检测TREX1基因突变的引物、试剂盒和方法与流程

检测trex1基因突变的引物、试剂盒和方法
技术领域
1.本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测trex1基因突变的试剂盒和检测方法。


背景技术：

2.aicardi
‑
goutieres综合征(ags)是一组罕见的以神经系统及皮肤受累为主的遗传性疾病，绝大多数患儿出生时各项指标均正常，疾病可能会在出生后的数天或1个月内发作，表现为癫痫发作、皮肤上冻疮样皮疹及无菌性发热的严重亚急性脑病，通常表现为喂养困难、易激惹、精神运动倒退或发展迟缓。部分患者新生儿期表现为肝脾大、血小板减少。症状要经过数月的发展才会稳定下来。尽管大多数患儿的症状在出生后1年内快速发展，但部分患儿也呈缓慢发展过程，主要症状包括张力障碍、运动障碍或认知发育迟缓。
3.该病多为常染色体隐性遗传，少数为常染色体显性遗传。文献研究表示，至今已发现7个致病基因，包括trex1(ags1)、rnaseh2b(ags2)、rnaseh2c(ags3)、rnaseh2a(ags4)、samhd1(ags5)、adar1(ags7)和ifih1(ags7)基因，这些基因发生基因突变分别会引起ags1
‑
7型对应疾病的发生。其中trex1突变会引起ags1的发生。
4.trex1基因位于3号染色体3p21.31，共2个外显子，第一外显子不编码氨基酸。该基因编码一个具有3'外切酶活性的核蛋白，包括位于核酸外切酶dnaq家族活性部位4个高度保守的酸性残基，这些残基在协调两个mg
2+
催化作用中有重要作用。在每个trex1蛋白中毗邻活性部位和二聚体的结构为ppii，其可能在和set复合体的相互作用中有重要角色。trexl蛋白有延伸的c
‑
羟基端跨膜结构域，其涉及到在细胞质内质网中trexl蛋白的亚细胞定位。最后在每一个活性部位附近有一个和dna结合的柔软环状结构。trex1基因的突变会导致ags综合征、红斑狼疮、cree脑炎和其他免疫系统疾病。可变剪接也会导致多个转录子变异。trexl基因突变时核蛋白表达减少、功能障碍甚至功能丧失，导致了dna双链降解中间体的堆积而激活自身免疫系统，从而引起自身免疫系统疾病。目前已报道的基因突变形式多样，包括碱基的置换、缺失、插入。已发现与ags相关的trex1基因突变多达32种。李慧娟的研究指出第一外显子c.460insa插入突变，使得第154
‑
156位氨基酸发生移码突变，第156位提前出现终止密码子tag，从而导致trexl蛋白的截短，截去了部分起催化作用的两个mg+配位结合区域和c
‑
羟基端的跨膜区结构域，影响了蛋白功能。lee
‑
kirsch等人的研究表明，大多数有狼疮表现的患儿trex1基因检测为杂合突变且位于c’羟基功能端，但该研究结果有待于进一步实验证实。郭洪伟等人的研究指出c.45g＞t、c.139g＞a和c.459_460insa单独携带时并不致病，三个突变同时由一个人携带时会引起疾病。
5.trex1突变分析对ags遗传咨询及产前诊断具有重要意义，ags的遗传方式为常染色体隐性遗传，trexl突变分析对于双亲为杂合突变的家庭有重要意义。且该病病人发病年龄较小，对该病的预防需要控制在产前阶段，父母(突变携带者)任何一方没有疾病症状，他们的每一个后代都有四分之一的可能得到两个有缺陷的基因，从而遗传ags。所以，先证者如致病基因明确，父母决定妊娠应及时进行相关遗传咨询，在妊娠早期阶段进行产前分子
诊断，最大限度减少异常胎儿的出生，提高新生儿人口素质。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种检测trex1基因突变的试剂盒，采用pcr技术，可用于快速检测患者体内trex1基因的突变情况。
7.检测trex1基因突变的引物，其特征在于，包括扩增trex1基因的引物，其碱基序列为：
8.trex1
‑
1f：tgtaaaacgacggccagt gggaacggatggtggtga
9.trex1
‑
1r：aacagctatgaccatg agggtgaggtggtttccttag
10.trex1
‑
2f1：tgtaaaacgacggccagt tcgcagacagggcaggattg
11.trex1
‑
2r1：aacagctatgaccatg cactggtgaggcccagcatag
12.trex1
‑
2f2：tgtaaaacgacggccagt ccaacctgctcctagccttcc
13.trex1
‑
2r2：aacagctatgaccatg gacaaacactgtgccctcctc。
14.进一步地，所述引物还包括检测trex1基因的测序引物，其碱基序列为：
15.m13f：tgtaaaacgacggccagt
16.m13r：aacagctatgaccatg。
17.本发明还提供了一种检测trex1基因突变情况的方法，包括以下步骤：
18.(1)抽提血液中的组织dna；
19.(2)对步骤(1)中提取的dna进行pcr扩增，获得扩增引物；其中pcr扩增引物的碱基序列为：
20.trex1
‑
1f：tgtaaaacgacggccagt gggaacggatggtggtga
21.trex1
‑
1r：aacagctatgaccatg agggtgaggtggtttccttag
22.trex1
‑
2f1：tgtaaaacgacggccagt tcgcagacagggcaggattg
23.trex1
‑
2r1：aacagctatgaccatg cactggtgaggcccagcatag
24.trex1
‑
2f2：tgtaaaacgacggccagt ccaacctgctcctagccttcc
25.trex1
‑
2r2：aacagctatgaccatg gacaaacactgtgccctcctc。
26.(3)利用一对测序引物对步骤(2)中的扩增产物进行测序，所述一对测序引物的碱基序列为：
27.m13f：tgtaaaacgacggccagt
28.m13r：aacagctatgaccatg；
29.(4)对测序结果进行判断，确定trex1基因是否发生突变。
30.本发明还提供了一种检测trex1基因突变位点的试剂盒，包括：
31.(i)血液dna抽提试剂；
32.(ii)检测体系pcr扩增反应液；包括扩增trex1基因的引物，其碱基序列为：
33.trex1
‑
1f：tgtaaaacgacggccagt gggaacggatggtggtga
34.trex1
‑
1r：aacagctatgaccatg agggtgaggtggtttccttag
35.trex1
‑
2f1：tgtaaaacgacggccagt tcgcagacagggcaggattg
36.trex1
‑
2r1：aacagctatgaccatg cactggtgaggcccagcatag
37.trex1
‑
2f2：tgtaaaacgacggccagt ccaacctgctcctagccttcc
38.trex1
‑
2r2：aacagctatgaccatg gacaaacactgtgccctcctc。
39.(iii)测序体系试剂；包括检测trex1基因的测序引物，其碱基序列为：
40.m13f：tgtaaaacgacggccagt
41.m13r：aacagctatgaccatg。
42.有益效果：本发明设计了扩增trex1全部2个外显子序列的引物。通过加接头，使3对引物的pcr产物均可以用一种测序引物进行测序。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。trex1基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述trex1全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量pcr法，本发明降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
43.图1为trex1基因在染色体上定位图。
44.图2、3、4分别为利用引物trex1
‑
1f\1r、trex1
‑
2f1\2r1、trex1
‑
2f2\2r2扩增后的扩增产物的电泳图，m为marker dl 2000，引物trex1
‑
1f\1r、trex1
‑
2f1\2r1、trex1
‑
2f2\2r2扩增有效，条带明亮。
45.图5显示是trex1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.
‑
68发生部分突变t＞tc。
46.图6显示是trex1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.
‑
60发生部分突变c＞ct。
47.图7显示是trex1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.266发生部分突变c＞ct。
48.图8显示是trex1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生部分突变t＞tc。
49.图9显示是trex1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生完全突变t＞c。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
51.实施例1
52.检测trex1基因突变位点的引物，该引物的设计是针对trex1全外显子设计的扩增引物，包括：
53.扩增trex1基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：
54.trex1
‑
1f：tgtaaaacgacggccagt gggaacggatggtggtga
55.trex1
‑
1r：aacagctatgaccatg agggtgaggtggtttccttag
56.trex1
‑
2f1：tgtaaaacgacggccagt tcgcagacagggcaggattg
57.trex1
‑
2r1：aacagctatgaccatg cactggtgaggcccagcatag
58.trex1
‑
2f2：tgtaaaacgacggccagt ccaacctgctcctagccttcc
59.trex1
‑
2r2：aacagctatgaccatg gacaaacactgtgccctcctc。
60.检测trex1基因突变的试剂盒，包括：
61.(i)血液dna抽提试剂；
62.(ii)检测体系pcr反应液；
63.(iii)测序体系试剂；
64.其中，组织dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。
65.检测体系pcr扩增反应液包括：2
×
pcr buffer；2mm dntps；kod fx dnapolymerase(1u/μl)；trex1基因2个外显子序列的上、下游引物引物trex1
‑
1f/1r、trex1
‑
2f1/2r1、trex1
‑
2f2/2r2引物浓度均为10μm。
66.测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测trex1基因全外显子序列的上、下游引物分别为m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)，以及bigdye terminator v3.1(购买自美国applied biosystems公司)。其中，图1是trex1基因在染色体上定位图。
67.实施例2
68.血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
69.(1)抽提血液中的组织dna：
70.1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀；
71.2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀；
72.3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
73.4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
74.5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
75.6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
76.7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
77.8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液；
78.9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
79.10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2
‑
5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
80.(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：
81.x＝19μl反应液
×
(n份标本+1份空白对照)
82.n为检测标本数。
83.(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μl dna；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
84.(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abi veriti(美国applied biosystems公司)等。反应条件如下：
[0085][0086]
pcr扩增体系试剂配制方法如下：
[0087][0088]
引物f/r选自trex1
‑
1f/1r、trex1
‑
2f1/2r1和trex1
‑
2f2/2r2。
[0089]
其中，引物相关信息如下所示，引物序列如实施例1所示：
[0090][0091]
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，25min，凝胶成像系统观察。
[0092]
(6)sanger测序：
[0093]
取9μl pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0094][0095]
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
[0096][0097]
反应程序：
[0098][0099]
沉淀环节：
[0100]
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl hi
‑
di后进行变性试验。
[0101]
变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。
[0102]
(7)结果判断：分别将测序结果与trex1野生型参考序列(genbank：ng_041782)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
[0103]
实施例3
[0104]
取24例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系pcr反应液中加入样本1μl。图2、3和4分别为血液样本以trex1
‑
1f/1r、trex1
‑
2f1/2r1、trex1
‑
2f2/2r2为引物扩增后所得扩增产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为337bp、587bp、768bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物trex1
‑
1f/1r、trex1
‑
2f1/2r1、trex1
‑
2f2/2r2扩增有效，且条带单一。
[0105]
24例样本的测序结果显示存在5个突变位点，各突变位点及数量如下表所示：
[0106][0107]
图5显示是trex1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.
‑
68发生部分突变t＞tc。
[0108]
图6显示是trex1 1号外显子突变型测序截图，说明样本的1号外显子c.
‑
60发生部分突变c＞ct。
[0109]
图7显示是trex1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.266发生部分突变c＞ct。
[0110]
图8显示是trex1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生部分突变t＞tc。
[0111]
图9显示是trex1 2号外显子突变型测序截图，说明样本的2号外显子c.531发生完全突变t＞c。
[0112]
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出trex1基因2个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出trex1基因全外显子，无论是野生型还是突变型。