8％；所述澄清剂优选为硅藻土。
按照本发明，优选将所述数均分子量≤1kda的液体壳寡糖减压浓缩后，喷雾干燥，得到数均分子量≤1kda的固体壳寡糖；所述减压浓缩的温度优选为75℃～85℃；所述减压浓缩优选浓缩至干物质含量为15％～30％；所述喷雾干燥的进风温度优选为180℃～220℃，出风温度优选为75℃～85℃。
本发明采用生物酶解法制备数均分子量≤1kda的壳寡糖，酶解结束后进行了灭酶处理，没有引入别的物质，保证了产品的安全性，为制备天然类物质减肥产品提供了可靠原料。
本发明还提供了一种减肥片，包括上述方法制备的数均分子量≤1kda壳寡糖，更优选为脱乙酰度≥90％、数均分子量≤1kda的壳寡糖。
壳寡糖(脱乙酰度≥90％，数均分子量≤1kda)通过减少3t3-l1前脂肪细胞脂肪的形成、抑制其分化成熟，下调胃中载脂蛋白b水平抑制体内脂肪积累，降低脂细胞堆积，从而降低血清中总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的含量，改善血脂水平；同时，壳寡糖(脱乙酰度≥90％，数均分子量≤1kda)抑制胰脂肪酶活性，并与胆汁酸结合，减少肠道对脂肪的吸收，增加粪便中的脂肪排泄，从而达到减肥的效果。
按照本发明，优选地，所述减肥片包括：述方法制备的数均分子量≤1kda壳寡糖75～85重量份；异麦芽酮糖醇5～10重量份；硬脂酸镁0.2～0.5重量份；二氧化硅0.5～1.5重量份。
在本发明提供的一些实施例中，所述减肥片优选包括数均分子量≤1kda壳寡糖80重量份；异麦芽酮糖醇5重量份；硬脂酸镁0.5重量份；二氧化硅1重量份。
在本发明提供的一些实施例中，所述减肥片优选包括数均分子量≤1kda壳寡糖85重量份；异麦芽酮糖醇6重量份；硬脂酸镁0.2重量份；二氧化硅1.5重量份。
在本发明提供的另一些实施例中，所述减肥片优选包括数均分子量≤1kda壳寡糖75.7重量份；异麦芽酮糖醇10重量份；硬脂酸镁0.3重量份；二氧化硅0.5重量份。
本发明采用天然糖类物质壳寡糖(脱乙酰度≥90％、数均分子量≤1kda)制备减肥片，在不影响食欲、无腹泻的情况，具有增加脂质的排泄量、改善血脂紊乱、减少脂肪组织增生，达到减肥降脂的效果，是首个天然糖类减肥新原料。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种壳寡糖的制备方法及减肥片进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售；实施例中壳寡糖数均分子量的检测方法为乙酰丙酮法。
实施例1
一种数均分子量≤1kda的壳寡糖及减肥片剂的制备方法，其制备步骤如下：
(1)壳聚糖溶胀：
取脱乙酰度≥90％的壳聚糖5kg于150l反应釜中，加入95l纯化水配制成6％(w/w)的壳聚糖溶液，用乳酸调节溶液的ph为4.5，不断搅拌，于50℃水浴中溶胀5h。
(2)数均分子量≤1kda的液体壳寡糖制备：
加入壳聚糖酶1.65×105u，50℃搅拌反应3h，得到的酶解液78℃水浴保温10min灭酶，溶液冷却后，添加硅藻土0.4kg，搅拌均匀，过滤得数均分子量930da澄清液体壳寡糖。
(3)数均分子量≤1kda的固体壳寡糖制备：
将930da液体壳寡糖82℃减压浓缩至干物质含量30.0％，进风温度180℃～220℃、出风温度75℃～85℃喷雾干燥，得到4.85kg数均分子量930da的固体壳寡糖。
(4)减肥片剂的制备：
取粉状固体壳寡糖4kg、异麦芽酮糖醇250g、硬脂酸镁25g和二氧化硅50g混合均匀制备壳寡糖减肥片。
实施例2
一种数均分子量≤1kda的壳寡糖及减肥片剂的制备方法，其制备步骤如下：
(1)壳聚糖溶胀：
取脱乙酰度≥90％的壳聚糖50kg于5t反应釜中，加入2450l纯化水配制成2％(w/w)的壳聚糖溶液，用乳酸调节溶液的ph为5.5，不断搅拌，于57℃水浴中溶胀3h。
(2)数均分子量≤1kda的液体壳寡糖制备：
加入壳聚糖酶1.5×106u，57℃搅拌反应5h，得到的酶解液85℃水浴保温12min灭酶，溶液冷却后，添加硅藻土20kg，搅拌均匀，过滤得数均分子量890da澄清液体壳寡糖。
(3)数均分子量≤1kda的固体壳寡糖制备：
将890da的液体壳寡糖75℃减压浓缩至干物质含量15.0％，进风温度180℃～220℃、出风温度75℃～85℃喷雾干燥，得到47.32kg数均分子量890da的固体壳寡糖。
(4)减肥片剂的制备：
取粉状固体壳寡糖5kg、异麦芽酮糖醇353g、硬脂酸镁12g和二氧化硅88g混合均匀制备壳寡糖减肥片。
实施例3
一种数均分子量≤1kda的壳寡糖及减肥片剂的制备方法，其制备步骤如下：
(1)壳聚糖溶胀：
取脱乙酰度≥90％的壳聚糖100kg于5t反应釜中，加入1150l纯化水配制成8％(w/w)的壳聚糖溶液，用乳酸调节溶液的ph为5.0，不断搅拌，于60℃水浴中溶胀4h。
(2)数均分子量≤1kda的液体壳寡糖制备：
加入壳聚糖酶1.0×107u，60℃搅拌反应4.5h，得到的酶解液75℃水浴保温20min灭酶，溶液冷却后，添加硅藻土3.75kg，搅拌均匀，过滤得数均分子量913da澄清液体壳寡糖。
(3)数均分子量≤1kda的固体壳寡糖制备：
将913da液体壳寡糖85℃减压浓缩至干物质含量23.6％，进风温度180℃～220℃、出风温度75℃～85℃喷雾干燥，得到96.30kg数均分子量913da的固体壳寡糖。
(4)减肥片剂的制备：
取粉状固体壳寡糖5kg、异麦芽酮糖醇667g、硬脂酸镁20g和二氧化硅33g混合均匀制备壳寡糖减肥片。
对比例
本发明数均分子量≤1kda的壳寡糖的制备方法与专利cn101845471b、cn107988287a、cn107739418a、cn108913735b、cn109136307a、cn110699406a解制备壳寡糖的方法进行对比分析，分析结果见表1。
表1本发明数均分子量≤1kda的壳寡糖的制备方法与普通酶解制备壳寡糖方法对比
由表1可知，本发明数均分子量≤1kda的壳寡糖的制备方法与专利cn101845471b、cn107988287a、cn107739418a、cn108913735b、cn109136307a、cn110699406a解制备壳寡糖的方法进行对比可得，壳聚糖溶胀所选ph值为壳聚糖充分溶胀和壳聚糖酶解提供了最适环境，在所选酶解壳聚糖需酶种类情况下，选定最适酶量、温度、时间，本发明获得数均分子量≤1kda的壳寡糖，专利cn101845471b、cn107988287a、cn107739418a、cn108913735b、cn109136307a、cn110699406a获得全分子量的壳寡糖。
试验例
本发明实施例制备的壳寡糖减肥片剂对大鼠减肥功能的影响实验
受试样品：本发明实施例1、2、3制备的壳寡糖减肥片。
实验动物：70只spf级雄性sd大鼠，体重200～220g。
实验方法：
(1)建立高脂饲料诱导肥胖大鼠模型：将70只雄性sd大鼠于实验动物中心spf级环境下进行喂养，温度为22℃～26℃，相对湿度为55％～65％。用普通饲料适应性喂养15d后，随机分成两组，一组由10只sd大鼠组成的作为空白组给予普通饲料和正常饮用水喂养；另一组由60只sd大鼠给予高脂饲料及饮用去离子水，喂养15d后，剔除体重增加较慢的10只大鼠，剩下的50只sd大鼠继续喂养高脂饲料30d，高脂饲料喂养的sd大鼠体重超出普通饲料喂养的sd大鼠体重20％，即为造模成功。
(2)减肥实验：50只sd肥胖大鼠随机分为模型组、阳性对照组和实施例1组、实施例2组、实施例3组，每组10只动物，各组均继续饲以高脂饲料和去离子水(给予10ml/kgbw灌胃)，实施例1、2、3组去离子水中加入实施例1、2、3制备的粉碎壳寡糖减肥片125mg/kgbw(以壳寡糖计，相当于人体每日推荐量的5倍)，而阳性对照组去离子水中加入粉碎orlistat片30mg/kgbw(以orlistat计)，连续饲喂60d，记录大鼠每天的体重和摄食量，实验结束后，禁食大鼠12～16小时，10％水合氯醛麻醉，取睾周脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪称重，检测血清中tc、tg、hdl-c、ldl-c和粪便中tc、tg、tba含量。
实验结果：
(1)受试样品对肥胖大鼠体重的影响：由下表2可知，试验开始时空白对照组大鼠体重显著高于其余实验组，说明造模成功。试验结束时，空白对照组、阳性对照组和实施例1、2、3组大鼠的增重量均极显著低于模型组，表明阳性对照组和实施例1、2、3组均能极显著减缓sd肥胖大鼠的体重增重，达到减肥的效果，但是实验过程中阳性对照组少量大鼠出现腹泻，其余实验组无腹泻情况。
表2试验前后各组大鼠的体重变化
与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
(2)受试样品对肥胖大鼠摄食量的影响：由下表3可知，与模型组相比空白对照组、阳性对照组和实施例1、2、3组大鼠的每日平均摄食量均未出现显著性差异，表明实施例1、2、3组食欲没有受到抑制。
表3受试样品对肥胖大鼠摄食量的影响
与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
(3)受试样品对肥胖大鼠脂肪的影响：由下表4可知，与模型组相比空白对照组、阳性对照组和实施例1、2、3组大鼠的附睾脂肪、肾周脂肪、皮下脂肪重量极显著降低，脂体比显著降低，表明实施例1、2、3组均能显著降低大鼠体内脂肪的堆积。
表4受试样品对肥胖大鼠脂肪的影响
与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
(4)受试样品对肥胖大鼠血脂四项的影响：由下表5可知，与模型组相比空白对照组、阳性对照组和实施例1、2、3组大鼠的tc、tg、ldl-c显著降低，hdl-c显著升高，表明实施例1、2、3组能显著改善血清中tc、tg、hdl-c和ldl-c的水平，具有降脂的效果。
表5受试样品对肥胖大鼠血脂四项的影响(mmol/l)
与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
(5)受试样品对肥胖大鼠粪便脂质的影响：由下表6可知，与模型组相比阳性对照组和实施例1、2、3组大鼠粪便脂质(tc、tg、tba)显著升高，表明实施例1、2、3组能能够促进脂肪随排泄物一同排出，从而有利于改善肥胖的症状。
表6受试样品对肥胖大鼠粪便脂质的影响(mmol/l)
与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
由动物实验可得，实施例1、2、3壳寡糖片在不影响大鼠食欲、无腹泻的情况下，可明显抑制高脂饲料诱导的肥胖大鼠的体重增加以及脂肪组织增生，显著改善血脂紊乱，增加脂质的排泄量，从而达到减肥降脂的效果，与减肥药品orlistat效果相当，是一种绿色减肥食品。