RFC基因80GA突变位点的检测方法、试剂盒及其使用方法与流程

rfc基因80ga突变位点的检测方法、试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及基因突变位点检测技术领域，具体涉及一种rfc 基因80ga突变位点的检测方法、试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.基因组dna在某一特定的核苷酸序列上发生转换、颠倒、插入或缺失，并且在群体中出现频率≥1%，称为基因多态性。基因多态性可能与某些生理代谢功能，药物敏感性有关，分子水平的诊断可以给予患者疾病预防，个体化治疗，预后判断等指导。
3.目前，rfc多态性基因型分析大多采用sanger测序法，或pcr-pflp检测技术，由于pcr-pflp技术依赖于限制性核酸内切酶消化以及电泳分析，往往会产生一些结果的误判。sanger测序法则测序周期长，通量较低，需要昂贵的设备和复杂的操作，也不适用于大规模筛查或快速给出诊断结果，难以大规模推广。
4.人体内叶酸跨生物膜的运输主要通过三种方式介导：叶酸受体α（frα; folr1），质子偶联叶酸转运蛋白（pcft; slc46a1）和还原性叶酸载体（rfc; slc19a1）。其中rfc为还原型叶酸转运载体，负责5-甲基四氢叶酸的跨膜运输。rfc 80ga位点的多态性，除了被证明和儿童急性淋巴细胞白血病（all），甲氨蝶呤（mtx）疗效有关外，在多个研究中也被证实和叶酸的状态指标：血浆叶酸，红细胞叶酸和同型半胱氨酸，以及叶酸相关的疾病，如ntd具有有相关性。
5.rfc突变检测，有助于临床医生制定相应的心脑血管疾病预防，治疗方案。使得高风险人群能够通过一级预防措施降低患病风险，使心脑血管疾病患者得到更加具有针对性的治疗。目前，尚无该突变位点的商品试剂盒，该突变位点可用于心脑血管疾病诊断，高危人群的患病危险度评估，也可用于叶酸，维生素d等相关营养元素补充剂用法的指导。甚至可以将其与叶酸代谢途径中其他关键基因的snp位点联合诊断，再通过恰当的模型给患者一个更精准的治疗方案。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本技术提供一种rfc 基因80ga突变位点的检测方法，所述方法能够同时检测rfc基因80ga突变位点的野生型、纯合突变型和杂合型中的任意一种。依据rfc基因80ga突变位点设计pcr引物组合和特异检测荧光探针，对样本进行实时荧光定量pcr，进而鉴定rfc基因80ga突变位点的野生型、纯合突变型和杂合型中的任意一种。
7.pcr引物组合：正向引物rfc-f：5
’‑
ctgactccacccctcct-3’；反向引物rfc-r：5
’‑
ggcggccgcccggcaccc-3’；特异检测荧光探针：探针1：荧光基团5
’ꢀ‑
cggcacctcgtgtgctac-3’淬灭基团；探针2：荧光基团5
’ꢀ‑
cggcgcctcgtgtgctac-3’淬灭基团。
8.需要说明的是，引物起到对给pcr反应一个起点的作用，在pcr反应的退火步骤中引物以碱基互补配对原则结合到dna模板上，并通过taq酶从5’端向3’端进行碱基互补配对的延伸反应，使在变性步骤中氢键断裂变为单链的dna模板重新形成完整的双链结构，并由1个dna分子变为2个dna分子。
9.还需要说明的是，本发明中所述的引物是指由一定数量的dntp构成的寡核苷酸链，由dna合成仪进行人工合成得到，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，作为pcr反应的起点进行dna链的延伸反应。
10.还需要说明的是，探针1为a碱基突变检测探针，探针2为g碱基突变检测探针。这两条探针为人工合成的核苷酸链，在5’端分别标记了fam荧光信号和vic荧光信号，3’端标记了淬灭基团。pcr反应过程中，在taq酶的作用下合成链不断从5’端向3’端延伸，当延伸至探针在模板的结合位置处，taq酶的5
’→3’
外切酶活性将探针切断，降解。因此探针5’端的荧光基团与3’端淬灭基团在空间距离上远离，荧光信号得以释放，而后被仪器捕捉，则能将pcr反应转换为光信号。
11.优选地，本发明所提供的rfc基因80ga突变位点的检测方法的pcr引物组合，所述pcr引物组合5’端所使用的荧光基团为适用于荧光pcr定量分析的荧光报告集团，包括fam、vic,、tet、hex和rox中的一种或多种；所述pcr引物组合3’淬灭的基团为mgb。
12.另外，本发明还提供含有上述引物组合以及特异检测荧光探针的检测rfc基因80ga突变位点的试剂盒。
13.优选地，本发明提供的试剂盒所应用的pcr引物组合为：正向引物rfc-f：5
’‑
ctgactccacccctcct-3’；反向引物rfc-r：5
’‑
ggcggccgcccggcaccc-3’。
14.优选地，本发明提供的试剂盒所应用的特异检测荧光探针为：探针1：荧光基团5
’ꢀ‑
cggcacctcgtgtgctac-3’淬灭基团；探针2：荧光基团5
’ꢀ‑
cggcgcctcgtgtgctac-3’淬灭基团。
15.优选地，在本发明提供的试剂盒中，pcr引物组合5’端所使用的荧光基团为适用于荧光pcr定量分析的荧光报告集团，包括fam、vic、tet、hex和rox中的一种或多种；pcr引物组合3’淬灭的基团为mgb。
16.进一步地，本发明提供的试剂盒还包括pcr反应体系。
17.优选地，所述pcr反应体系包括：pcr缓冲液、dntps、taq dna聚合酶、mg
2+
、特异性扩增引物、去离子水中的一种或多种。
18.优选地，本发明进一步提供所述pcr引物组合、荧光探针及其试剂盒在检测rfc基因80ga突变位点中的应用，包括步骤：s1、提取样本中的dna；s2、以步骤s1中提取的dna作为模板，进行pcr扩增反应；s3、结果分析与判断。
19.优选地，所述pcr反应体系为：
优选地，pcr反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15s，60℃ 1min，50℃ 1min，共45个循环。
20.本发明的有益效果包括：本发明提供的rfc基因80ga突变位点的检测方法，首次设计出相应的pcr引物组合和特异检测荧光探针，并据此研制出相应的检测试剂盒，能够准确地鉴定出rfc基因在80ga碱基对处是否存在突变，从而将样本区分为野生型、纯合突变型和杂合突变型，进一步评估其叶酸代谢能力。
附图说明
21.图1为纯合突变型样本的扩增曲线；图2为野生型样本的扩增曲线；图3为杂合突变型样本扩增曲线；图4为探针荧光信号产生原理图。
具体实施方式
22.本发明公开了一种的rfc基因80ga突变位点的检测方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
23.对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
24.本发明提供的rfc基因80ga突变位点的检测试剂盒中所用材料或试剂均可由市场购得。
25.实施例一本实施例说明的rfc基因80ga突变位点的检测方法中所应用的pcr引物组合和特异检测荧光探针的设计过程。
26.具体方法包括：
一、获取rfc基因的全长参考序列，rfc基因全长60624bp，其中rfc基因80ga突变位点的位置位于25261位碱基。
27.二、从rfc的全基因序列上截取该突变位点上下游各500bp长度的片段，作为引物探针设计区域。
28.三、在引物探针设计区域遵循以下设计原则首先寻找探针：
①
tm值通常为65℃~72℃；
②5’
端不能是g碱基，因为即使探针被酶切后，5’端的g碱基仍具有淬灭报告荧光的作用；
③
避免单一核苷酸成串；
④
探针退火时尽量靠近引物，同时又不能重叠，离引物3’端至少有1个碱基；
⑤
检测的突变位点应当位于探针中间，不能位于末端。根据上述设计原则，本发明优选出两个探针序列：探针1：荧光基团5
’‑ꢀ
cggcacctcgtgtgctac
ꢀ‑3’
淬灭基团，探针2：荧光基团5
’‑ꢀ
cggcgcctcgtgtgctac
ꢀ‑3’
淬灭基团。
29.需要说明的是，其中带下划线碱基为rfc 基因80ga突变位点的检测位点，探针１和探针2为人工合成的核苷酸链，在5’端分别标记了fam荧光信号和vic荧光信号，3’端标记了小沟结合物mgb用于淬灭荧光信号。pcr反应过程中，在taq酶的作用下合成链不断从5’端向3’端延伸，当延伸至探针在模板的结合位置处，taq酶的5
’→3’
外切酶活性将探针切断，降解。因此探针5’端的荧光基团与3’端淬灭基团在空间距离上远离，荧光信号得以释放，而后被仪器捕捉，则能将pcr反应转换为光信号。
30.确定好探针序列后，进行pcr引物组合的设计，pcr引物组合设计原则如下：
①
一般引物长度为15~25bp；
②
g/c含量为20%~80%；
③
引物的tm值一般小于探针tm值5~10℃；；
④
一对引物的tm值一般不宜相差较大；
⑤
pcr片段不宜过长，一般在70~500bp左右；
⑥
尽量避免过多的二级结构。
31.需要说明的是，引物设计原则为一般经验，最终效果以试剂盒性能评估结果为准。
32.根据以上pcr引物组合的设计原则，本发明从从引物探针设计区域中找到了若干对较为符合设计原则的引物，并通过abi公司出版的primer express对引物序列进行了验证。通过将不同引物对与上文中的探针进行配比，然后进行性能测试，优选出的pcr引物组合的序列为：正向引物rfc-f：5
’‑
ctgactccacccctcct-3’，反向引物rfc-r：5
’‑
ggcggccgcccggcaccc-3’，引物对起到给pcr反应一个起点的作用，在pcr反应的退火步骤中引物以碱基互补配对原则结合到dna模板上，并通过taq酶从5’端向3’端进行碱基互补配对的延伸反应，使在变性步骤中氢键断裂变为单链的dna模板重新形成完整的双链结构，并由1个dna分子变为2个dna分子。
33.本发明中所述的引物是指由一定数量的dntp构成的寡核苷酸链，由dna合成仪进
行人工合成得到，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，作为pcr反应的起点进行dna链的延伸反应。
34.还需要说明的是，在本发明提供的rfc基因80ga突变位点的检测试剂盒的使用方法，pcr扩增反应的过程为：50℃ 2min，95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1 min，50℃ 1min，共45个循环。
35.实施例二本实施例提供一种检测样本中rfc基因80ga突变位点的检测方法，包括如下步骤：a、提取dna:使用泰乐德医疗生产的核酸提取试剂，提取血液样本dna，或口腔拭子样本dna，具体操作见说明书。-20℃保存备用。
36.b、pcr反应：以dna溶液作为模板，用试剂盒的pcr反应体系进行pcr反应，扩增得到pcr产物；其中，pcr引物组合包括pcr引物组合rfc-f/rfc-r一对引物，分别具有如下序列：正向引物rfc-f：5
’‑
ctgactccacccctcct-3’，反向引物rfc-r：5
’‑
ggcggccgcccggcaccc-3’，pcr引物组合rfc-f/rfc-r根据rfc的dna序列设计，pcr引物组合rfc-f/rfc-r能对人基因组的dna进行pcr扩增；pcr反应体系包括为：0.25 mmol/l 10
ꢀ×
buffer 正向引物（rfc-f）和反向引物（rfc-r）各0.2μmol/l、1 u taq 酶、模板dna 10～20 ng,总体积25μl。
37.qpcr 扩增在abi 7500 pcr 仪(美国thermofisher公司) 上进行,扩增条件为: 50℃ 2min；95℃ 2min, 95℃ 15s, 60℃ 1min，50℃ 1min,共45个循环。
38.c、pcr结果判定：阳性对照：阳性对照fam和vic信号通道所有的扩增曲线均有典型的pcr扩增曲线，且ct值均≤30；阴性对照：阴性对照fam和vic信号通道均无典型的pcr扩增曲线，且ct值均≥40或均阴性。
39.d、多态性结果判定：1）若检测结果中有fam信号通道的典型pcr扩增曲线，且ct值≤35，而vic信号通道无典型pcr扩增曲线，则认为检测样本的rfc基因80ga突变位点为gg型纯合突变。
40.2）若检测结果中有vic信号通道的典型pcr扩增曲线，且ct值≤35，而fam信号通道无典型pcr扩增曲线，则认为检测样本的rfc基因80ga突变位点为aa型野生型。
41.3）若检测结果中有vic信号通道的典型pcr扩增曲线，且ct值≤35，有明显的vic扩增曲线和明显的指数增长期，且ct值≤35，则认为检测样本的rfc基因80ga突变位点为ga型杂合型。
42.实施例三本实施例提供一种对于不同类型样本的扩增曲线的分析方法。
43.图中扩增曲线1代表在rfc基因80ga突变位点的等位基因上检测到一个鸟嘌呤碱基（g碱基），扩增曲线2代表在rfc基因80ga突变位点的等位基因上检测到一个腺嘌呤碱基（a碱基）。如果扩增曲线1和扩增曲线2几乎平行于x轴，没有典型的扩增曲线线型，则认为这条曲线是非特异性扩增的噪音，也就是没有检测到在该位点上有对应的碱基。
44.对于所检测的样本是野生型、纯合突变型还是杂合型的判断方法为：
纯合突变型：若对样本进行检测后，在rfc基因80ga突变位点的两个等位基因上都有检测到g碱基，则该样本对应为纯合突变型，对应的基因rfc的功能最差，叶酸代谢的相关疾病发生概率最高。
45.野生型：若对样本进行检测后，在rfc基因80ga突变位点的两个等位基因上都有检测到a碱基，则该样本对应为野生型，对应的基因rfc的功能最好，叶酸代谢的相关疾病发生概率最低。
46.杂合突变型：对样本进行检测后，在rfc基因80ga突变位点的一个等位基因上检测到a碱基，另一个等位基因上有检测到g碱基，则该样本对应为野生型，对应的基因rfc的功能一般，叶酸代谢的相关疾病发生概率中等。