一类用于光热治疗的近红外二区聚合物、纳米颗粒及其制备方法与应用

1.本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一类用于光热治疗的近红外二区聚合物、纳米颗粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.癌症是威胁人类健康及生命的重要疾病之一。据2018年世界卫生组织发表的《世界癌症报告》，2018年全球新增1810万例癌症病例(男性950万，女性860万)，死亡人数达960万(男性540万，女性420万)，全球癌症负担进一步加重。其中，中国作为人口大国更是占据了全球癌症发病与死亡的一大部分。因此，癌症成为我国必须自主攻克的重大疾病之一。光热治疗通过光热材料在光照作用下，对癌症部位进行有选择性的加热，导致癌细胞内部产生过高热量，从而杀死癌细胞，抑制肿瘤生长的目的。由于癌细胞的增值速度远快于正常组织，肿瘤组织内的血管发育不完全，血管壁有缺陷，对热量的耐受度低于正常细胞组织。当细胞内温度达到40℃时，细胞中的蛋白质开始变形，50℃会造成不可逆损伤。利用这一点，光热治疗能够在不影响正常细胞组织的条件下造成癌细胞损伤，破坏肿瘤组织。光热治疗具有微创，对正常细胞和组织影响小，副作用少的优点。近年来，癌症的光热治疗逐渐成为科研工作者的研究热点。
3.通过科研工作者的不断努力，目前的光热材料主要分为贵金属材料、碳基材料、过渡金属化合物纳米材料及有机光热材料。1)贵金属材料(如au、ag等)虽然光热转换效率高，但是在体内代谢差，成本高，并存在一定毒副作用的不足；2)碳基材料虽然无毒，光热转换效率高，但近红外波段吸收弱，也限制了其进一步的应用；3)过渡金属化合物二维材料在近红外区光热转化效率高，但制备复杂、尺寸较大，不易被细胞吸收、代谢较慢等也是其发展的瓶颈问题。4)有机光热材料近红外吸收强、生物相容性好、结构易于功能化、体内代谢时间短等优点。因此，相对其他类型的光热材料，有机光热材料为肿瘤光热治疗提供新的材料体系。
4.近红外二区窗口波长范围为1000
‑
1700纳米，它能有效减少组织光散射，穿透能力强，除了浅表皮的肿瘤治疗，深层肿瘤组织也能通过光热治疗实现肿瘤消融。目前大多数光热治疗位于波长为700
‑
900纳米的近红外一区窗口，常用的激光波长为808纳米，最大容许照射量为0.33w。相比近红外一区光热治疗，采用近红外二区光热治疗具有更明显的优势，最大容许照射量更大以及激光穿透能力更强，肿瘤治疗的适用范围更广。而目前有关近红外二区的光热试剂的报道较少。
5.文献报道聚合物p1(结构式见式(a)，来源期刊先进材料，第30卷，第35期，页码1802591)具有较好的近红外二区吸收响应，吸收光谱扩展到1200nm，但在1064nm激光作用下，p1聚合物的光热转换效率仅为30.1％，离高效光热试剂的应用仍有一定的距离，因此，高光热转换效率的近红外二区共轭聚合物的开发十分迫切。
6.

技术实现要素：

7.为了克服上述现有光热材料的缺陷，本发明的首要目的在于提供一类用于光热治疗的近红外二区聚合物，实现近红外二区的吸收，且具有较高的消光系数和光热转换效率，与两亲性三嵌段聚合物f127通过自组装方法形成纳米颗粒，在水溶液中具有优异的溶解性和生物相容性，是一类性能优异的光热试剂。该类聚合物与两亲性化合物通过自组装制备成纳米颗粒，具有优异的水溶性、光稳定性、生物相容性和光热转换性能，在癌症的光热治疗领域具有巨大的应用潜力。
8.本发明的另一目的在于提供上述近红外二区聚合物和纳米颗粒的制备方法。
9.本发明的再一目的在于提供上述近红外二区光热试剂的应用，所述近红外二区光热试剂在光热治疗中的应用。特别是近红外区作为光热治疗光热试剂的应用。本发明通过合理的结构设计，增强分子间相互作用，提高水溶性共轭聚合物的非辐射跃迁几率，进而提高其光热转换效率，在近红外光热治疗中具有较好的效果。所述癌症细胞为小鼠乳腺癌细胞(4t1)细胞。
10.本发明目的通过以下技术方案实现：
11.用于光热治疗的近红外二区聚合物，具有如下化学结构式：
[0012][0013][0014]
式中，r为碳原子数1
‑
20的直链或者支链烷基，r1为碳原子数1
‑
20的直链或者支链烷基，r2为氢、具有1～20个碳原子的直链、支化或者环状的烷基或烷氧基。
[0015]
其中聚合度n为2～300中任一整数。
[0016]
上述用于光热治疗的近红外二区聚合物的制备方法为：
[0017]
在惰性氛围，将聚合单体m1和m2溶解在有机溶剂中，然后加入催化剂四三苯基膦
钯，反应6
‑
12小时，停止反应后，将反应液纯化得到目标聚合物；
[0018]
其中，m1结构式为：m2结构式为：
[0019]
优选的，所述聚合单体m1和m2的摩尔比为1：1～2；进一步优选的，摩尔比为1：1。
[0020]
优选的，所述催化剂与聚合单体m1的摩尔比为1：0.01～0.05,进一步优选的，摩尔比为1：0.025。
[0021]
优选的，所述有机溶剂的用量与聚合单体m1的摩尔量之比为5～20：1；进一步优选的，摩尔比为12：1。
[0022]
优选的，所述惰性氛围为氮气或稀有气体气氛。
[0023]
优选的，所述反应温度为120～180℃；进一步优选的，反应温度为160℃。
[0024]
优选的，所述纯化为将反应液滴加在丙酮中沉析、过滤，再将粗产物溶于丙酮中，以200～300目硅胶为固定相，用丙酮为洗脱剂进行柱层析，溶剂浓缩，再次在丙酮中沉析出来，搅拌、过滤、真空干燥；最后再依次用甲醇、丙酮、正己烷抽提，再将固体溶于去离子水中，滴入丙酮中沉析，真空干燥。
[0025]
用于光热治疗的近红外二区聚合物纳米颗粒的制备方法为：
[0026]
将上述用于光热治疗的近红外二区聚合物和两亲性三嵌段化合物f127溶解在有机溶剂中，在超声条件下将其混合溶液加入超纯水溶液中，室温下超声完成制备。
[0027]
优选的，所述聚合物和f127的质量比1:5～20；进一步优选的，质量比1:10。
[0028]
优选的，所述超声时间为0.5～20min；进一步优选的，超声时间为10min。
[0029]
上述制备方法制备的用于光热治疗的近红外二区聚合物纳米颗粒。
[0030]
同时，本发明还提供了所述的近红外二区聚合物纳米颗粒作为光热试剂在光热治疗领域的应用。
[0031]
上述的用于光热治疗的近红外二区聚合物在抗肿瘤领域的应用，尤其针对人非小细胞肺癌(a549)细胞。
[0032]
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0033]
1、本发明所述的光热材料具有优异的近红外二区光谱响应能力，能采用近红外ⅱ区激光如1064nm作为光源进行深层组织光热治疗，穿透深度强，治疗效果更好，副作用少，具有临床应用前景。
[0034]
2、本发明所述的光热材料光热转换效率高，在有机溶剂中溶解性好，制备成水溶性纳米颗粒，能提供纳米颗粒的光热转化效率，并提高了其水溶性和生物安全性。对细胞具有优异的生物相容性，光照条件下能有效杀死细胞，尤其是人非小细胞肺癌(a549)细胞。
[0035]
3、本发明所述的光热材料，原料易得、合成条件温和，制备方法简单，提纯便捷。
附图说明
[0036]
图1为实施例1的近红外二区聚合物在四氢呋喃溶液的紫外可见吸收光谱图；
[0037]
图2为实施例1的非小细胞肺癌细胞(a549)细胞存活率柱状图；
[0038]
图3为实施例1的近红外二区聚合物光热试剂纳米颗粒水溶液在1064nm激光作用下的升降温曲线。
具体实施方式
[0039]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式和保护范围不限于此。
[0040]
实施例1
[0041]
近红外二区光热试剂p1的合成路线如下：
[0042]
在氩气氛围下，将聚合单体m1’(346mg，0.50mmol)，单体m2’(453mg，0.50mmol)加入50ml两口瓶内，再加入6ml精制1,2
‑
二氯苯，再加入四三苯基膦钯(2.80mg，12.45μmol)，升温至160℃，反应8小时，停止反应，待温度降至室温，将产物滴加在300ml丙酮中沉析，过滤，再将粗产物溶于20ml的丙酮中，以200～300目硅胶为固定相，用丙酮为洗脱剂进行柱层析，溶剂浓缩，再次在丙酮中沉析出来，搅拌，过滤，真空干燥后得到聚合物固体；最后再依次用甲醇、丙酮、正己烷各抽提24小时，除去小分子；再将固体溶于去离子水中，滴入丙酮中沉析，真空干燥后得水溶性聚合物p1。1h nmr、gpc和元素分析结果表明所得到的化合物为目标产物，制备过程化学反应方程式如下所示：
[0043][0044]
对得到的聚合物p1进行检测，gpc测试数均分子量mn为10600，重均分子量mw为155000，分子量分布指数pdi为1.46。
[0045]
聚合物p1在四氢呋喃溶液中的紫外可见吸收光谱由岛津公司紫外可见光分光光度计(uv
‑
2400)采集，紫外可见吸收光谱见图1。p1的紫外吸收最强吸收峰为343nm，最大峰为1170nm，吸收边为1600nm，能实现近红外二区的吸收响应。可推测知其具有较深的穿透深度。
[0046]
聚合物纳米颗粒的制备方法：
[0047]
将5.0mg聚合物p1和50mg的两亲性三嵌段聚合物f127溶解在2.0ml四氢呋喃溶剂中，在室温超声条件下，将溶解好的上述混合液快速加入10ml超纯水中，得到棕黑色混合溶剂液体。再将所得液体置于通风橱内，挥发多余四氢呋喃溶液，即可得到聚合物纳米颗粒，表观浓度为500ug/ml。
[0048]
聚合物纳米颗粒p1 nps的细胞毒性实验通过cck
‑
8法进行检测：
[0049]
1)将聚合物纳米颗粒p1 nps与完全培养基稀释至浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml。
[0050]
2)将处于对数生长期的人非小细胞肺癌细胞(a549)细胞用胰蛋白酶进行消化，并将细胞均匀稀释到浓度为5
×
104个细胞/ml。
[0051]
3)将细胞溶液加入96孔板中，每孔100μl，轻微摇晃均匀后，放入37℃、5％co2的培育箱中，培育24h。
[0052]
4)将含有不同浓度的聚合物纳米颗粒p1 nps的完全培养基加入96孔板中，每孔100μl，每个浓度均设置10个孔，每5孔为一组，共2组，即光照组和不光照组。其中设置0μg/ml为对照组。并将96孔板放入培育箱中孵育12h。
[0053]
5)取出光照组96孔板，用1064nm激光(功率0.5w/cm2)照射5.0min后，放入培育箱继续培育12h。不光照组96孔板无需接受光照处理。直接培养24h。
[0054]
6)洗除光照组和不光照组的96孔板中的培养基废液，每孔加入100μl含10％cck
‑
8的完全培养基，再放回培育箱培养1h。
[0055]
7)将光照组和不光照组96孔板放入酶标仪中，测试吸收峰为450nm，测定每孔的吸光度，将每组5个孔的吸光度求平均值及标准差，并计算细胞存活率。其cck
‑
8测试结果见图2.
[0056]
从图2中可知，不同浓度的聚合物纳米颗粒p1 nps在不进行光照的条件下，人非小细胞肺癌(a549)细胞存活率均可以维持80％以上。说明聚合物纳米颗粒p1 nps在不光照条件下没有细胞毒性，具有优异的生物相容性。而在光照条件下，细胞的存活率与聚合物纳米颗粒p1 nps的浓度有关，p1 nps浓度越大，细胞存活率越低。在20μg/ml浓度下，p1 nps可以杀死16％的人非小细胞肺癌(a549)细胞；在40μg/ml浓度下，p1 nps可以杀死28％的人非小细胞肺癌(a549)细胞；在60μg/ml浓度下，p1 nps可以杀死43％的人非小细胞肺癌(a549)细胞；在80μg/ml浓度下，p1 nps可以杀死60％的人非小细胞肺癌(a549)细胞；在100μg/ml浓度下，p1 nps可以杀死77％的人非小细胞肺癌(a549)细胞；说明聚合物纳米颗粒p1 nps对hela细胞具有优异的光热治疗效果。
[0057]
聚合物纳米颗粒p1 nps的光热性能测试采用1064nm的激光器。将浓度为100μg/ml的聚合物纳米颗粒p1 nps放置在波长为1064nm的激光光源下，功率1.0w/cm2，开始记录聚合物纳米颗粒p1 nps水溶液的温度，每30s记录一次。在照射8分钟后，移去光源，让其自然降温，且每30s记录一次。聚合物纳米颗粒p1 nps的升降温曲线如图3所示。
[0058]
从图3中可知，p1 nps在1064nm激光照射下，其温度不断上升，刚开始照射时升温速度较快，随后趋于平缓。聚合物纳米颗粒p1 nps水溶液在光照30s后温度升高为29.1℃，在光照60s后温度升高为34.8℃。光照450s后，温度最终上升到66.7℃。在移去光源后聚合物纳米颗粒p1 nps水溶液缓慢降温。移走光源30s后，温度降至60.2℃。根据降温曲线经计算得到聚合物纳米颗粒p1 nps的光热转换效率为59.7％。这说明聚合物具有优异的光热转换效率，能在光热治疗有优异的效果，是一类有应用前景的光热材料。
[0059]
实施例2
[0060]
近红外二区光热试剂p2的合成路线与聚合物p1类似，不同的是聚合单体由m2
‑1’
替换m2’，具体合成路线如下：
[0061][0062]
对得到的聚合物p2进行检测，gpc测试数均分子量mn为11300，重均分子量mw为16400，分子量分布指数pdi为1.45。
[0063]
按实施例1的方法制备聚合物纳米颗粒p2 nps；
[0064]
根据降温曲线经计算得到聚合物纳米颗粒p2 nps的光热转换效率为67.7％。这说明聚合物具有优异的光热转换效率，能在光热治疗有优异的效果，是一类有应用前景的光热材料。相比聚合物p1，光热转换效率的提高可得益于m2
‑1’
单体更长的烷基链，提高了聚合物的非辐射跃迁，将材料吸收的能量更多转换为热能。
[0065]
实施例3
[0066]
近红外二区光热试剂p3的合成路线与聚合物p1类似，不同的是聚合单体由m2
‑2’
替换m2’，具体合成路线如下：
[0067][0068]
对得到的聚合物p3进行检测，gpc测试数均分子量mn为9900，重均分子量mw为137000，分子量分布指数pdi为1.38。
[0069]
按实施例1的方法制备聚合物纳米颗粒p3 nps；
[0070]
根据降温曲线经计算得到聚合物纳米颗粒p3 nps的光热转换效率为69.7％。这说明聚合物具有优异的光热转换效率，是一类有应用前景的光热材料。
[0071]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。